一种分离和测定泊马度胺中间体有关物质的液相色谱法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，一种分离和测定泊马度胺中间体有关物质的液相色谱 法。
【背景技术】
[0002] 泊马度胺（pomalidomide)是美国Celgene制药公司开发的新型免疫调节剂，商品 名为Pomalyst。2013年2月8日，美国食品和药品监督管理局（FDA)批准该药由于治疗复 发性及难治性多发性骨髓瘤。
[0003] 泊马度胺中间体化学名为3-氨基邻苯二甲酸，分子式为CsH7N04，其结构式为：
[0004]
[0005] 在合成该化合物的过程中，有几步重要的杂质可能由于去除不完全而影响药物的 纯度和质量，对于泊马度胺中间体的合成主要控制的有关物质有3个，分别是有关物质1 : 3-aminophthalicanhydride、有关物质 2:4_amin〇-2-(1，3_diox〇-l, 3-dihydroisobenzo furan-4-yl)isoindoline-l, 3-dione、有关物质 3:3-(4 -amino-1, 3-dioxoisoindolin-2-y 1)phthalicacid,结构分别如下图由左至右所示：
[0006]
[0007]有关物质 1 (Impurityl)
[0008]
[0009]有关物质 2 (Impurity2)
[0010]
[0011]有关物质 3 (Impurity3)
[0012] 对于合成泊马度胺中间体引入的杂质在原料中是需要进行质量控制的，因此，实 现泊马度胺中间体及其有关物质的分离，在泊马度胺的合成及其质量控制方面具有重要的 现实意义。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于提供一种分析泊马度胺中间体化学纯度以及分离其有关物质 的方法，从而实现泊马度胺中间体与其有关物质的分离和测定，保证泊马度胺及含泊马度 胺制剂的质量控制。
[0014] 本发明的技术方案为：
[0015] -种液相色谱法分离测定泊马度胺中间体有关物质的方法，包括以下步骤：
[0016] (1)供试品洛液和对照品洛液的制备；
[0017] ⑵通过高效液相色谱测定检测所述供试品溶液和对照品溶液；
[0018] 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶（250X4. 0mm，5μm)为填充剂，以10: 90(v/v)的乙腈/磷酸缓冲液pH= 2. 6为流动相A,以90:10(v/v)的乙腈/磷酸缓冲液 pH= 2. 6为流动相B，梯度洗脱，柱温为25~40°C，优选30°C，流速为0. 8~1. 2ml/min，优 选1.OmL/min，检测波长为254nm。
[0019] 进一步地，所述供试品溶液和对照品溶液的制备包括：取泊马度胺中间体待测样 品，加溶剂制成浓度为lmg/ml的溶液，作为供试品溶液；量取所述供试品溶液，加溶剂制成 浓度为〇. 〇lmg/ml的溶液，作为对照溶液。
[0020] 进一步地，所述溶剂为体积比为50 :50的所述流动相A和流动相B。
[0021] 进一步地，所述梯度洗脱的条件为：以体积比计，0分钟时，流动相A为90%，流动 相B为10 % ;5分钟时，流动相A为90 %，流动相B为10 % ;35分钟时，流动相A为20 %， 流动相B为80 % ;36分钟时，流动相A为90 %，流动相B为10 % ;40分钟时，流动相A为 90%，流动相B为10%。
[0022] 进一步地,所述色谱柱为Kormasil色谱柱。
[0023] 本发明还进一步提供了所述方法在监控泊马度胺或含泊马度胺制剂的质量中的 用途。
【附图说明】
[0024] 图1是泊马度胺中间体样品的色谱图。
[0025] 其中，保留时间为2.319的色谱峰为有关物质Ulmpurityl)、保留时间为15.873 有关物质2(Impurity2)及保留时间为16. 358的色谱峰为有关物质3(Impurity3)。
【具体实施方式】
[0026] 通过以下实施例可以进一步理解本发明的优点和特点，不应该理解为是对本发明 范围的限制。
[0027] 以下实施例中所用仪器和试剂，除特殊说明以外均为普通市售。
[0028] 仪器与试剂
[0029] 仪器：Agilentl260series高效液相色谱仪。
[0030]色谱柱：C18(Kromasi1250*4. 6mm5μm)〇
[0031] 供试品：深圳海王药业有限公司生产的泊马度胺中间体（合成路线：3-硝基邻苯 二甲酸经钯碳加氢还原得3-氨基邻苯二甲酸，再与3-氨基-2,6-哌啶二酮缩合得到泊马 度胺）。
[0032] 试剂：色谱级乙腈（Merck公司），磷酸（分析纯）。
[0033] 溶剂：体积为（50 :50v/v)的流动相A和流动相B。
[0034]【实施例1】色谱条件与系统适用性的筛选
[0035] 1.1流动相pH值的选择
[0036] 选择流动相pH值为2. 0、2. 6和3. 0进行考察，最后确定流动相pH值为2. 6,流动 相pH值选择结果见表1。
[0037] 表1.流动相pH值选择结果
[0038]
[0039] 1.2流动相的选择
[0040] 参照相关文献并结合试验具体情况，先后选用乙腈-磷酸缓冲液（用磷酸调pH值 为2. 6)、乙腈-醋酸缓冲液（用磷酸调pH值为2. 6)，乙腈-甲酸缓冲液（用甲酸调pH值 为2. 6)、乙腈-TFA缓冲液
[0041](用TFA调pH值为2. 6)，各流动相条件下的分离效果如下（见表2
[0042] 表2.流动相选择结果
[0043]
[0044] 1· 3检测波长的选择
[0045] 选择检测波长值为240nm、247nm、250nm及254nm进行考察，最后确定检测波长为 254nm，检测波长选测结果见表3
[0046] 表3.检测波长选择结果
[0047]
[0048] 为了检出更多的杂质，以更好的控制泊马度胺中间体的质量，因此选择254nm为 泊马度胺中间体有关物质检测波长。
[0049] 1.4溶剂的选择
[0050] 1. 4. 1泊马度胺中间体在甲醇中的稳定性考察
[0051] 考察了泊马度胺中间体在甲醇溶液中稳定性，所配制溶液分别于0、1、2、4、8小时 注入液相色谱仪，测定结果见表4
[0052] 表4.溶剂选择选择结果
[0053]
[0054] 泊马度胺中间体在甲醇中不稳定，主峰逐渐降解成RRT:4. 64杂质，因此不能使用 甲醇作为溶解泊马度胺中间体的溶剂。
[0055] 1. 4. 2泊马度胺中间体在乙腈中的稳定性考察
[0056] 考察了泊马度胺中间体在乙腈溶液中稳定性，所配制溶液分别于0、1、2、8、12小 时注入液相色谱仪，测定结果见表5
[0057] 表5.溶剂选择选择结果
[0058]
[0059] 泊马度胺中间体（3-氨基邻苯二甲酸）在乙腈中比较稳定，相对保留时间为4.64 质峰面积逐渐增大。因此配成溶液后在1小时内进样。
[0060] 色谱条件的确定：经上述选择试验，确定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅 胶（250X4. 0mm，5μm)为填充剂，以乙腈/磷酸缓冲液pH= 2. 6 (10 :90)为流动相A，以乙 腈/磷酸缓冲液pH= 2. 6 (90:10)为流动相B，梯度洗脱，柱温为25°C，流速为lml/min，检 测波长为254nm;所述的梯度洗脱条件为：以体积比计，0分钟时，流动相A为90%，流动相 B为10% ;5分钟时，流动相A为90%，流动相B为10% ;35分钟时，流动相A为20%，流动 相B为80% ;36分钟时，流动相A为90%，流动相B为10% ;40分钟时，流动相A为90%， 流动相B为10%。
[0061]【实施例2】供试品溶液的制备
[0062] 称取泊马度胺中间体10mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤 过，取续滤液，即得。
[0063]【实施例3】泊马度胺中间体样品有关物质测定
[0064] 采用实施例2所述方法制备供试品溶液，称取泊马度胺中间体10mg，置10ml量瓶 中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶 液lml置100ml量瓶中，加溶剂至刻度，摇匀，作为对照溶液。在下列选定的色谱条件下：以 十八烷基硅烷键合硅胶（250X4. 0mm，5μm)为填充剂，以乙腈/磷酸缓冲液pH= 2. 6 (10 : 90)为流动相A，以乙腈/磷酸缓冲液pH= 2. 6 (90:10)为流动相B，梯度洗脱，柱温为25°C， 流速为lml/min，检测波长为254nm;理论板数按泊马度胺中间体3-氨基邻苯二甲酸峰计算 应不低于2000,主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1. 5。精密量取对照溶液10μ1注入液 相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10~20 %，再精密量取供试 品溶液10μ1注入液相色谱仪，记录色谱图至泊马度胺中间体3-氨基邻苯二甲酸峰保留时 间的10倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液 主峰面积的6倍（6%)。HPLC结果显示，泊马度胺中间体3-氨基邻苯二甲酸的保留时间为 3. 4min，如图1所示。分别对三个批次（20140301、20140401、20140501)的泊马度胺中间体 进行测定，其中，泊马度胺中间体有关物质的测定结果如下表6所示。
[0065] 表6.泊马度胺中间体有关物质测定结果
[0066]
【主权项】
1. 一种液相色谱法分离测定泊马度胺中间体有关物质的方法，包括以下步骤： (1) 供试品洛液和对照品洛液的制备； (2) 通过高效液相色谱测定检测所述供试品溶液和对照品溶液； 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶（250X4.Omm，5μm)为填充剂，以10 :90 的乙腈/磷酸缓冲液pH= 2. 6为流动相A，以90:10的乙腈/磷酸缓冲液pH= 2. 6为流 动相B，梯度洗脱，柱温为25~40°C，流速为0. 8~1. 2ml/min，检测波长为254nm。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液和对照品溶液的制备包括： 取泊马度胺中间体待测样品，加溶剂制成浓度为lmg/ml的溶液，作为供试品溶液；量取所 述供试品溶液，加溶剂制成浓度为〇. 〇lmg/ml的溶液，作为对照溶液。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述溶剂为体积比为50 :50的所述流动相A 和流动相B。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温为30°C，流速为1.OmL/min。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：以体积比计，0分钟 时，流动相A为90%，流动相B为10% ;5分钟时，流动相A为90%，流动相B为10% ;35分 钟时，流动相A为20 %，流动相B为80 % ;36分钟时，流动相A为90 %，流动相B为10 % ; 40分钟时，流动相A为90 %，流动相B为10 %。6. 如权利要求1所述的分方法，其特征在于，所述色谱柱为Kormasil色谱柱。7. 如权利要求1所述的方法在监控泊马度胺或含泊马度胺制剂的质量中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种液相色谱法分离测定泊马度胺中间体有关物质的方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液和对照品溶液的制备；(2)通过高效液相色谱测定检测所述供试品溶液和对照品溶液；其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以10：90的乙腈/磷酸缓冲液pH＝2.6为流动相A,以90:10的乙腈/磷酸缓冲液pH＝2.6为流动相B，梯度洗脱，柱温为25～40℃，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长为254nm。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105334270
【申请号】CN201410305848
【发明人】胥娜, 刘碧秀, 朱丹, 刘小柔, 高媛, 王彦青
【申请人】深圳海王药业有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年6月30日