一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌（NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤，广东为高发区。鼻咽癌是指鼻咽粘膜 上皮发生的癌肿，大多为低分化鳞癌，其恶性度高，发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝和鼻咽 顶部者，早期症状不明显，因而难以早期发现，误诊误治率较高，可达12. 2%，因而在确诊的 鼻咽癌中，其5年生存率长期徘徊在50% - 60%左右。对鼻咽癌进行早期诊断以便早期治 疗，提高患者的生存率一直是NPC临床研究的重要课题之一。
[0003] 目前对鼻咽癌早期的检测方法有多种，包括有：EB病毒血清学标记物如病毒壳抗 原一免疫球蛋白A(EBVCA 21 gA )、EB病毒潜伏膜蛋白、EB病毒早期复合抗原（EBV 2-EA )IgG的抗体检测，鼻咽癌相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子、 CYFRA2121以及端粒酶等的检测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了 有用的信息，然而它们均缺乏足够的灵敏度与特异性。
[0004] NASG蛋白是一种分泌性蛋白（基因序列登录号：AF439448. 1)，在正常人及鼻咽部 慢性炎症患者的鼻咽组织中表达丰富，而在鼻咽癌患者的鼻咽组织中表达显著下调。因而 如何通过检测NASG蛋白的含量以及如何无创伤地获取NASG蛋白则是建立早期、无创伤检 测鼻咽癌的有效方法。
[0005] 核酸适体（Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革El标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技 术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)从人工合 成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核 酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子 识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有 很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速 的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异结合NASG的核酸适体及其试剂盒。
[0007] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15任一项所示的单链DNA。
[0008] 所述核酸适体与NASG蛋白具有较好的亲和能力。
[0009] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e) 将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0011] 所述核酸适体可用于制备检测NASG的试剂盒。
[0012] 利用本发明的核酸适体，可以捕获中鼻咽组织中的中的NASG，从而用于相关鼻咽 癌筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有 很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0013] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0014] 实施例1 NASG蛋白的获得 将AF439448. 1所示的NASG基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了相 应的目的多肽蛋白。
[0015] 实施例2核酸适体的筛选和制备 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下： 5 '-TAGCATGCAATGCCAGTATAG(N40)AACGTGCATGAACTATGAGT -3' ；N40 代表 40 个随机 核苷酸。
[0016] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75 μ g RNA 文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug NASG蛋白，37° C孵育 30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L醋酸铵，1.5mmol/L EDTA，0. 15% SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙 醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ I DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转 录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为 模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了 15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO: 1-15所示。具体序列如下所示： NASG-1 ： TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATATTCAAGATTTCTATAACACATTCAGATTCCAACATT AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID N0:1) NASG-2 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGATCGCAACTCCATCACGCATCCCTACTCTTATAGATCACC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :2) NASG-3 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCTCGAACGCACATTACATACATCTTAGTAATTATCTTTA AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :3) NASG-4 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTTCTTTCACATATTCGCAATACAACAAACCTCTGCCACA AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :4) NASG-5 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCATTATATTCTTATCCACGCCTCTATCTACACTCAAAGAA AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :5) NASG-6 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATCCTTACGCTCGCTCATTAATCACCACCTATAAATTCC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :6) NASG-7 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAAACAACTCAAGATAATCACTATTACAGAACAACAACT AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :7) NASG-8 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGATATAGATCATACAAATATATTATTCCGCCTACAATTCCA AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :8) NASG-9 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTTAATCAACGCATTACAAGACCTATAATTAACATAC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO :9) NASG-IO ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTACTCATCGCCTCTCCACCTACCGCCTATACTCTACTAC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:10) NASG-11 ： TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAATTTTCACTATTAACACCAATAATTAAGATAACGAAC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:11) NASG-12 ： TAGCATGCAATGCCAGTATAGAGACTCTATACATATATTCACTCTCCTTAATCAACAATTC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:12) NASG-13 ： TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTATAGACACTCTCAATTCCAGAATTAACCTCGCCTC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:13) NASG-14 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCACTTAATAATATTTCTCTTACGCTAATATATCCAACCC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:14) NASG-I5 ：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCTATATACACTATCACATTCCAGAATTAACCTCACCTCAC AACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:15) 实施例3蛋白结合适配子的性能测定 将适配子分别取2.0 μ g，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37° C消化lh，纯化回收去磷 酸化的RNA ;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P] ATP于去磷酸化的RNA分子末端。IOnmol 放射性标记的适配子分别与不同浓度（1_200ηΜ)的NASG 37° C孵育30min，各组反应液经 硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品 平行做两次测定。计算各个适配子与Ieptin
的解离常数。结果如下：
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A， COCH蛋白，NASG蛋白，与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不 与这些蛋白相结合，而只与NASG蛋白结合保持较高的特异性。
[0017] 将所述的适配子，取0. 2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置三周。通过 RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0018] 实施例5所述适配子疾病的诊断 取10个患者和2个正常人的鼻咽分泌物。生理盐水冲洗鼻腔，用细棉签在鼻视镜下插 到鼻咽部，放置5-8分钟，取出棉签，将棉球放入底部空心，外套有离心收集管的小离心管 中，在4摄氏度下7500g离心获取分泌物，使用生理盐水稀释，获得目标样本。
[0019] 将15个适配子分别与10个患者以及2个正常人的分泌物混合30min，通过生物素 分离，定量分析其中的NASG蛋白的含量，通过分析发现，10个鼻咽癌患者中NASG蛋白的含 量显著增加3倍以上。
[0020] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于鼻咽癌检测的试剂盒，其含有特异结合NASG蛋白的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列为SEQIDNo:1-15任 一项所述。3. -种检测鼻咽癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测鼻咽癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人NASG蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获鼻咽中的NASG蛋白，通过其含量的变化来检测鼻咽癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于鼻咽癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105319376
【申请号】CN201510748618
【发明人】张玲
【申请人】张玲
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月7日