性剂，诸如皂苷。去污剂导致 在细胞膜上形成大量的孔洞。红细胞由于其独特的膜性质而对这种孔洞形成特别敏感，并 完全裂解，其内容物漏出到周围的液体中。固定剂的存在防止了白细胞的非故意裂解。血 小板也保持未裂解状态。这个步骤的目的是从混合物中去除红细胞，因为它们以约1000:1 的比例远远超过白细胞的数目。血小板不干扰成像，因此与该过程无关。裂解缓冲液还含 有已知浓度的10 μ M非荧光微珠。
[0148] 温育5分钟后，该器皿再次以1200x g离心3分钟。通过移液管端头吸取上清液， 去除红细胞伪影和其他细胞残渣，并将其放置在筒匣中的废物区域内。在细胞沉淀物中存 在约15微升具有压积的白细胞的液体。
[0149] 为了确定细胞沉淀物中存在的白细胞数目的粗略近似值，移液管首先使白细胞在 器皿内进行重悬浮，继而吸取液体，将其转移至设备中的分光光度计。用波长为632nm的光 照射白细胞悬浮液，该波长是alexa fluor 647染料和DRAQ5?的激发波长。该细胞悬 浮液发射的光通过650nm长通滤光器滤过，并在分光光度计内进行测量。将该测量值与以 前生成的校准曲线相关联，以估计出该细胞悬浮液中白细胞的粗略浓度。通常，细胞浓度在 约1000个细胞/微升到100, 000个细胞/微升的范围内。使用该估计值计算适当的稀释 因数以确保容槽中的细胞浓度被限制在预先限定的目标浓度上下两倍的范围内。这个步骤 的目的是确保细胞在容槽上不会以过高或过低的密度存在。如果细胞密度过高，图像处理 算法的准确性会受到损害，而如果细胞密度过低，则会采集到数目不足的细胞。
[0150] 基于在上述步骤中计算出的稀释因数，将包含标记的抗⑶45 (泛白细胞标记物）、 CD16 (嗜中性粒细胞标记物）和CD123 (碱性粒细胞标记物）的抗体的稀释剂添加至细胞悬 浮液中并进行混合。
[0151] -旦与容槽承载体复合的容槽被置于容槽承载体区块上，就将10微升重悬浮于 细胞计数缓冲液中的白细胞混合物加载至该容槽的两个通道中的每一个内。将该混合物加 载至容槽通道内后，移液管从筒匣中的器皿内吸取10 μ 1矿物油，并将一滴矿物油滴在容 槽中加载有白细胞的两个通道的两个开放末端上。
[0152] 接下来，设备水平的样品处理装置与容槽承载体/容槽组合相接合，并将该容槽 承载体/容槽组合从包含筒匣的模块传送至该设备的细胞计数模块。在该细胞计数模块 处，设备水平的样品处理装置将容槽承载体/容槽组合放置在细胞计数模块的显微镜载物 台上。将容槽承载体/容槽放置在显微镜载物台上之后，如以上对于RBC/血小板混合物所 述，对包含白细胞的容槽的两个通道进行成像。
[0153] 白细胞的暗视野图像用于对视野内的细胞数进行计数（如图IA所示）。细胞表 面标记物用来确定图像中单个白细胞的细胞类型；例如，CD14标记单核细胞；CD123标记嗜 碱性粒细胞；⑶16标记嗜中性粒细胞；⑶45-AF647用来标记所有的白细胞（图IB-图1Ε)。 细胞核染色剂DRAQ5_i用来标记细胞核，因此将有核细胞（如白细胞）与没有细胞核的 成熟红细胞区分开来。
[0154] 此处使用的图像处理算法采用细胞的荧光图像，利用适应性取阈和边缘检测的组 合对其进行检测。基于局部强度和强度梯度，在每个细胞周围创建感兴趣区域（RoI)。使用 暗视野图像，还鉴别样品中的微珠，并在微珠周围创建RoI边界。对每个视野中的所有RoI 进行计数，并计算其在该视野的每幅图像中的强度。由该图像处理算法输出的信息由每个 RoI的形状或形态学测量值以及荧光和暗视野强度组成。该信息使用统计方法分析以将每 个物体分类为淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或微珠。基 于不同类型的细胞的计数、对应的微珠计数和在样品处理过程中使用的稀释比例，计算出 每微升原始全血中细胞的绝对浓度。这对所有白细胞和每个亚型进行计算，并报告为绝对 浓度（每微升的细胞数）和比例（％)。
[0155] 这类测量结果的图像和图形的示例呈现在图1、图2和图3中。
[0156] 图1显示来自全血样品的血细胞的代表性图像；这些图像是使用不同的成像技术 和染色拍摄的。图IA所示的图像是使用暗视野照射拍摄的全血中的细胞的图像。图IB 所示的图像拍摄自来自全血的细胞，示出了来自用PACBlue染料标记的抗-CD14抗体的荧 光；发荧光的细胞为单核细胞。图IC所示的图像拍摄自来自全血的细胞，示出了用PECy5 染料标记的抗-CD123抗体的荧光；发荧光的细胞为嗜碱性粒细胞。图ID所示的图像拍摄 自来自全血的细胞，示出了用PE染料标记的抗-CD16抗体的荧光；发荧光的细胞为嗜中性 粒细胞。图IE所示的图像拍摄自来自全血的细胞，示出了用AF647染料标记的抗-CD45 抗体的荧光；所有白细胞均在这些条件下发荧光。图IF所示的图像拍摄自来自全血的、用 DRAg5_l(对细胞核进行染色的细胞。因此，白细胞和血小板在这些条件下被染色并且发 荧光，但红细胞（缺乏细胞核）没有被染色并且不发荧光。
[0157] 图2示出了全血细胞中的细胞类型的代表性合成图像，它来自由根据本文公开的 方法获得的图像。图中示出了单核细胞（在图的左上象限内标记并可见，具有被蓝紫色环 围绕的微红色中心）、淋巴细胞（在图的中央标记并可见，具有被暗红色环围绕的亮红色中 心）、嗜酸性粒细胞（在图的左下象限内标记并可见，具有被红色边界围绕的绿色中心）和 嗜中性粒细胞（在图的右下象限内标记并可见，具有被黄绿色边界围绕的绿色中心）的图 像。
[0158] 对这类血液样品中发现的各种细胞类型进行鉴别和量化是有意义的。可能有多种 方法来进行这样的分类过程，在一些实施方式中，该分类过程可以被认为是多维分类的一 个统计学问题。应当理解，在本领域中有众多的方法可用于解决这些类型的分类问题。以 下提供了这类分析的一个特定实施方式。
[0159] 图3示出了通过该实施例中描述的细胞计数测定来鉴别并量化的各种细胞类型 的标绘图。图3A示出了按照标志物FL-17的强度相比于标志物FL-9的强度的斑点（细胞） 标绘图，用以鉴别单核细胞。图3B示出了按照标志物FL-19的强度相比于标志物FL-15的 强度的斑点（细胞）标绘图，用以鉴别嗜碱性粒细胞。图3C示出了按照标志物FL-15的强 度相比于标志物FL-Il的强度的斑点（细胞）标绘图，用以鉴别淋巴细胞。图3D示出了按 照标志物FL-15的强度相比于标志物FL-9的强度的点型（细胞）标绘图，用以鉴别嗜中性 粒细胞和嗜酸性粒细胞。
[0160] 对单核细胞的初始鉴别（9. 6%，如图3A所示）用来指导后续对嗜碱性粒细胞的鉴 别（0. 68 %，如图3B所示）。如图3A和3B所示对单核细胞和嗜碱性粒细胞的鉴别用来指 导后续对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的鉴别（WBC中68%为嗜中性粒细胞，3. 2%为嗜酸 性粒细胞，如图3D所示）。最后，如图3C所示鉴别淋巴细胞（图3D中绘出93%的WBC，对 应于原始样品中18%的细胞）。
[0161] 本发明的方法与其他方法有良好的相关性。使用m)TA抗凝的全血获得白细胞、 红细胞和血小板的计数。进一步对白细胞进行计数，以确定样品中嗜中性粒细胞、单核细 胞和淋巴细胞的数目。在图9中所示的测量中，EDTA抗凝的全血样品被分成2份，一份样 品使用本文公开的方法在本文公开的系统上运行。另一份样品在Abbott CELL-DYN Ruby System (Abbott Diagnostics, Lake Forest, IL, USA)上运行，这是一种商品化的多参数自 动血液分析仪。用两种方法获得的结果的比较显示于图4中。
[0162] 如图4A-4C所示，通过本发明方法所测得的白细胞（"WBC"，图4A)、红细胞（"RBC"， 图4B)和血小板（图4C)数目与通过其他方法对本发明方法所分析的相同样品的相应整分 试样所测得的WBC、RBC和血小板数目有良好的相关性。如图4D-4F所示，通过任一方法所 测得的嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞数目非常近似，并且彼此之间有良好的相关性。
[0163] 尽管上文是对本文所描述的优选实施方式的完整描述，但有可能使用各种替代、 修改和等同物。因此，不应当只参考以上描述而确定本发明的范围，而是应当参考所附权利 要求书，连同其等同物的全部范围一起来确定本发明的范围。无论优选与否的任何特征均 可与无论优选与否的任何其他特征相组合。所附权利要求书不应被解释为包括装置加功能 的限定，除非这样的限定在给定的权利要求中使用短语"用于…的装置"而被明确阐述。应 当理解，如本文的描述和随后的权利要求书全文中所使用，"一个"、"一种"和"该"等的含义 包括复数指代对象，除非上下文另有明确规定。另外，如本文的描述和随后的权利要求书全 文中所使用，"之中"的含义包括"之中"和"之上"，除非上下文另有明确规定。最后，如本文 的描述和随后的权利要求书全文中所使用，"和"和"或"的含义同时包括结合的和分离的， 并且可以互换地使用，除非上下文另有明确规定。因此，在使用术语"和"和"或"的上下文 中，这样的连接词的使用不排除"和/或"的含义，除非上下文另有明确规定。
[0164] 本文档包含受到版权保护的材料。版权所有者（本文的申请者）不反对对专利文 件和公开内容的摹本复制，因为它们出现于美国专利商标局专利文件或记录中，但除此之 外保留任何所有的版权。以下声明应当适用：Copyright 2013-2014 Theranos, Inc.。
【主权项】
1. 一种在装置中测试生物样品的方法，包括： 在所述装置中进行针对所述生物样品中的分析物的初始测定，由此获得初始结果，其 中所述初始测定可以提供指示出在所述生物样品中未检测到所述分析物的存在或检测到 所述分析物的存在处于正常水平的阴性结果，或者可以提供指示出在所述生物样品中检测 到所述分析物的存在或检测到所述分析物的存在处于异常水平的阳性结果；以及 视所述初始结果而确定所述生物样品的进一步测试，其中如果所述初始结果是阴性 的，则不对所述生物样品进行进一步测定；而其中如果初始结果是阳性的，则在所述装置中 对所述生物样品进行进一步测定。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述进一步测定包括选自由基于抗体的测定、核 酸测定、普通化学测定和细胞计数测定组成的测定类型组的类型的测定。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述进一步测定包括与所述初始测 定不同类型的测定。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中要通过所述进一步测定检测的分析 物包括与通过所述初始测定检测的所述分析物不同的分析物。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述初始测定包括对分析物的测量， 而所述进一步测定包括细胞计数测定。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞计数测定包括对细胞的形态特性的测 量。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述对细胞的形态特性的测量包括对血液样品中 血细胞的形态特性的测量。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述初始测定包括使用检测器来获 得所述初始结果，其中所述检测器选自光学检测器、pH检测器、电化学检测器、温度传感器、 离子敏感电极、辐射检测器和其他检测器。9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述进一步测定包括使用检测器来 获得进一步结果，其中所述检测器选自光学检测器、pH检测器、电化学检测器、温度传感器、 离子敏感电极、辐射检测器和其他检测器。10. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述进一步测定包括对于所述分析 物的检测比所述初始测定更灵敏的测定。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括选自以下各 项的样品：血液、血清、血浆、咽喉拭子、鼻拭子、鼻咽冲洗液、唾液、尿液、胃液、脑脊髓液、泪 液、粪便、粘液、汗液、耳垢、油、腺体分泌物、精液、阴道分泌物、来源于肿瘤组织的组织液、 眼液、呼吸物、毛发、指甲、皮肤、活检组织、胎盘液、羊水、脐带血、淋巴液、腔液、痰、脓、微生 物群、胎粪、乳汁以及其他分泌物或排泄物。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中对单一生物样品的不同部分进行 所述初始测定和所述进一步测定。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述单一生物样品的所述不同部分中的至少一 个部分包括稀释的生物样品。14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中对不同生物样品进行所述初始测 定和所述进一步测定。15. 根据权利要求15所述的方法，其中所述不同生物样品各自是相同类型的生物样 品。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述不同生物样品中的每一个是血液样品。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述不同生物样品中的每一个是不同的血液部 分。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述血液部分选自全血、血清和血浆。19. 根据权利要求15所述的方法，其中所述不同生物样品各自是不同类型的生物样 品。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述不同类型的生物样品选自由以下各项组成 的生物样品类型组：血液、血清、血浆、咽喉拭子、鼻拭子、鼻咽冲洗液、唾液、尿液、胃液、脑 脊髓液、泪液、粪便、粘液、汗液、耳垢、油、腺体分泌物、精液、阴道分泌物、来源于肿瘤组织 的组织液、眼液、呼吸物、毛发、指甲、皮肤、活检组织、胎盘液、羊水、脐带血、淋巴液、腔液、 痰、脓、微生物群、胎粪、乳汁以及其他分泌物或排泄物。21. 根据权利要求1所述的方法，其中从在所述装置内接受由所述进一步测定测试的 所述生物样品时起的短时间内进行所述进一步测定。22. 根据权利要求21所述的方法，其中分别对相同生物样品的至少一部分进行所述初 始测定和所述进一步测定。23. 根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中在获得所述初始测定的结果之后 获得进行所述进一步测定所针对的所述生物样品。24. 根据权利要求23所述的方法，其中如果在装置中进行的所述初始测定的结果是阳 性的，则从在所述装置内接受样品时起的短时间内在所述装置中对所述生物样品进行进一 步测定，其中所述短时间是在进行所述进一步测定之前的时间。25. 根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述短时间选自由以下各项组 成的短时间的组：约3小时或更少；约2小时或更少；约1小时或更少；约50分钟或更少； 约45分钟或更少；约40分钟或更少；约35分钟或更少；约30分钟或更少；约25分钟或更 少；约20分钟或更少；约15分钟或更少；约10分钟或更少；约5分钟或更少；约4分钟或 更少；约3分钟或更少；约2分钟或更少；以及约1分钟或更少。26. -种用于测试生物样品的装置，其中所述装置被配置用于根据权利要求1至25中 任一项所述的方法来进行初始测定和进一步测定。27. 根据权利要求26所述的用于测试生物样品的装置，其中所述进一步测定包括细胞 计数测量。28. 根据权利要求27所述的用于测试生物样品的装置，其中所述细胞计数测定包括对 细胞的形态特性的测量。29. 根据权利要求26、27或28所述的用于测试生物样品的装置，其中所述生物样品包 括血液样品。30. -种用于测试生物样品的系统，其包括根据权利要求26至29中任一项所述的装 置。31. 根据权利要求27所述的用于测试生物样品的系统，其中所述生物样品包括血液样 品。32. -种在装置中测试生物样品的方法，包括： 在所述装置中进行针对所述生物样品中的分析物的初始测定，由此获得初始结果，其 中所述初始测定可以提供指示出在所述生物样品中未检测到所述分析物的存在或检测到 所述分析物的存在处于正常水平的阴性结果，或者可以提供指示出在所述生物样品中检测 到所述分析物的存在或检测到所述分析物的存在处于异常水平的阳性结果； 进行所述生物样品的进一步测试，其中无论所述初始测定的结果如何，都在所述装置 中对所述生物样品进行进一步测定；以及 视所述初始测定的结果而报告所述生物样品的所述进一步测定的结果。33. 根据权利要求32所述的方法，还包括报告所述初始测定的结果。34. 根据权利要求32或33所述的方法，其中如果所述初始测定提供了阴性结果则不报 告所述进一步测定的结果，并且其中如果所述初始测定提供了阳性结果则报告所述进一步 测定的结果。35. 根据权利要求32或33所述的方法，其中如果所述初始测定提供了阳性结果则不报 告所述进一步测定的结果，并且其中如果所述初始测定提供了阴性结果则报告所述进一步 测定的结果。36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述进一步测定是针对与所述初始测定相同的 分析物的测定，并且其中所述进一步测定是比所述初始测定更灵敏的测定。37. 根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中在获得所述初始测定的结果之前 获得进行所述进一步测定所针对的所述生物样品。38. 根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中对相同生物样品的部分进行所述 初始测定和所述进一步测定。39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述生物样品的所述部分中的至少一个部分是 所述生物样品的稀释的部分。40. 根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述进一步测定包括选自由基于 抗体的测定、核酸测定、普通化学测定和细胞计数测定组成的测定类型组的类型的测定。41. 根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述进一步测定包括与所述初始 测定不同类型的测定。42. 根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中要通过所述进一步测定检测的分 析物包括与通过所述初始测定检测的所述分析物不同的分析物。43. 根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述初始测定包括对分析物的测 量，而所述进一步测定包括细胞计数测定。
【专利摘要】本发明提供了用于分析生物样品的方法、装置和系统。通过初始测定可以分析生物样品中分析物的存在，而后续测定的进行或进行的方法可以视所述初始测定的结果而定。例如，以下各项可以视先前测定的结果而定：是否进行后续测定；进行哪个后续测定；进行后续测定的方法；进行一系列后续测定的顺序；在后续测定中进行的步骤或步骤的顺序；进行后续测定的时机；在后续测定中使用的试剂的选择；在后续测定中使用的检测方法；以及测定的其他可以视先前测定的结果而定的详情。
【IPC分类】C12M3/00, G06M11/02, G01N33/48
【公开号】CN105264374
【申请号】CN201480030776
【发明人】D·杨, E·A·霍姆斯
【申请人】赛拉诺斯股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年3月27日
【公告号】CA2907504A1, EP2979089A1, EP2979089A4, WO2014160891A1