一种快速检测肾衰的三联试剂盒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体设及一种用于肾脏衰竭的早期预警、治疗过 程和愈后监控的=联试剂盒，并进一步公开了其制备方法和应用。
【背景技术】
[000引急性肾损伤（AKI)是急性肾衰竭的连续性过程，AKI广泛发生于糖尿病人、交通事 故伤害、重症患者、大手术后患者，它按FIFLE标准分为风险、损伤、衰竭、肾功能丧失和终 末期肾病。急性肾损伤尽早诊断有助于对病人实施保护性治疗，降低死亡率。
[0003] 现有技术中，临床急性肾损伤诊断的生物标志物是肌酢、尿素氮和尿量。肌酢是 骨骼肌中肌酸到磯酸肌酸，并在肝脏中转化形成，并从肾小球滤过，其中少部分肌酢分泌入 尿，肌酢不能在肾小管重吸收或在肾脏代谢。血清肌酢作为急性肾损伤的标志物的局限性 主要体现在；第一，肌酢产生因年龄、性别、饮食、肌肉情况、药物及激烈运动差异明显，影响 了其诊断的准确性；第二，肌酢分泌约占肌酢清除的10-40%，该将导致GFR的假性降低； 第S，血清肌酢试验精确性可因假象而降低；第四，肌酢出现异常时，GFR减少大都已超过 50%，并且需超过24小时才能检测到血肌酢浓度。该些因素都会导致W肌酢作为急性肾损 伤的早期诊断标志存在严重的局限性。
[0004] 尿素氮是水溶性的、低分子量的蛋白质代谢产物。它的血浓度与GFR相反，部分因 素可影响它的产生和清除，该就限制了它评估GFR的可靠性。尿素氮的产生是多变的，它的 值可因循环血量、蛋白质摄入、胃肠道出血等的变化而改变。肾脏尿素氮清除率也是变化 的；40-50%滤过的尿素氮在肾小管重吸收。所从尿素氮是不太适合评估GFR的，因为浓度 升高需时间累积，不能及时反映GFR变化而耽搁诊断。
[0005] 更重要的是，由于很多AKI病人并没有出现少尿，或者很多手术及ICU病人仅出现 了少尿，但并没有出现急性肾损伤。因此，该些依赖传统的生物标志物（肌酢，尿素氮，尿 量）来诊断AKI，多在损伤后几小时才出现异常（肌酢，尿素氮），同时也缺乏特异性（尿 量），该些均会造成治疗上耽搁，该也是临床AKI治疗效果不佳的重要原因之一。
[0006] 鉴于现有临床上面临的该些问题，新的早期急性肾损伤的生物标志物已被逐步 开发出来。包括人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL)，半脱氨酸蛋白酶抑制剂 C(切C)，C反应蛋白（CRP)，均已在AKI的诊断中发挥重要作用。
[0007] 中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（NGAL)是一种小分子量分泌型蛋白，由 Kjeldse化等人于1993年发现，是Lipocalin家族的新成员。生理条件下，NCAL少量合成 于骨髓中性粒细胞和肾小管等多个系统的上皮细胞，炎症反应和恶性肿瘤可诱使其在多组 织（如子宫、前列腺、唾液腺、肺、肾、气道及消化道上皮等）中大量生成，几个小时内就可W 达到峰值，产生速度明显快于其它相关生物标记物。NGAL在急性肾小管损伤早期就已经表 达，反映肾小管功能素乱，它浓度的升高提示肾小管损伤发生，而传统指标血肌酢升高则需 24小时W上。NGAL也是目前新型AKI诊断的首选指标物。
[000引脱抑素C也称半脱氨酸蛋白酶抑制剂C，切sC分子量为13KD，由120个氨基酸组 成，它编码的基因是存在于机体所有有核细胞中的一种管家基因，因此人体几乎所有的有 核细胞均可W产生切sC，且产生率恒定。生理条件下，切sC抑制内源性半脱氨酸蛋白酶的 活性，切sC是一种低分子量蛋白质，能经肾小球滤过而被清除，在肾小球近曲小管重吸收并 被完全分解代谢，且肾脏是唯一清除切sC的器官，机体产生切sC的速率也相当恒定。研究 证明，切sC是一种比较接近理想的反映肾小球滤过功能的内源性标志物。当肾小球出现轻 微损伤时，切sC在血液中的浓度会迅速升高。切sC能灵敏的检测到肾小球滤过功能的改 变，对肾功能早期损坏进行诊断。
[0009] C反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP)是由肝细胞所合成，具有激活补体和促进 粒细胞及吞瞻细胞的吞瞻作用。CRP是第一个被认为是急性时相反应蛋白，正常情况下含量 极微量，在AKI、急性创伤和感染时其血浓度急剧升高。CRP浓度升高可反映体内炎症处于 急性活动期，如急性炎症、组织损伤和AKI等疾病，说明有进行性组织坏死或并发感染的存 在，CRP是临床上AKI最常用的急性时相反应指标。
[0010] 现有技术中已经开发出了诸如WNGAL、切sC或者CRP为单一指标的胶体金试纸条 或免疫巧光试纸条，意在通过检测NGAL、切sC或者CRP的指标变化对肾衰的发生、发展进行 监测。但是临床实践证明，上述单一指标的检测试剂，由于临床各种难于预测的情况而存在 着准确性欠佳的问题，依然难于保证肾衰的快速及准确的检测，不能全面地、特异性地预警 急性肾衰的发生、发展过程。而且目前WNGAL、切sC、CRP为目标物产品均W不同形式在临 床上应用，制作原理及操作程序各不相同，兼容性比较差，很难在短时间内同时、快速地检 测出=者的结果，极大地影响了对急性肾衰患者的准确诊断，从而造成很多病人因延误救 治而病情恶化或导致死亡。
[0011] 因此，目前临床上急需开发一种可全面、快速、简便的诊断、监测肾衰的发生、发展 的试剂，可随时监控发生肾衰的风险，避免因病情的延误而发生严重的后果。
【发明内容】
[0012] 为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中用于检测肾衰竭的试剂由于检 测指标单一而导致检测结果不稳定的问题，进而提供一种可全面、快速、简便的诊断、监测 肾衰的发生、发展的试剂盒，并进一步公开其制备方法及应用。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明所述的快速检测肾衰的S联试剂卡，所述试剂卡W 血清半脱氨酸蛋白酶抑制剂（切sC)、中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（NAGL)及C反 应蛋白（CR巧为检测标志物。
[0014] 进一步的，所述试剂卡包括样品区、抗体结合区，检测控制区及吸水区；所述抗体 结合区含有切sC、NGAL、CRP的特异性抗体，所述检测控制区含有分别与切sC、NGAL、CRP相 对应的单克隆抗体、多克隆抗体，或相应的抗原。
[0015] 更优的，所述试剂卡包括：
[0016] 底板W及沿所述底板的长度方向上依次粘附在所述底板上的样品垫、结合垫、抗 体承载膜和吸样垫，且所述样品垫、结合垫、抗体承载膜和吸样垫之间，依次与且仅与相邻 部位相接触且部分重叠；
[0017] 所述抗体承载膜粘附于所述底板的中间部位，其上顺次设置有第一检测线、第二 检测线、第=检测线和质控线，所述第一检测线靠近所述结合垫，所述质控线靠近所述吸样 垫；
[001引所述结合垫上喷涂有切sC、NGAL、CRPS种特异性抗体；
[0019] 所述第一检测线、第二检测线、第S检测线分别彼此独立的由与切sC、NGAL、CRP 相对应的单克隆抗体、多克隆抗体或相应的抗原涂层形成，且彼此不同。
[0020] 所述第一检测线、第二检测线及第=检测线相间隔平行设置，或者彼此不重叠的 并列设置。
[0021] 所述质控线由抗鼠IgG抗体涂层形成。
[0022] 制备所述结合垫的载体包括胶体金纳米颗粒、巧光胶乳、磁珠、量子点或稀±元 素。
[0023] 所述结合垫为胶体金垫，由标记有切sC、NAGL、CRP抗体的胶体金纳米颗粒喷涂于 玻璃纤维素膜或无纺布上制成；或者，
[0024] 所述结合垫为免疫巧光垫，由免疫巧光物质标记的乳胶微球喷涂于玻璃纤维素膜 或无纺布上制成。
[0025] 所述结合垫上，所述切sC、NGAL、CRPS种特异性抗体分别与不同颜色的量子点相 结合。
[0026] 本发明还公开了一种制备上述快速检测肾衰的=联试剂卡的方法，包括如下步 骤：
[0027] (1)结合垫的制备；按照现有技术常规方法将标记有切sC、NAGL、CRP特异性抗体 的载体颗粒喷涂于玻璃纤维素膜或无纺布上，烘干备用；
[002引 似抗体承载膜的制备；将与切sC、NGAL、CRP相对应的单克隆抗体、多克隆抗体或 相应的抗原稀释，划线喷涂于抗体承载膜，形成所述第一检测线、第二检测线、第=检测线， 并将抗鼠IgG抗体稀释并划线喷涂形成所述质控线，烘干备用；
[0029] (3)组装；在底板上顺次粘结样品垫、结合垫、抗体承载膜和吸样垫，各部分依次 与且仅与相邻