一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中沙门氏菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱 检测食品中沙门氏菌的方法。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌属于一种肠道杆菌致病菌，革兰氏阴性。沙门氏菌在自然界中广泛存在， 特别容易污染水源、食品及畜产品，对于人类和动物的健康均构成极大危害。人或动物食用 了被沙门氏菌污染的食品即会引发食物中毒。沙门氏菌引起的急性传染病，临床表现主要 分为胃肠炎型（即食物中毒）、伤寒型、败血症型及肠道外局灶性感染。其中以胃肠炎型最 为常见，可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻及发热等临床征候群。据资料统计，在我国细菌性食 物中毒中，70%~80%是由沙门氏菌引起的，世界各地的食物中毒中，美国、中国沙门氏菌 食物中毒居首位。由此可见沙门氏菌病是公共卫生学上最为主要的人畜共患病之一。因此 建立准确、灵敏、快速的沙门氏菌检测技术对于食品安全具有重要意义。
[0003] 传统的微生物检验程序繁琐复杂，耗时费力，检验结果的准确性和可靠性在很大 程度上依赖于检测者的专业素质和经验，所以该方法不够客观、灵敏、快速；新发展起来的 荧光实时定量PCR技术，虽然能缩短检验时间，特异性强、灵敏度高，但是费用昂贵、易污 染，对操作环境要求高；现今常用的免疫学方法，例如酶联免疫吸附测定法、斑点酶联免疫 吸附、免疫磁性分离技术，免疫荧光标记等，具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但 制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。近些年来，由于适配体（aptamer)较之抗体有 诸多优点：成本低，稳定性好，易于修饰等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到 很多领域的关注。
[0004] 拉曼散射由于蕴含分子振转能级的丰富信息，已成为物质分析的有力工具，特别 是表面增强拉曼散射（SERS)技术的出现，使其检测灵敏度获得了极大的提高。近年来， SERS光谱以其高分辨率、高灵敏度、溶液干扰性小、稳定性好等特点被广泛应用于物理、材 料、表面科学、环境化学、生物化学、有机化学甚至生物学的分析和研究。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中沙门氏 菌的方法。本发明采用银包覆金的核壳型纳米材料作为基底，将巯基化修饰的沙门氏菌适 配体加入到上述制备所得的银包覆金的核壳型纳米材料中孵育，从而将沙门氏菌适配体固 定在基底上。将被测物与修饰有沙门氏菌适配体的银包覆金的核壳型纳米材料混合，加入 具有拉曼信号R0X修饰的沙门氏菌适配体进行孵育，然后进行拉曼光谱扫描。基于适配体 与沙门氏菌的特异性结合，实现对食品中沙门氏菌的检测。具体检测示意图如图1所示。本 方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。
[0006] 实现本发明的具体方法： 一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中沙门氏菌的方法，包括以下步骤： 1) 拉曼增强基底的合成：采用柠檬酸三钠还原法首先制备得到纳米金，然后加入一定 量的抗坏血酸和硝酸银，制备得到银包覆金的核壳型纳米材料基底。 2) 适配体的固定化：将一定量巯基化修饰的适配体加入到上述制备所得的银包覆金 的核壳型纳米材料中孵育，从而将适配体固定在基底上。 3) 沙门氏菌的检测：将待测液与修饰有适配体的银包覆金的核壳型纳米材料混合，加 入一定量的具有拉曼信号ROX修饰的适配体，然后进行拉曼光谱检测。
[0007] 具体的：步骤1)所述拉曼增强基底的合成具体操作为，取0. 5mL 1 %的氯金酸溶 液，加入到49. 5mL超纯水中，加热并搅拌，至沸腾；然后迅速加入1. 5mL 1 %的柠檬酸三钠 溶液，持续煮沸15min，合成纳米金颗粒。接着取制备好的纳米金2mL，加入lmL超纯水， 0. 4mL L-抗坏血酸（0. lmol/L)，持续搅拌5min，逐滴加入1. 2mL硝酸银（1 X 10 3mol/L)，持 续搅拌1小时，制备得到银包覆金的核壳型纳米材料。
[0008] 步骤2)所述的适配体固定化操作为，取银包覆金核壳型纳米颗粒190 iiL，加入 10yL适配体（10ymol/L)，4°C孵育12小时。
[0009] 步骤3)所述的检测，不同浓度的沙门氏菌样品与适配体修饰的银包覆金核壳型 纳米材料于室温下孵育45min，然后加入R0X修饰的适配体继续孵育45min。之后于3000r/ min离心5min，并清洗两次。样品重悬于缓冲液中上拉曼光谱仪检测。
[0010] 本发明的优点在于： 1. 本发明方法以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件， 适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度 亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。 2. 本发明以银包覆金的核壳型纳米复合材料作为拉曼增强基底，具有贵金属的光谱特 性，且试样制备快速，成本低等优点。 3. 本发明中提供的检测方法与现有沙门氏菌的检测方法相比，具有灵敏度高的特点， 其检测限可达到17cfu/mL。
【附图说明】
[0011] 图1基于适配体识别表面增强拉曼检测沙门氏菌的示意图 图2银包覆金核壳型纳米粒子的透射电子显微镜图（TEM) 图3不同浓度的沙门氏菌引起的表面增强拉曼光谱图（A)，相对拉曼强度与沙门氏菌 浓度的线性关系图（B)
【具体实施方式】
[0012] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0013] 实施例1 1)拉曼增强基底的合成 首先取0. 5mL质量分数1 %的氯金酸溶液于100mL圆底烧瓶中，加入超纯水49. 5mL，加 热并搅拌，至沸腾；然后迅速加入1. 5mL质量分数为1 %的柠檬酸三钠溶液，持续煮沸15min 后，溶液颜色变为酒红色，停止反应，自然冷却至室温。接着取制备好的纳米金2mL于50mL 圆底烧瓶中，加入lmL超纯水，0. 4mL L-抗坏血酸（0. lmol/L)，室温下持续搅拌5min，然后 逐滴加入1. 2mL硝酸银（1 X 10 3m〇l/L)，持续搅拌1小时，溶液由酒红色变为橙黄色，终止 反应，所得溶液为拉曼增强基底-银包覆金核壳型纳米颗粒。图2为银包覆金核壳型纳米 颗粒的透射电子显微镜图（TEM)