一种磁性血小板吸附颗粒及其制备方法_3

文档序号:9451269阅读:来源:国知局
磁性微球干燥品;
[0065] 步骤3 :配制功能性血小板吸附蛋白的PBS溶液,功能性血小板吸附蛋白与PBS缓 冲液的比例为l-l〇〇mg : l-100ml,加入壳聚糖磁性微球干燥品,功能性血小板吸附蛋白与 壳聚糖磁性微球干燥品的比例为l-l〇〇mg : 0. l-2g,调节pH值到功能性血小板吸附蛋白的 等电点±0. 5,置于2-8°C冷藏、搅拌吸附0. 1-5日,得到包裹有功能性蛋白的壳聚糖磁性微 球;用PBS缓冲溶液洗涤,加入电镜固定液,使功能性蛋白固定在壳聚糖磁性微球表面,功 能性血小板吸附蛋白与电镜固定液的比例额外l-100mg : l-50ml,用纯化水洗涤,然后经 过真空干燥、研磨后得到包裹有功能性蛋白的壳聚糖磁性微球干燥品,即为磁性血小板吸 附颗粒。
[0066] 优选地,所述的Fe304纳米颗粒的制备方法包括:将FeCl 2 *4H20加入到FeCl3 *61120 水溶液中,在N2的保护下搅拌至溶解,放置在50-70°C的水浴中加热,加入乳化剂PEG4000, 搅拌下将2. 0-4. Omol/L的NH40H逐滴滴加到上述的混合溶液中,将pH值控制在9. 5-10. 5, 在50-70°C水浴中继续搅拌和超声分散各10_60min,然后在70-90°C水浴恒温0. 5-1. 5h进 行熟化,冷却同时机械搅拌10-60min,用强磁铁吸住烧杯底部进行强磁分离,倾去上层废 液,用蒸馏水洗涤数次至pH值为6. 5-7. 5,然后在50-70°C下真空干燥,研磨即得纳米Fe304 磁性颗粒。
[0067] 优选地,所述的步骤2. 2中液状石蜡和石油醚的体积比为9/1。
[0068] 优选地,所述的步骤3中的功能性血小板吸附蛋白为牛纤维蛋白原或人纤维蛋白 原。
[0069] 优选地,所述的磁性血小板吸附颗粒的制备方法还包括:步骤4 :将所述的包裹有 功能性蛋白的壳聚糖磁性微球干燥品制成滴丸制剂,所述的滴丸制剂的原料包括重量比为 1-100 : 1-500的包裹有功能性蛋白的壳聚糖磁性微球干燥品和聚乙二醇。
[0070] 更优选地,所述的滴丸制剂的制备方法包括:
[0071] 步骤4. 1 :称取聚乙二醇置于蒸发皿中,水浴加热使之熔化,按配比加入包裹有功 能性蛋白的壳聚糖磁性微球干燥品,搅拌,将所得的熔融液置于75°C保温备用;
[0072] 步骤4. 2 :将步骤1中的熔融液置于滴丸装置中,滴入冷凝剂中,收集滴丸。
[0073] 步骤4. 3 :将冷却后的滴丸收集,用石油醚洗涤,置于索氏提取器中回流,彻底清 除冷凝剂,再将滴丸置于真空干燥皿中,室温下抽真空干燥1-48小时使石油醚完全挥发, 即得直径0. 5-2_左右的滴丸型血小板吸附试剂。
[0074] 更优选地,所述的冷凝剂为液体石蜡、二甲基硅油或其他与水不相溶的油。
[0075] 优选地,所述的步骤2. 4中的使用磁铁将悬浊液中的黑色沉淀吸出后,剩余物质 作为第一废液处理,所述的沉淀物的洗涤步骤包括先用石油醚清洗,洗涤后保留沉淀物,剩 余物质作为第二废液处理,再用丙酮清洗沉淀物。
[0076] 更优选地,所述的清洗方式包括自然沉淀洗涤、抽滤洗涤以及索氏提取器洗涤。
[0077] 更优选地,所述的磁性血小板吸附颗粒的制备方法还包括:步骤5 :将第一废液 与第二废液合并,形成乳白色废液,将其置于分馏装置中,向废液中加入沸石或蛋壳,在 常压下收集100 °c以下的分馏组分,通过分液漏斗去除水层,回收石油醚;在常压下收集 100-150°C的分馏组分,通过分液漏斗去除水层,回收二甲苯。
[0078] 与现有技术相比,本发明的有益效果是:
[0079] 1、通过高剪切力机械分散装置,有效防止Fe304磁性粒子的团聚,解决了【背景技术】 中迄今为止,在壳聚糖磁性微球制备领域,数十年来始终未能解决的难题。
[0080] 2、本发明的通过新材料、新工艺的应用,使得壳聚糖微球能够包裹更多的磁性颗 粒,使得上述"第二步"工艺中,壳聚糖包裹磁性颗粒的成功率(即包封率)得到了突破性 的提高,突破了行业瓶颈。
[0081] 3、本发明采用过渡溶剂作为交联剂的载体,有效解决了现有技术下,壳聚糖磁性 微球交联反应过程中,交联剂添加量过多造成微球团聚、过少微球造成微球不成形的难题。 在实施例中,即使交联剂投料过量4倍也不会发生壳聚糖磁性微球团聚现象。
[0082] 4、本发明公布了"绿色化学"所倡导的,环保型的反应试剂(主要是油相,即乳化 用介质)的回收、重利用工艺,有效减少了废料排放、碳排放,降低了生产成本,解决了现有 壳聚糖磁性微球制备工艺中存在的原料利用率低、生产成本高、多年来仅停留在实验室水 平的现状。
[0083] 5、本发明采用了磁性血小板吸附颗粒,巧妙地利用壳聚糖磁性微球的磁靶向效应 解决了现有Accumetrics 悬浮颗粒状试剂吸附血小板后,仍处于悬浮状态,池 度变化量小,光比浊信号动态范围小的不足。使用本发明的磁性颗粒,就可以期望通过外加 磁场的方式,使颗粒状试剂吸附血小板后可以在外加磁场的作用下迅速聚集沉淀,因此浊 度变化量大,从而进一步提高了光比浊信号的动态范围,继而提高了检测信号的清晰度。
【附图说明】
[0084] 图1为Accumetrics公司的Vedfybknv◎血小板功能检测试剂盒的结构,其中301 进样针头,302装有血样的真空采血管,303预热池,304反应池;
[0085] 图2为Accumetrics公司的VeiifyWm#血小板功能检测试剂盒中的血小板吸附 颗粒示意图,其中E Erythrocyte红细胞,B Beads血小板吸附颗粒,P Platelet血小板,C Container反应池,血小板激活后吸附到Beads上,造成反应池透光度增加;
[0086] 图3为本发明所述的磁性血小板吸附颗粒的结构示意图,其中磁性核心201,磁性 核心201外侧设有填充层202,填充层202外侧设有包衣层203 ;
[0087] 图4为本发明采用磁性核心技术所带来的有益性示意图,与图2比较,反应池透光 度增加量大于现有技术;
[0088] 图5为现有技术所制备的磁性壳聚糖微球照片,其中Opt Optical为光学显微镜 照片,分别显示不同戊二醛添加量对壳聚糖磁性微球形态的影响,SEM为扫描电子显微镜照 片,显示了其表面形态特征,TEM为透射电子显微镜照片,显示其内部结构组成,其TEM图中 球形边缘透光度高,未见磁性颗粒,中央部分透光度低,为典型的均质球形材料透射投影图 像;
[0089] 图6为本发明所述的,经过高剪切力机械分散装置处理过的壳聚糖-纳米Fe304混 悬液的光学显微镜照片,其中黑色的Fe 304磁性颗粒分布均匀;
[0090] 图7为现有机械搅拌、超声处理过的壳聚糖-纳米Fe304混悬液的光学显微镜照 片,其中黑色的Fe 304磁性颗粒分布不均匀,有明显的团聚现象;
[0091] 图8,图9,图10为本发明工艺所制备的壳聚糖磁性微球乳液的光学显微镜照片, 照片中可见球形液滴,球形液滴为壳聚糖,液滴中心黑色颗粒为Fe 304磁性颗粒,绝大部分 液滴都包裹有磁性颗粒;
[0092] 图11为初步干燥后的壳聚糖磁性微球光学显微镜照片,干燥后微球的体积明显 减少,其具备了图3所述的基本形态;
[0093] 图12为干燥的壳聚糖磁性微球扫描电子显微镜照片,样品经喷金处理,可见其表 面呈球形;
[0094] 图13为一颗直径6 ym左右的的壳聚糖磁性微球透射电子显微镜照片,样品经超 声波破碎处理,可见其球形结构密度非常高,电子束被完全吸收,无法穿透球体,只有在断 口处电子束才能穿透部分截面,从断口处的放大图可见壳聚糖微球内部包含有大量粒径约 200nm左右的纳米Fe 304磁性颗粒,纳米Fe 304磁性颗粒对电子束有强烈的吸收;
[0095] 图14为本发明的鉴定结论,证实了本发明工艺所制备的产物具有图3所述的201, 202部分及其组合方式的结构特征;
[0096] 图15人体正常血液涂片的显微摄影照片,本照片为暗视野照片,其中可见大量圆 盘状红细胞及4颗零星分布的血小板;
[0097] 图16富血小板血浆(PRP)与本发明所述的微球均匀混合后的显微摄影照片,其中 左图为普通明视野照片,右图为暗视野照片,其中暗视野照片中可见血小板呈星星点点状 均匀分布;
[0098] 图17使用ADP激活血小板后的显微摄影照片,其中上图为明视野,中图为暗视野, 下图为相差视野,其中暗视野、相差视野中可清晰观察到血小板聚集、吸附到本发明所述微 球的表面的光学显微形态。
【具体实施方式】
[0099] 下面结合附图和实施例来具体说明本发明。为了让整个说明书前后一致,并能清 楚地理解本发明创造,特对其中所用的术语作出以下定义:
[0100] 壳聚糖:壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素,是由自然界广泛存在的几丁质 (chitin)经过脱乙酰作用得到的,化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。它 是一种线性多醣,当中由氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和N-乙酰葡糖胺(乙酰单位)随机分 佈,并透过0-(1-4)糖苷键组合而成。壳聚糖在生医材料上的相关应用研究非常多,目前 认为其具有良好的生物相容性、无生物毒性,当作生医材料的骨架是非常好的选择,这种天 然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各 业广泛关注,在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等 诸多领域的应用研究取得了重大进展。
[0101] 交联剂:促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质。是一种能在线 型分子间起架桥作用,从而使多个线型分子相互键合交联成网状结构的物质。是一类小分 子化合物,分子量一般在200-600之间,具有2个或者更多的针对特殊基团(氨基、巯基、醛 基等)的反应性末端,可以和2个或者更多的分子分别偶联从而使这些分子结合在一起。交 联剂在不同行业中有不同叫法,例如:在橡胶行业习惯称为"硫化剂";在塑料行业称为"固 化剂"、"硬化剂";在胶黏剂或涂料行业称为"固化剂"、"硬化剂"等。用于壳聚糖交联剂主 要有醛类,如甲醛、戊二醛。
[0102] 纤维蛋白原:纤维蛋白原一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质。纤维蛋白是 在凝血过程中,凝血酶切除血纤蛋白原中的血纤肽A和B而生成的单体蛋白质。简单地说, 就是一种与凝血有关的蛋白质,即凝血因子。本发明中所述的纤维蛋白原可以是人源的也 可以是其他哺乳
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