GGGAGGCAGCCA TTGAGA CCCAGA TITITmTT-C6-SH-3'；一报告探针基因为： 5'-biotin-TCCTGC CCAACA GCAACC ACGTGG CCAGTG-3' ；另一组探针中的另一捕获探针基 因为：5' -TCTGGG TCTCAA TGGCTG CCTCCC CGGCGC TTTTTTTTTT-C6-SH-3' ；另一报告探针基 因为：5' -biotin-GGCTGG GCACTA TCTCTTCAGAACTGCTGC-3'。
[0014] (1)根据带巯基的捕获探针在金电极表面能形成自组装单分子膜的特性，将两捕 获探针分别固定在两个不同通道上分别设置的两个型号相同的金电极工作电极表面，每 个通道有一个金电极工作电极，对两个金电极工作电极表面未结合的位点通过封闭剂进 行封闭，采用巯基己醇，巯基乙酸，牛血清白蛋白或酪蛋白封闭；（2)将两报告探针提前混 于含有靶标dsDNA的杂交液中，通过高温变性使双链DNA解链成单链，并将变性后的杂交 液置于冰浴中保持杂交溶液中DNA单链状态；（3)变性后的两条单链靶标DNA的一端分别 与5'端标记有生物素的两报告探针杂交，然后利用两条长链靶标链的另一端分别与两捕 获探针通过碱基配对结合实现共杂交，将两组探针新形成dsDNA片段固定在相应的金电 极工作电极上；(4)加入带有辣根过氧化物酶的亲和素，通过辣根过氧化物酶上的亲和素， 根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将辣根过氧化物酶结合到金电极工作电极表面，利 用辣根过氧化物酶的信号放大作用，将两个修饰的金电极工作电极同时置于相同的底物 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺中，利用电化学双通道工作站同时采集电信号检测。
[0015] 所述两组2' -氟代RNA单体修饰的报告探针加入到靶标双链DNA中一同变性后， 进行杂交，能够有效的防止原有靶标两条互补链之间的自身复性，提高杂交效率，且修饰了 2' -氟代RNA单体后的报告探针的解链温度升高，有利于提高报告探针识别靶标DNA的专 一性，提尚检测的特异性。
[0016] 两组探针DNA加入后、探针DNA与靶标dsDNA杂交后需采用洗涤剂洗涤除去非特 异性吸附，以去除PBS、0. 2% SDS物质。
[0017] 将酶固定在修饰有生物素的金电极工作电极表面之前，需采用封闭剂防止电极表 面的非特异性吸附，以去除〇. 1% BSA。
[0018] 将辣根过氧化物酶固定在修饰有生物素的工作电极表面后，需采用洗脱液除去电 极表面的非特异性吸附，以去除0. 1% Tween-PBS、PBS。
[0019] 本发明所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因 dsDNA的方法，其 特征在于对探针的特异性及灵敏度进行测试，实现对急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融 合基因 dsDNA的定量检测。
[0020] 具体地说，本发明的一种基于2' -氟代RNA单体修饰双探针同时检测急性早幼粒 细胞白血病PML/RAR α融合基因双链DNA的双通道电化学传感检测方法，待检测PML/RAR α 融合基因为L型、V型或S型，包括如下步骤：
[0021] (1)从NCBI基因数据库中查找L型、V型及S型PML/RARa融合基因双链DNA片 段的融合位点，选择位点前后的碱基作为人工合成的两组检测探针使用，检测探针长度为 30碱基，经过同源比对，同时利用相关生物学软件对两组检测探针与其相应的靶标序列两 两间的解链温度进行模拟，以确保探针的特异性，将对应序列作为APL的特异性序列进行 合成。其中，探针中修饰的2'-F RNA单体进行修饰位点设计，考虑到使用最少的2'-F RNA 单体，但能较好地保持探针链的刚性并提高其特异性。
[0022] (2)采用自组装膜法固定捕获探针，根据带巯基（-SH)的不同捕获探针在不同金 电极表面可以形成自组装单分子膜的特性来固定，对金电极表面未结合的位点通过封闭剂 进行封闭，如巯基己醇，巯基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等。
[0023] (3)使靶标dsDNA中两条长链靶标ssDNA链的一端能够分别与其相应的5'端标记 有生物素（biotin)的报告探针杂交，然后利用长链靶标ssDNA链的另一端与捕获探针通过 碱基配对结合实现共杂交，在不同电极表面形成相应的双链DNA (dsDNA)片段固定化。
[0024] (4)通过辣根过氧化物酶（HRP)上的亲和素（avidin)，根据亲和素与生物素之 间的亲和作用，将酶结合上去，利用酶的信号放大作用，在底物3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 (TMB)中进行检测。
[0025] (5)利用双通道电化学工作站通过安培电流时间曲线法能够实现对靶标dsDNA链 中两条互补序列的同时检测，将检测所得信号结果进行计算叠加，可以得到靶标dsDNA的 检测最终电流信号，比较杂交前后电信号的差异，可说明溶液中是否存在靶标dsDNA。
[0026] 本发明与现有技术相比有以下优点：本发明技术方案采用2' -氟代RNA单体修饰 探针技术、双探针检测技术与电化学酶联放大技术构建了基于2' -氟代RNA单体修饰双探 针同时检测急性早幼粒细胞白血病PML/RAR α融合基因双链DNA的双通道电化学传感检测 方法，其中设计的2'-氟代RNA单体修饰探针热稳定性增强，其特殊的核苷酸结构也增加了 探针的刚性及特异性，而双探针检测模式能够有效地避免DNA双链片段自身复性对探针识 别靶标序列的干扰，提高传感器的检测性能，此外辣根过氧化物酶具有信号放大的功能，增 强检测的灵敏度，所构成的三明治型电化学DNA传感器有效地减少非特异性吸附，从而提 高杂交检测的特异性。由于该技术的检测周期相对较短，为临床上快速诊断提供可能。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明的基于2' -氟代RNA单体修饰探针的"三明治"构型双通道电化学 DNA传感器检测人工合成PML/RARa融合基因 dsDNA的工作原理图。
[0028] 图2为本发明的基于2' -氟代RNA单体修饰探针的"三明治"构型双通道电化学 DNA传感器组装过程表征图。
[0029] 图3为本发明的比较普通DNA双探针与2 ' -氟代RNA单体修饰双探针检测PML/ RARa融合基因 dsDNA的不同靶标序列直方图。
[0030] 图4为本发明的2 ' -氟代RNA单体修饰双探针检测PML/RAR a融合基因 dsDNA的 电信号检测图、直方图和标准曲线图。
[0031] 图2中：在0.1 M KOH的IOmM K3Fe (CN)6溶液中不同修饰电极的循环伏安图（A)和 在IOmM Fe (CN) 63 /4溶液中的交流阻抗图谱（B)，未做修饰的工作电极裸AuE (a)、经过MCH 封闭后的Cl/MCH/AuE(b)、完成捕获探针组装的Cl/AuE(c)、杂交后的RlSaCl/MCH/AuE(d) 和修饰有 HRP 的 HRP/RlSaCl/MCH/AuE(e)。
[0032] 图3中：图普通短直链DNA (白色）探针与2' -氟代RNA单体修饰探针（黑色）分别 与不同dsDNA杂交后电流信号直方图：完全互补革El标dsDNA(b)、单碱基对错配dsDNA(c)、三 碱基对错配dsDNA (d)、五碱基对错配dsDNA (e)、十碱基对错配dsDNA (f)、正常人PML部分序 列dsDNA (g)、正常人RAR α序列dsDNA (h)以及未含有dsDNA的杂交体系完全互补DNA (a)。
[0033] 图4中：基于2' -氟代RNA单体修饰探针的双通道电化学DNA传感器两个通道分 别采集通道I : (A)和通道2 : (B)的时间电流曲线：浓度范围从（a)到（g)分别为Omol/L， I X 10 13mol/L，I X 10 12mol/L，I X 10 nmol/L，I X 10 10mol/L，I X 10 9mol/L 和 I X 10 smol/L ; (C)比较双通道电化学DNA传感器上同时组装两组2'-氟代RNA单体修饰探针（黑色部分） 与组装单组2'-氟代RNA单体修饰探针（检测探针1 :白色部分，检测探针2 :阴影部分）分 别与不同浓度靶标dsDNA进行杂交后所得的电流总和（Σ I)直方图；(D)双通道电流总和 (Σ I)与不同浓度靶标dsDNA的线性关系图（浓度范围5.0X1013mol/L~L5X1012mol/ L) 〇
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035] 如附图所示，本发明所述的一种基于2' -氟代核糖核酸双探针的双通道电化学传 感器，包含有两组检测探针，其特征在于每组探针各包含有一条3'端修饰巯基的捕获探针 和一条5'端修饰有生物素的报告探针，两组探针中的两个捕获探针分别简称（Cl和C2) 和两个报告探针分别简称为（Rl和R2)，且这两组探针中的一组探针（C1/R1)和另一组探 针（C2/R2)分别与靶标急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA中相应的两条 ssDNA(Sa和Sb)部分基因序列存在互补；其中，两个修饰有巯基的捕获探针（Cl和C2)能 够通过自组装分别固定到不同通道上的两个型号相同的金电极工作电极表面上，在两个金 电极工作电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭，而过量的报告探针Rl和报告探针 R2则提前加入到含有待测靶标dsDNA的杂交溶液中进行热变性后置于冰浴中以确保杂交 液中的DNA序列均保持ssDNA状态，并将一组中的修饰有巯基的一条捕获探针Cl的金电极 工作电极和另一组中的修饰有巯基的另一条捕获探针C2的金电极工作电极一同放入含 有一条5'端修饰有生物素的报告探针RU另一条5'端修饰有生物素的报告探针R2和靶 标急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的待测溶液中进行杂交反应，通过杂 交反应，在两个金电极工作电极表面形成了 "三明治"传感模式，此时生物素已通过杂交修 饰到电极表面，加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶与生物素相互识别，将辣根过氧化物酶 结合到金电极工作电极上；所述的金电极工作电极置于由3,3'，5,5'_四甲基联苯胺（TMB) 和H 2O2组成的检测底液，通过辣根过氧化物酶HRP催化使得H 202氧化TMB产生电化学信号， 利用双通道电化学工作站进行信号采集，当溶液中不含靶标dsDNA，则杂交反应无法进行， 金电极工作电极界面上无法形成"三明治"构型传感模式，那么辣根过氧化物酶HRP也就无 法固定到金电极工作电极表面，金电极工作电极无法对检测底液进行催化，所以双通道电 化学工作站检测到的电流信号很弱，通过对双通道所采集到的电流信