联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
[0023]基于上述制备的试剂，本发明用于检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒包括如下材料:
(1)96孔酶标板XI块；
(2)标准液X6 瓶:(lmL/瓶)0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb ；
(3)酶标抗体工作液7 mL ；
(4)底物液A7 mL ；
(5)底物液B7 mL ； (6)终止液7 mL ；
(7)20 X浓缩洗涤液20 mL;
使用本试剂盒时的注意事项:
(1)室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20?25°C)会导致所有标准的OD值偏低；
(2)在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作；
(3)每加一种试剂前需将其摇匀；
(4)反应终止液为2M盐酸,避免接触皮肤；
(5)不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂；
(6)储存条件:保存试剂盒于2?8°C，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；
(7)试剂变质的迹象:发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630 nm)值小于0.5(A450 nm〈0.5)时，表示试剂可能变质，请勿使用；
(8)该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
[0024]本发明盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒在检测猪尿样品中的盐酸赛庚啶残留量中的应用:
本发明的试剂盒用于检测猪尿样本中的盐酸赛庚啶残留量时，通过以下步骤实施:样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。
[0025](1)样品预处理
取待检尿样，若样品比较混池时，可5000 r/min以上，离心5 min或过滤。
[0026](2)用本发明试剂盒进行检测猪尿样品中盐酸赛庚啶残留量
取包被有盐酸赛庚啶抗原的酶标板，加标准品/样本50 μ?7孔到对应的微孔中；加入酶标抗体工作液，50 μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min;小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 μ?7孔，充分洗涤4次，浸泡15-30 s，用吸水纸拍干；加入底物液A 50 μ?ν孔，底物液B 50 μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15 min;加入终止液50 μ?7孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中的盐酸赛庚啶的残留量。
[0027](3)分析结果
用上述制备的试剂盒中的6个盐酸赛庚唆标准品浓度0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9ppb、2.7 ppb、8.1 ppb,在 450/630 nm 处测量吸光度值。
[0028]百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即:
百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B。一0 ppb标准溶液的平均吸光度值。
[0029]以标准品百分吸光率为纵坐标，以盐酸赛庚啶标准品浓度(ppb)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线见附图1。Y= - 18.550Χ+99.32，R2=0.9967。将样本的B/B。值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中盐酸赛庚啶的实际浓度。
【主权项】
1.检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，包括酶标板、盐酸赛庚啶标准品、盐酸赛庚啶酶标抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。2.检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤:酶标板的制备、盐酸赛庚啶标准品的制作、盐酸赛庚啶单克隆抗体及酶标抗体工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。3.根据权利要求2所述盐酸赛庚啶的检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，其特征在于:所述的盐酸赛庚啶包被抗原是将盐酸赛庚啶半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将盐酸赛庚啶抗原稀释成1:40000比例，100 μ?7孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25。。)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。4.根据权利要求2所述盐酸赛庚啶的检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，其特征在于:所述的盐酸赛庚唆标准品浓度分别为0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1ppbo5.根据权利要求2所述盐酸赛庚啶的检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，其特征在于:所述的盐酸赛庚啶酶标抗体工作液的制备:采用辣根过氧化酶偶联盐酸赛庚啶单克克隆抗体所得到，该酶标抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:20000。6.根据权利要求2所述盐酸赛庚啶的检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，其特征在于:所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。7.权利要求2所述的检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，基于抗原抗体进行直接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤: (1)预处理待测样品； (2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀； (3)取包被有盐酸赛庚啶抗原的酶标板，加标准品/样本50μ?7孔到对应的微孔中； (4)加入酶标抗体工作液，50μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ； (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μ?7孔，充分洗涤4次，浸泡15-30 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)； (6)加入底物液A50 μ?ν孔，底物液B 50 μ?ν孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15 min ； (7)加入终止液50μ?/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)； (8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中盐酸赛庚啶的含量。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品: 取待检猪尿，若样品比较混池时，可5000 r/min以上，离心5 min或过滤。
【专利摘要】本发明为一种用于检测盐酸赛庚啶的酶联免疫试剂盒的制备，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被了盐酸赛庚啶抗原的酶标板、盐酸赛庚啶标准品、盐酸赛庚啶酶标抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。盐酸赛庚啶检测试剂盒的原理是固相直接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标抗体工作液加入对应的酶标孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里将会出现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色，显色的深浅与标准品或样品中盐酸赛庚啶的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测猪尿样本中盐酸赛庚啶的含量。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105301245
【申请号】CN201410349742
【发明人】洪霞, 薛永来
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年7月22日