至其敏感度得以优化。这通过改变所述温度依赖性还原剂的浓度和/或反应温度实现。
[0137]起始浓度为发现满足上述测试方案条件的浓度。如上所述，显色室中的起始温度可根据所用温度依赖性还原剂变化，但优选为125-135?。
[0138]对此处所示的色谱法实施例而言，将不同试剂组合物的相对敏感度根据甘氨酸的峰高(单位为mAU)进行对比。因此，对于所有分析而言，停留时间和峰宽(即半高峰宽)的色谱条件是恒定的(参见下文的色谱条件)。
[0139]使用下述仪器条件:
[0140]色谱模式:恒溶剂
[0141]柱流量:0.45ml/分钟
[0142]茚三酮试剂流量:0.30ml/分钟
[0143]加热反应室温度:可在125_135°C之间变化
[0144]反应时间:60秒
[0145]注入体积:20 μ I
[0146]注入的甘氨酸量:2nmol
[0147]停留时间:5.0分钟
[0148]半高峰宽:0.26分钟
[0149]敏感度标度:mAU(lmAU相当于0.001吸光度)
[0150]实施例3.1—果糖
[0151]在上述条件下使用标准氨基酸分析仪评价包含0.20% w/v果糖作为温度依赖性还原剂的茚三酮试剂的敏感度。
[0152]在存在40%乙二醇下，在131°C反应温度下识别的峰高为112mAU。
[0153]在不存在乙二醇下，包含0.20% w/v果糖的茚三酮试剂在132°C反应温度下提供了 88mAU的峰高。
[0154]实施例3.2—甲酸钠
[0155]在上述条件下使用标准氨基酸分析仪评价包含I % w/v甲酸钠作为温度依赖性还原剂的茚三酮试剂的敏感度。
[0156]在存在40 %乙二醇下，包含I % w/v甲酸钠的茚三酮试剂在133°C反应温度下提供了 126mAU的峰高。
[0157]在不存在乙二醇下，包含I % w/v甲酸钠的茚三酮试剂在133°C反应温度下提供了107mAU的峰高。
[0158]实施例3.3—葡萄糖
[0159]在上述条件下使用标准氨基酸分析仪评价包含2% w/v葡萄糖作为温度依赖性还原剂的茚三酮试剂的敏感度。
[0160]在存在40%乙二醇下，包含2% w/v葡萄糖的茚三酮试剂在131 °C反应温度下提供了 97mAU的峰高。
[0161]在不存在乙二醇下，包含2% w/v葡萄糖的茚三酮试剂在133°C反应温度下提供了79mAU的峰高。
[0162]上述结果表明，活性从葡萄糖到甲酸钠到果糖具有很大的提高，如对葡萄糖和果糖获得类似敏感度所需的百分比浓度所示(分别从2% w/v变化至0.2% w/v)。因此，预期获得期望敏感度所需的百分比浓度根据用于形成温度依赖性还原剂的化合物变化。在用于标准氨基酸分析仪上时，诸如温度依赖性还原剂的百分比浓度、有机溶剂的百分比浓度(如果有的话)和反应室温度的因素的优化确定了对于所有通过方案I和2的化合物的最佳百分比浓度。
[0163]此外，所述结果表明，在不存在有机溶剂下，温度依赖性还原剂的敏感度降低。然而，可看出该活性降低不显著影响分析方法的敏感度。
【主权项】
1.一种用于分析含氮化合物的方法中的茚三酮试剂，所述茚三酮试剂包含: 茚三酮； 含水缓冲剂；和 温度依赖性还原剂，所述还原剂在第一温度下在茚三酮还原中不具有活性，而在第二温度下在茚三酮还原成还原茚三酮中具有活性，其中第二温度高于第一温度。2.根据权利要求1的茚三酮试剂，其中所述试剂基本上不含还原茚三酮。3.根据权利要求1或2的茚三酮试剂，其中第二温度为至少100°C。4.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂为满足实施例I方案I的在第二温度下的还原活性标准的化合物。5.根据权利要求4的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂为满足方案I的在第二温度下的还原活性标准的化合物，由此观察到0.4的最低吸光度。6.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中第一温度为0-30°C。7.根据权利要求6的茚三酮试剂，其中第一温度为5-25°C。8.根据权利要求7的茚三酮试剂，其中第一温度为10-20°C。9.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂为满足实施例2方案2的在第一温度下的还原活性标准的化合物。10.根据权利要求9的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂为在3个月后活性为其初始活性的至少50%的化合物。11.根据权利要求10的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂为在6个月后活性为其初始活性的至少50%的化合物。12.根据权利要求11的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂为在12个月后活性为其初始活性的至少50%的化合物。13.根据权利要求12的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂为在24个月后活性为其初始活性的至少50%的化合物。14.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种糖。15.根据权利要求14的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种单糖。16.根据权利要求15的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括葡萄糖、果糖、甘油醛、半乳糖、核糖、木糖、赤藓糖、苏糖、来苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖和L-甘油基-D-甘露庚糖、二羟基丙酮、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、景天庚酮糖(Sedoheptalose)或它们的混合物。17.根据权利要求14-16中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种二糖。18.根据权利要求17的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括乳糖、麦芽糖、海藻糖(Trihalose)、纤维素二糖、曲二糖、黑曲霉二糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、土冉糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、车前二塘、芸香糖、木二糖或它们的混合物。19.根据权利要求14-18中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种较长链的多糖。20.根据权利要求19的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括水苏糖、糊精、麦芽糖糊精或它们的混合物。21.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种羧酸和/或其盐。22.根据权利要求21的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括羧酸的第I族或第II族金属的盐。23.根据权利要求21或22的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种单官能羧酸或其盐。24.根据权利要求23的茚三酮试剂，其中所述羧酸为甲酸或其盐。25.根据权利要求21-24中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种包含至少一个额外还原性基团的羧酸。26.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种具有一个或多个醛基和/或酮基的化合物。27.根据权利要求26的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括丙酮。28.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括一种或多种无机化合物。29.根据权利要求28的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括低氧化态的无机硫化合物和/或低氧化态磷含氧酸。30.根据权利要求29的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂包括亚硫酸盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐和/或次磷酸盐。31.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂的浓度为0.01-75% w/v 或 v/vo32.根据权利要求31的茚三酮试剂，其中所述温度依赖性还原剂的浓度为0.01-20%w/v 或 v/v033.根据权利要求32的茚三酮试剂，其中所述茚三酮试剂中的茚三酮浓度为0.5-3%w/v 或 v/v034.根据权利要求33的茚三酮试剂，其中所述茚三酮试剂中的茚三酮浓度为1-2.5%w/v 或 v/v035.根据权利要求34的茚三酮试剂，其中所述茚三酮试剂中的茚三酮浓度为约2%w/V 或 v/v036.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂为含水缓冲剂。37.根据权利要求36的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂包含弱酸及其一种共轭碱/盐。38.根据权利要求37的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂包含有机酸。39.根据权利要求38的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂包含乙酸(aceticacid)、乙酸(ethanoic acid)或丙酸。40.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂保持3-7的pH值。41.根据权利要求40的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂保持4-6的pH值。42.根据权利要求41的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂保持4.5-5.5的pH值。43.根据权利要求42的茚三酮试剂，其中所述缓冲剂保持约5.2的pH值。44.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂，进一步包含一种或多种有机溶剂。45.根据权利要求44的茚三酮试剂，其中所述有机溶剂选自二甲亚砜、乙二醇、丙二醇、环丁砜、卡必醇、丙二醇单甲醚、甲基溶纤剂和甲醇。46.根据权利要求44或45的茚三酮试剂，其中有机溶剂的浓度为10-75%v/v?47.根据权利要求46的茚三酮试剂，其中有机溶剂的浓度为25-65%v/v?48.根据权利要求47的茚三酮试剂，其中有机溶剂的浓度为35-55%v/v?49.根据前述权利要求中任一项的茚三酮试剂在分析含氮化合物的方法中的用途。50.根据权利要求48的用途，其中所述含氮化合物为氨基酸。51.一种分析含氮化合物的方法，所述方法包括: i)提供根据权利要求1-48中任一项的茚三酮试剂； ?)将所述茚三酮试剂加热至至少第二温度，从而形成含还原茚三酮的混合物；和 iii)使所述含还原茚三酮的混合物与所述含氮化合物接触。52.根据权利要求51的方法，其中所述含氮化合物为氨基酸。53.根据权利要求51或52的方法，进一步包括分析步骤(iii)产物的颜色。
【专利摘要】提供了一种用于通过显色反应分析含氮化合物、特别是使含氮化合物可视化的方法中的茚三酮试剂，所述茚三酮试剂包含茚三酮、含水缓冲剂，和温度依赖性还原剂，所述还原剂在第一温度下在茚三酮还原中不具有活性，而在第二温度下在茚三酮还原成还原茚三酮中具有活性，其中第二温度高于第一温度。所述试剂特别可用于分析氨基酸。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN104919320
【申请号】CN201380070451
【发明人】L·J·皮特斯, M·G·帕洛特, P·琼斯
【申请人】Jpp色谱有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年11月20日
【公告号】DE202013010433U1, EP2735877A1, US20140141519, WO2014080158A1