[0044] 在步骤（1. 5)沉淀物中加入磷酸盐缓冲溶液，再进行超声分散5~15分钟，使 得发光微粒重新均匀悬浮于溶液中，再将发光微粒悬浮液置于温度为2~8°C的冷冻离心 机中，16000~20000转/小时的速度，离心5~15分钟，收集沉淀物，为共价联接了鼠抗 γ-干扰素单克隆抗体的发光微粒；
[0045] 步骤（1. 5)沉淀物与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为：1~4mg沉淀物/ml磷酸 盐缓冲溶液，优选2. 5mg沉淀物/ml磷酸盐缓冲溶液；
[0046] 所述的磷酸盐缓冲溶液为0.0 lmol/L pH值为7. 4。
[0047] (1. 7)稀释分装：
[0048] 将保存液加入步骤（1. 6)中的沉淀物，超声分散5~15分钟，使得发光微粒重新 均匀悬浮于溶液中，所得的发光微粒悬浮液再用保存液进行稀释，即为所述的结核T细胞 释放γ-干扰素检测微粒悬浮液；
[0049] 步骤（1. 6)沉淀物与保存液的质量体积比为：2~8mg沉淀物/ml保存液，优选5mg 沉淀物/ml保存液；
[0050] 发光微粒悬浮液与保存液的稀释用量比：Iml发光微粒悬浮液/25~200ml保存 液，优选Iml发光微粒悬浮液/100mL保存液；
[0051 ] 所述的保存液为一种混合物，以0.0 lmol/L pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液为载体，含有 如下浓度的组分：
[0052] 聚乙稀吡略烧酮4~6mg/ml，鹿糖80~120mg/ml，海藻糖20~30mg/ml，牛血清 白蛋白 50 ~150mg/ml，叠氣纳 0· 05 ~0· 15mg/ml ;
[0053] 优选的，含有如下浓度的组分：
[0054] 聚乙稀P比略烧酮5mg/ml，鹿糖100mg/ml，海藻糖25mg/ml，牛血清白蛋白IOOmg/ ml，叠氮钠 0· lmg/ml ;
[0055] (2)所述的结核T细胞释放γ -干扰素检测试剂卡组件的是独立包装的，包括检测 试剂卡；
[0056] 所述的检测试剂卡包括底板、样品垫、缓冲垫、反应膜和吸水纸；
[0057] 所述的反应膜包括反应膜层和划在上侧面的测试线T线和质控线C线，所述的测 试线T为鼠抗γ -干扰素单克隆抗体，所述的质控C线为羊抗鼠抗体，所述的反应膜的底侧 面复合在底板的中部；所述的鼠抗γ-干扰素单克隆抗体和羊抗鼠抗体均为公知的物质， 可采用商业化产品；所述的反应膜层优选硝酸纤维膜；
[0058] 所述的吸水纸一端复合在所述的底板的端部，另一端压在所述的反应膜的端部 上，所述的吸水纸的材质为玻璃纤维和纤维素混合物；
[0059] 所述的缓冲垫是由处理液浸泡过的缓冲垫膜干燥制成，所述的处理液与缓冲垫的 用量为：〇. 5-5ml处理液/cm2缓冲垫；所述的处理液为0. 1% -1% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮 和0. 1% -1% (v/v)吐温20的纯水溶液；所述的缓冲垫的一端复合在底板上，并被样品垫 的一端盖住，另一端压在反应膜上，所述的缓冲垫膜优选聚酯纤维膜；
[0060] 所述的样品垫是由处理液浸泡过的样品垫干燥制成，所述的处理液与样品垫的用 量比为：〇. 5-5ml处理液/cm2样品垫；所述的处理液为0. 1% -1% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮 的纯水溶液，所述的样品垫的一端与底板复合，另一端压在所述的缓冲垫上，所述的样品垫 膜优选玻璃纤维膜；
[0061] 所述的结核T细胞释放γ -干扰素检测试剂卡的制备方法，包括如下步骤：
[0062] (1-1)样品垫：将玻璃纤维膜浸泡或喷上含有0. 1% -1% (w/v)的聚乙烯吡咯烷 酮溶液，在不高于37°C干燥4~8小时；
[0063] (1-2)缓冲垫：将聚酯纤维膜浸泡或喷上含有0. 1% -1% (w/v)的聚乙烯吡咯烷 酮溶液和〇. 1 % -1 % (v/v)的吐温20溶液，在不高于37°C干燥至4~8小时；
[0064] 术语"1% w/v"，指的是100毫升溶剂，1克溶质，具体的如1% w/v的聚乙稀吡略 烷酮溶液，指的是100毫升纯化水，1克聚乙烯吡咯烷酮，下同；
[0065] 术语" 1 % v/v"，指的是100毫升溶剂，1毫升溶质，具体的如1 % v/v的吐温20溶 液，指的是100毫升纯化水，1毫升吐温20,下同；
[0066] (1-3)反应膜：将硝酸纤维膜贴在底板的中部上，再将浓度为0. 35_3mg/ml的鼠抗 γ -干扰素单克隆抗体和浓度为〇. 35-3mg/ml羊抗鼠抗体，以1.0 ul/cm的喷量划在硝酸纤 维膜上，形成测试T线和质控C线，然后置于不高于37°C下干燥1~2小时；
[0067] (1-4)将样品垫、缓冲垫、反应膜和吸水纸依次贴合在底板上，其中样品垫、缓冲 垫、反应膜和吸水纸重叠 l-2mm，再裁剪成同等尺寸的小试纸条，然后将小试纸条安置在塑 料卡壳中，即为所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂卡；
[0068] 将所述的结核T细胞释放γ -干扰素检测试剂卡与所述的干燥剂密封包装于铝箱 袋中，即可获得所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂卡组件；
[0069] (3)所述的测试培养管⑴由结核分枝杆菌特异性混合多肽和A頂-V培养基组成， 其用量的质量体积配比为：15~25mg结核分枝杆菌特异性混合多肽/LA頂-V培养基，优选 20mg结核分枝杆菌特异性混合多肽/LA頂-V培养基；
[0070] 所述的结核分枝杆菌特异性混合多肽为ESAT-6蛋白和CFP-10蛋白的多肽片 段混合物，其中ESAT-6蛋白的2个多肽P52-75aa、P72-95aa和CFP-10蛋白的2个多肽 P76-90aa、P71-85aa，这4个多肽用量的质量比为1: 1:1: 1，用于测试样本时刺激样本中T细 胞γ-干扰素的释放；
[0071] 所述的ESAT-6蛋白和CFP-10蛋白的多肽片段混合物，可由专业的多肽合成技术 人员合成获得，如上海吉尔多肽有限公司；
[0072] ESAT-6蛋白的多肽序列如下：
[0073] P52~75aa ：awggsgsea yqgvqqkwda atelnnalq nlart
[0074] P72_95aa :lartiseag qamastegnv tgmfa
[0075] CFP-10蛋白的多肽序列如下：
[0076] P76~90aa ：irqag vqysradeeq
[0077] P71-85aa ：eistnirqag vqysr
[0078] 所述的Am-V培养基，为无血清细胞培养基（细胞治疗级），可向美国 LifeTechnology 购买，品牌 Gibco ;
[0079] (4)所述的本底对照培养管（N)由AM-V培养基组成，用于测试样本时作为空白对 昭.
[0080] (5)所述的阳性对照培养管（P)由植物凝集素和A頂-V培养基组成，其用量的质量 体积配比为：10~20mg植物凝集素/LA頂-V培养基，优选15mg植物凝集素/LA頂-V培养 基；
[0081] 所述的植物凝集素为植物血球凝集素，它具有凝集红血球，促进淋巴球（主要是T 细胞）的幼化和分裂的作用，诱导T细胞释放γ-干扰素。用于测试样本时作为阳性对照， 可向美国Sigma公司购买，商品名：外源凝聚素（菜豆），货号：L9017 ;
[0082] (6)所述的γ-干扰素质控品，为高浓度重组人γ-干扰素溶液和低浓度重组人 γ -干扰素溶液，所述的高浓度重组人γ -干扰素溶液，重组人γ -干扰素的含量为100~ 400pg/mL，所述的低浓度重组人γ -干扰素，重组人γ -干扰素的含量为25~lOOpg/mL ; 所述的γ-干扰素质控品用于γ-干扰素的定量计算，来评估试剂的有效性；
[0083] 本发明所述的结核T细胞释放γ -干扰素检测试剂盒，利用了刺激T细胞释放 γ -干扰素试验为基础、结合光激发光技术与纳米微球技术，采用双抗体夹心法，通过侧向 流免疫层析进行检测，可用于定量检测血浆样本中结核T细胞释放γ -干扰素的含量，从而 定性判断是否感染结核分枝杆菌，使用方法：
[0084] (1)用肝素抗凝的真空采血管，采集不少于4mL的全血标本，1. 5~2. 5小时内按 ImL/管分别分装到"1^"、"？"、"1'"培养管中，使全血标本与培养管内容物混匀后，35~371€ 培养20~24小时，培养过程中保持培养管直立；
[0085] (2)培养后的"N"、"P"和"T"培养管，以3000~5000转/分钟离心5~15分钟， 优先选择10分钟；
[0086] (3)分别从1"、叩"、"1'"培养管中，等量取出血衆，取样范围为1〇-10〇111，优选 50ul ;分别等量将血浆滴加入3支结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液管中，充分混 匀，并反应5-30分钟，优选15分钟，同时依次对结核T细胞释放γ -干扰素检测微粒溶液 管进行"Ν"、"Ρ"、"Τ"标记；
[0087] (4)反应结束后再进行取样，取样范围可为30-lOOul，优选70ul ;等量取出血浆与 结核T细胞释放γ -干扰素检测微粒悬浮液的混合液，分别等量将混合液滴加入3块结核 T细胞释放γ -干扰素检测试剂卡的加样孔中，并再反应10-60分钟，优选30分钟，同时依 次对结核T细胞释放γ -干扰素检测试剂卡进行"Ν"、"Ρ"、"Τ"标记；
[0088] (5)将反应好的检测试剂卡按照，"、叩"/'广的顺序分别插入含有丫-干扰素标 准曲线的荧光免疫定量分析仪中进行检测，仪器的激发光照射在检测试剂卡上，并测量每 个检测试剂卡发光光子量获得光信号值，仪器上会显示"阳性"、"阴性"、"不确定"三种结果 中的一个；
[0089] 荧光免疫定量分析仪检测到检测试剂卡发射光的信号值，根据机内的标准曲线得 出γ-干扰素的含量，不同厂家生产的荧光免疫定量分析仪，γ-干扰素的标准曲线输入方 式或设定方式也不同，可根据不同厂家生产的荧光免疫定量分析仪的说明书确定；
[0090] 上述步骤中，将反应好的结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂卡按照"Ν"、"Ρ"、"Τ" 的顺序分别插入荧光免疫定量分析仪中进行检测，仪器根据γ-干扰素的标准曲线首先获 得的是检测试剂卡1"、，"、"1'"相应的反应数据，仪器中的程序再对1"、，4"、"1'4"、 "Ν/4"的值进行分析，再根据下表中的判断方法，得出样本是否感染结核分枝杆菌的结果， 仪器上会显示"阳性"、"阴性"、"不确定"三种结果中的一个，不同厂家生产的荧光免疫定量 分析仪生成结果的方式也可不同。
[0092] 因选择微粒粒径大小不同、发光量不同、微粒表面官能团不同、微粒发射光波段不 同，会造成检测结果有小范围的差异，但分析方法与上述分析方法一致，分析方法表格中的 数据可进行适当的调整。
[0093] 本发明的技术原理：
[0094] 本发明的结核T细胞释放γ -干扰素的检测试剂盒，是通过结核分枝杆菌特异性 混合多肽ESAT-6、CFP-10作为特异性抗原刺激感染了结核分枝杆菌的机体中具有免疫活 性的T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN- γ，并结合光激发光免疫技术来检测IFN- γ的 浓度来诊断结核感染。光激发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测 定的方法，该技术整合了高分子微球技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研 究。
[0095] 其次利用结核T细胞释放γ -干扰素检测微粒悬浮液灵敏度较高的特点，与样品 充分混匀反应，样品中释放γ-干扰素可被轻易捕捉到。再结合侧向流免疫层析技术具有 操作简单、反应快速的优点，将反应好的结核T细胞释放γ -干扰素检测微粒悬浮液与样本 的混合液滴加入结核T细胞释放γ -干扰素检测试剂卡测试孔，被包被在硝酸纤维膜测试 线上的鼠抗γ -干扰素单克隆抗体捕捉到，结核T细胞释放γ -干扰素检测微粒悬浮液发 光微粒与血浆样品中的γ -干扰素都留在了硝酸纤维膜测试线上，再通过荧光免疫定量分 析仪对硝酸纤维膜测试线、质控线上发光微粒的发光强度进行检测得出结果，发光微粒的 发光强度和样本中的γ-干扰素含量成正比。
[0096] 本发明的有益效果是：
[0097] 荧光免疫定量分析法通过引入光激发光技术与纳米微球技术，不仅成功的解决了 以上试剂盒操作复杂，对技术人员要求高的缺点，并且缩短了检测时间，灵敏度、特异性较 尚的优点。
【附图说明】
[0098] 图1为