] 1、ESA的制备
[0029] 将昆明小鼠腹腔无菌接种弓形虫RH株，立天后收集腹水中的虫体，用20号针头的 注射器抽吸两次W破碎腹腔巨瞻细胞，虫体稀释后WSum滤器过滤，所得纯化后的虫体用 无血清DMEM清洗两次后W无血清DMEM按照1X1〇7毫升浓度悬浮虫体，重提悬液5 %二氧 化碳培养箱37°C培养化W使虫体分泌ESA，100化pm离屯、lOmin除去虫体并收集上清，将上 清中添加复合型蛋白酶抑制剂后利用3KDa蛋白浓缩管20倍浓缩，将浓缩后的蛋白在4°C条 件下无菌PBS透析后ESA浓度并分装，-80°C保存。
[0030] 2、多克隆抗体的制备
[003U将1中所述ESA加同体积弗氏佐剂乳化后，按照100 y g/只免疫BALB/c小鼠，每 次免疫间隔2周，首次免十天后尾静脉采集血液分离血清用于抗体滴度化ISA检测。
[0032] 实施例2
[0033] 不同感染天数的急性感染弓形虫犬血清样本的制备
[0034] 选择清洁级比格犬，试验组和对照组各3只，试验组腹腔无菌接种1X1炉个新鲜 收集的纯化后的无菌PBS重悬的实施例1所述弓形虫RH株虫体，对照组接种无菌PBS，检测 体温变化并每天采集血液至感染后7天，分离血清后用作弓形虫急性感染动物血清。
[0035] 实施例3
[0036] 弓形虫急性感染不同天数的血清中循环抗原的免疫亲和层析
[0037] 1、犬血清IgG的去除
[0038] 将实施例2中所述感染弓形虫RH株3天内的犬血清60 加至540 无菌 PBS(抑=7. 2)中，加入100y1 25% (v/v)的ProteinA琼脂糖微球，4°C缓慢揽拌化后 离屯、收集上清，上清即为除去大部分IgG的稀释血清。
[0039] 2、去除非特异性结合
[0040] 将上述收集的上清中加入5 y 1NormalMouseIgG和100 y 1 25%的ProteinG 琼脂糖微球，4°C缓慢揽拌化后离屯、收集上清。
[0041] 3、免疫沉淀富集目的蛋白
[0042] 将上述收集的上清中加入5y1实施例1中制得的ESA多抗后4°C揽拌过夜，加入 100y1 25%的ProteinG琼脂糖微球，4°C揽拌化后离屯、收集琼脂糖微球，将微球清洗3次 后加入60y1 2XSDS-PAGE上样缓冲液，100°C煮沸5min后2500巧m离屯、5min收集上清。 [00创 4、膜辅助蛋白质组制备（FAS巧样品的酶解
[0044] 将3中所获得的富集的蛋白加入DTT至终浓度为lOOmM，沸水浴5min，冷却至室 温。加入200UL尿素buffeHSM尿素，150mMTris肥1P服.0)混匀，转入lOkd超滤离屯、管， 14000g离屯、15min。加入 200yL尿素bufferl4000g离屯、15min，弃滤液。加入 100yL50Mm 舰己酷胺，所述舰己酷胺溶于8M尿素，该8M尿素由150mMTris-肥1，抑8.0配制成（该里 请您确认或修改），600巧m振荡Imin，避光室温30min，14000g离屯、lOmin。加入100yL前述 尿素缓冲液，14000g离屯、lOmin重复2次。加入100yL溶解缓冲液值issolutionbuffer)， 所述溶解缓冲液为25mM畑4肥〇3,14000g离屯、lOmin重复2次。加入40y1T巧psin缓冲 液（2ygT巧psin加入到40yL溶解缓冲液配成），60化pm振荡Imin，37°C16-1她。换新 收集管，14000g离屯、lOmin，取滤液，准备进行液相色谱偶联质谱分析。
[0045] 5、毛细管高效液相色谱
[0046] 液相A液为0.1%(v/v)甲酸水溶液，B液为0.1%(v/v)甲酸己膳水溶液，其中 己膳为84% (v/v)。
[0047]色谱柱 0. 15mm*150mm(RP-C18)(ColumnTechnologyInc.)W95% (v/v)的A液 平衡。将4中所得样品由自动进样器上样到Zorbax300SB-C18p巧tide化aps，再经色谱柱 分离，相关液相梯度如下；〇分钟-50分钟，B液线性梯度从4%到50% ;50分钟-54分钟， B液线性梯度从50 %到100% ;54分钟-60分钟，B液维持在100%。
[0048]6、ESI质谱鉴定
[0049] 将5中的经过毛细管高效液相色谱分离到的产物再经毛细管高效液相色谱脱盐 及分离后用QExactive质谱仪进行质谱分析。检测方式；正离子。多肤和多肤的碎片的质 量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（化11scan)后采集10个碎片图谱（MS2scan)。 [0化0] 7、ESI质谱数据分析
[CK)5U 原始文件（rawfile)用用Mascot2.2软件捜索相应的数据库。最后得到鉴 定的蛋白质结果。相关参数如下：Enzyme=Trypsin、Missedcleavage= 2、Fixed modification；Carbamidomethyl似，Variablemodification；0xidation(M)捜索使用 Uniprot数据库；uniprot_Toxoplasma_gondii_26517_20140612.fasta蛋白质库（收录序 列 26517 条，下载于 201406013)。Peptidestolerance;20ppm，MS/MStolerance;0.IDa， Mascot结果过滤参数为；Mascotscore> 20。捜库结果表明Coronin蛋白的蛋白序列覆 盖率为3. 70%，唯一肤段数为3,唯一肤段数> 2即为成功鉴定。
[005引实施例4序列分析
[0化3] Coronin基因核巧酸序列及蛋白安氨基酸序列W NCBI在线数据库和DNAstar软件 进行分析。不同物种Coronin氨基酸序列的进化树分析表明，弓形虫Coronin重组蛋白除 了与猫寄生的非致病性的哈氏哈蒙德虫化ammondia hammondiKoronin同源性较高外，与 犬新抱子虫同源性81%，与其他物种同源性低于50 %，结果见图1。
[0054]实施例5
[0化5] 原核表达与弓形虫早期诊断相关的标志蛋白
[0056] 1、引物的设计与合成
[0化7] 根据刚地弓形虫Coronin基因的已知序列（Gen-Bank收录号；AY713297)，利用 Primer5.0针对其开放阅读框设计引物，预期扩增基因的长度为125化P，在上、下游引物 5'端分别引入BamHI和化0I酶切位点，上游引物FP: 5'GTCGGATCCCACGATGGATCGAAGGCAT 3'，下游引物RP:5'CGCCTCGAGAGCGGCTTCGTCCTGA3'，
[005引 2、弓形虫RH株的收集及RNA的提取
[0化9] 从液氮中取出保种的弓形虫RH株复苏，腹腔接种小鼠，3d后用灭菌生理盐水冲洗 腹腔，收集腹腔液，100化pm离屯、15min，弃上清液，所得弓形虫RH株虫体用PBS洗3次，采 用Trizol法提取RNA。总RNA保存于-70°C备用。
[0060] 3、Coronin基因的RT-PCR扩增
[0061] 将提取的总RNA按反转录试剂盒说明反转录得到cDNA，并W此为模板进行PCR扩 增。反应体系（25化）Mix12. 5化，上、下游引物及cDNA模板各1化，加入dd &0 补至 25yL。反应条件；94°C4min;94°C45s，58°C50s，72°C50s，30 个循环；最后 72°C 延伸lOmin。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，如图2 所示。将回收纯化的PCR产物与PMD19T载体连接，连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受 态细胞，氨节青霉素抗性筛选阳性克隆。经菌落PCR鉴定后，将阳性质粒送。阳性质粒被命 名为PMD19T-C0R0NIN。
[0062] 4、重组表达质粒的构建和鉴定
[006引PMD19T-C0R0NIN和祀T-28a表达载体均用限制性内切酶BamHI和化0I双酶切， 酶切后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收产物连接并转化大肠杆菌化21 0)E3)感受态细 胞，挑取单个菌落培养提取质粒，进行PCR和酶切鉴定。
[0064] 5、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
[00化]重组质粒的表达及可溶性分析将筛选的阳性重组菌接种于10血含卡那霉素 70yg/mL的LB液体培养基，于37°C、200巧m振摇培养她后，接种于250mlLB卡那霉素培 养基中，相同条件扩大培养至OD600皿值为0. 6-0. 8时，加入0. 5mmol/LIPTG，20°C诱导表 达12h。80(K)巧m离屯、lOmin收集菌体，将离屯、收集的诱导表达菌体用1/10原培养液体积 的1X结合缓冲液重悬，于冰浴上超声破碎，12000巧m离屯、lOmin，分别收集上清液和沉淀， 通过SDS-PAGE分析重组蛋白的存在形式并纯化。
[0066] 6、重组蛋白Coronin的纯化
[0067] 将诱导表达后收集的菌体，用IX结合缓冲液重悬，经超声破碎，收集上清，经 0. 22ym滤膜过滤后，按照化S?BindResin纯