一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测鼻咽癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人NASG蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获鼻咽中的NASG蛋白，通过其含量的变化来检测鼻咽癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于鼻咽癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。
【专利说明】
一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌(NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤，广东为高发区。鼻咽癌是指鼻咽粘膜上 皮发生的癌肿，大多为低分化鳞癌，其恶性度高，发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝和鼻咽顶 部者，早期症状不明显，因而难以早期发现，误诊误治率较高，可达12.2%，因而在确诊的鼻 咽癌中，其5年生存率长期徘徊在50%~60%左右。对鼻咽癌进行早期诊断以便早期治疗， 提高患者的生存率一直是NPC临床研究的重要课题之一。
[0003] 目前对鼻咽癌早期的检测方法有多种，包括有:EB病毒血清学标记物如病毒壳抗 原一免疫球蛋白A(EBVCA 21gA)、EB病毒潜伏膜蛋白、EB病毒早期复合抗原(EBV 2-EA)IgG 的抗体检测，鼻咽癌相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子、 CYFRA2121以及端粒酶等的检测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了 有用的信息，然而它们均缺乏足够的灵敏度与特异性。
[0004] NASG蛋白是一种分泌性蛋白（基因序列登录号:AF439448.1)，在正常人及鼻咽部 慢性炎症患者的鼻咽组织中表达丰富，而在鼻咽癌患者的鼻咽组织中表达显著下调。因而 如何通过检测NASG蛋白的含量以及如何无创伤地获取NASG蛋白则是建立早期、无创伤检测 鼻咽癌的有效方法。
[0005] 核酸适体(Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革E1标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体 的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功 能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优 良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透 组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物 检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异结合NASG的核酸适体及其试剂盒。
[0007] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1 -15任一项所示的单链DNA。
[0008]所述核酸适体与NASG蛋白具有较好的亲和能力。
[0009] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：
[0011] a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物；
[0012] b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物；
[0013] c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物；
[0014] d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物；
[0015] e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0016] 所述核酸适体可用于制备检测NASG的试剂盒。
[0017] 利用本发明的核酸适体，可以捕获中鼻咽组织中的中的NASG，从而用于相关鼻咽 癌筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有 很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0018]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0019]实施例1NASG蛋白的获得
[0020] 将AF439448.1所示的NASG基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了 相应的目的多肽蛋白。
[0021] 实施例2核酸适体的筛选和制备
[0022]设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下：
[0023] 5 '-TAGCATGCAATGCCAGTATAG(N40)AACGTGCATGAACTATGAGT-3 ' ；N40代表40个随机 核苷酸。
[0024] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75yg RNA文库经 硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugNASG蛋白，37 °C孵育30min，反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜;然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/ L醋酸铵，1.5mmo 1 /L EDTA，0.15 % SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重 新溶解于20ylDEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮 筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子 库，筛选共进行10轮。得到了 15个适配子，其序列分别为SEQ ID N0:1-15所示。具体序列如 下所示：
[0025] NASG-1 ：
[0026] TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATATTCAAGATTTCTATAACACATTCAGATTCCAACATTAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID N0:1)
[0027] NASG-2：
[0028] TAGCATGCAATGCCAGTATAGATCGCAACTCCATCACGCATCCCTACTCTTATAGATCACCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:2)
[0029] NASG-3：
[0030] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCTCGAACGCACATTACATACATCTTAGTAATTATCTTTAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:3)
[0031] NASG-4：
[0032] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTTCTTTCACATATTCGCAATACAACAAACCTCTGCCACAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:4)
[0033] NASG-5：
[0034] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCATTATATTCTTATCCACGCCTCTATCTACACTCAAAGAAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:5)
[0035] NASG-6：
[0036] TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATCCTTACGCTCGCTCATTAATCACCACCTATAAATTCCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:6)
[0037] NASG-7 ：
[0038] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAAACAACTCAAGATAATCACTATTACAGAACAACAACTAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:7)
[0039] NASG-8：
[0040] TAGCATGCAATGCCAGTATAGATATAGATCATACAAATATATTATTCCGCCTACAATTCCAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:8)
[0041 ] NASG-9：
[0042] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTTAATCAACGCATTACAAGACCTATAATTAACATACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:9)
[0043] NASG-10：
[0044] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTACTCATCGCCTCTCCACCTACCGCCTATACTCTACTACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:10)
[0045] NASG-11：
[0046] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAATTTTCACTATTAACACCAATAATTAAGATAACGAACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:11)
[0047] NASG-12：
[0048] TAGCATGCAATGCCAGTATAGAGACTCTATACATATATTCACTCTCCTTAATCAACAATTCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:12)
[0049] NASG-13：
[0050] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTATAGACACTCTCAATTCCAGAATTAACCTCGCCTCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:13)
[0051] NASG-14：
[0052] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCACTTAATAATATTTCTCTTACGCTAATATATCCAACCCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:14)
[0053] NASG-15：
[0054] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCTATATACACTATCACATTCCAGAATTAACCTCACCTCACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:15)
[0055] 实施例3蛋白结合适配子的性能测定
[0056] 将适配子分别取2.0yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射性 标记的适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的NASG37°C孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素 膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次 测定。计算各个适配子与leptin的解离常数。结果如下：
[0057]
_8]~实施例4所述适配子特异性分析k及稳定性分析 '
[0059]分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白 A，⑶CH蛋白，NASG蛋白，与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都 不与这些蛋白相结合，而只与NASG蛋白结合保持较高的特异性。
[0060] 将所述的适配子，取〇.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置三周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0061] 实施例5所述适配子疾病的诊断
[0062]取10个患者和2个正常人的鼻咽分泌物。生理盐水冲洗鼻腔，用细棉签在鼻视镜下 插到鼻咽部，放置5-8分钟，取出棉签，将棉球放入底部空心，外套有离心收集管的小离心管 中，在4摄氏度下7500g离心获取分泌物，使用生理盐水稀释，获得目标样本。
[0063] 将15个适配子分别与10个患者以及2个正常人的分泌物混合30min，通过生物素分 离，定量分析其中的NASG蛋白的含量，通过分析发现，10个鼻咽癌患者中NASG蛋白的含量显 著增加3倍以上。
[0064]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于鼻咽癌检测的试剂盒，其含有特异结合NASG蛋白的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体序列为SEQ ID N〇:6所述。3. -种检测鼻咽癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
【文档编号】G01N33/574GK105974133SQ201610608880
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年11月7日
【发明人】张玲
【申请人】张玲