化，用核酸/蛋白分析仪检测蛋白浓度，并用50mmol/LPBS(pH7. 2)将其蛋白浓度调 至 lmg/mL〇
[0038] 8、间接ELISA评价VSVN蛋白免疫学活性。用基因表达的VSV重组N蛋白包被 ELISA板，建立间接ELISA抗体检测方法。具体操作方法如下：
[0039] ①、用包被液（ρΗ9· 6碳酸缓冲液）将纯化的重组蛋白稀释至5μ/mL，包被96孔 ELISA板，50μL/孔，于4°C放置过液。
[0040] @、弃去包被物，用？831'(20臟〇1/1?83+0.5%吐温20)洗3遍。加入浓度为10 8/ L的BSA溶液，250μL/孔，37°C封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗3遍。
[0041] ③、向ELISA板中加入阳性血清、阴性血清和待检血清，50μ!7孔，37°C，反应 30min〇
[0042] ④、用PBST洗3遍，加入1 :5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，50yL/孔，37°C， 反应30min。
[0043] ⑤、用PBST洗3遍，加入底物（ΤΜΒ+Η202) 50 μL/孔，室温避光反应lOmin。
[0044] ⑥、加入2mol/L H2S04溶液，50 μ L/孔，终止反应。
[0045] ⑦、于酶标仪读取D45(]nni值。
[0046] ⑧、根据检测样品0D450值进行结果判定：如果S/N>2,判定为阳性，S/N彡2,判定 为阴性。
[0047] 用间接ELISA方法检测羊抗VSV、FMDV(0型、A型和亚洲I型）、AKV、CPV阳性血 清及健康动物血清，结果检测VSV阳性血清时为阳性，检测其他病毒阳性血清和健康动物 血清时均为阴性。表明VSVN蛋白特异性良好。用间接ELISA检测10份系列稀释（1:4至 1:512)的VSV阳性血清时，结果表明检测极限为1 :64至1 :128之间。用ELISA检测VSV 高免血清时，检测极限达1:2048。
[0048] 实施例2 :胶体金标记试纸条的制备
[0049] 1、胶体金的制备及胶体金标记链球菌G蛋白（streptococcalproteinG，SPG): 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。向99mL三蒸水中加入lmL1 %氯金酸溶液，加热 至沸腾，迅速加入2. 5mL新鲜配制的1 % (m/v)柠檬酸三钠溶液，并充分混匀，继续加热煮 沸5min，溶液颜色由蓝色变为红色即可。冷却至室温后，用1 %碳酸钠溶液调胶体金溶液的 pH值为6. 5。向50mL胶体金溶液中缓慢地加入20μL浓度为lmg/mL的SPG溶液，室温搅 拌45min，缓慢加入浓度为10g/L卵白蛋白（0VA)至其终浓度为10mg/mL，继续搅拌30min。 4, 000r/min离心10min，将上清转移至另一离心管中，10, 000r/min离心30min，小心弃去上 清。用5mL(即1/10原体积）50mmol/LPBS(pH7.2)重悬沉淀。加入10% (w/v)的叠氮钠 (NaN3)溶液至终浓度为0· 02%。
[0050] 2、金标复合物垫的制备：用XYZ3050点样平台将胶体金标记的SPG溶液喷于 300mmX5mm玻璃纤维棉上，速度为50yL/cm，并于4°C真空抽干。
[0051] 3、兔抗SPGIgG的制备及IgG纯化：用SPG免疫2月龄家兔，每隔2周免疫1次， 共免疫3次，注射剂量分别为lmg/只、lmg/只和2mg/只。首免时加等体积弗氏完全佐剂乳 化，二免和三免时加等体积弗氏不完全佐剂乳化。三免后15d，颈静脉采血并分离血清，56°C 水浴作用30min。用蛋白A/G抗体纯化试剂盒（Pierce公司产品）从兔血清中纯化抗SPG IgG，用核酸/分析蛋白分析仪测定蛋白含量，用50mmol/LPBS(pH7. 2)稀释至2mg/mL。
[0052] 4、检测线和对照线的制备：首先将硝酸纤维素膜（35mmX300mm)粘贴于背衬 (70mmX300mm)正中表面，用基因工程表达的VSVN蛋白（lmg/mL)和兔抗SPGIgG(2mg/mL) 分别作为检测线和对照线试剂。用XYZ3050型试纸喷膜仪（BIODOT公司产品）将两种试 剂分别点在硝酸纤维膜上，点样量为〇. 5μL/cm。点样时，检测线位于硝酸纤维素膜中线， 对照线与检测线之间距离为5mm。37°C干燥2h，4°C密封保存备。根据点样速度和检测线试 剂及对照线试剂的浓度，得出检测线和对照线试剂包被量分别为0. 175μg/条和0. 35μg/ 条。
[0053] 5、试纸条的组装和切割：按图1所示，将背衬1和已点样检测线6和对照线7试剂 的硝酸纤维膜2、样品垫3、金标垫4、吸水垫5粘在一起，压实后，于CM4000切条机中，将其 切成3. 5mm宽的试纸条。
[0054] 6、试纸条的反应原理、结果判定标准和检测步骤：将胶体金标记的SPG固定于金 标复合物垫上，检测线为基因工程表达的VSVN蛋白，对照线为兔抗SPGIgG。检测时，血清 中的IgG与胶体金标记SPG结合，形成G-SPG-IgG复合物（G为胶体金），在吸水垫的作用 下，该复合物在硝酸纤维膜上向吸水垫端移动，若样品中含有VSV抗体，则VSV抗体会与检 测线上的VSVN蛋白特异性结合，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带，即检测线。若样品 中不含VSV抗体，则G-SPG-IgG复合物不与VSVN蛋白结合而继续向吸水垫端移动，与兔抗 SPGIgG结合，形成红色条带，即对照线。无论样品中是否含有VSV抗体，G-SPG-IgG复合物 均能与对兔抗SPGIgG结合，形成对照线。在判定结果时，若检测线和对照线同时显红色， 则为阳性，若检测线不显色，对照线显红色，则为阴性。若检测线和对照线均不显色或检测 线显红色且对照线不显色，均为无效结果，需更换试纸条重新检测。检测时，将试纸条平放 于实验台上，取100μL用50mmol/LPBS(ph7. 2)作10倍稀释的样品加于样品垫上，室温静 置反应，在15min内进行结果判定。
[0055] 实施例3 :试纸条的特异性、敏感性和符合率试验
[0056] 1、试纸条的特异性：用试纸条分别检测VSV标准阳性血清样品、其它相关病毒包 括0型、A型和亚洲I型口蹄疫病毒（FMDV)、赤羽病病毒（AKV)、、蓝舌病病毒（BTV)、牛病毒 性腹泻病毒（BVDV)和羊痘病毒（CPV)阳性血清样品及阴性对照样品。结果显示试纸条检测 VSV阳性血清样品时为阳性反应，检测其它病毒阳性血清及阴性对照样品时均为阴性，表明 试纸条特异性良好。
[0057] 2、试纸条的敏感性：用试纸条检测10份系列稀释的VSV阳性血清样品（编号为 1~10)，同时用ELISA和琼脂扩散试验（AGID)作对照。与ELISA相比，试纸条检测结果有 6份与ELISA检测结果一致，有3份比ELISA检测结果低一个滴度，有1份比ELISA检测结 果高1个低度。与琼脂扩散试验相比，试纸条检测结果比琼脂扩散试验检测结果高2~3 个滴度。详细结果见表1。
[0058] 表1三种方法检测抗体效价结果
[0059]
[0060] 3、临床样品检测：用试纸条和ELISA同时检测临床血清样品615份，结果如 下表。根据检测结果计算得出，与ELISA相比，试纸条特异性为99. 43 % (525/528)， 敏感性为98. 85 % (86/87)，试纸条和ELISA试剂盒检测结果之间的符合率为99. 35 % [(86+525) /615]。详细数据见表2 :
[0061] 表2:临床样品检测结果
[0062]
[0063] 以上实验结果表明，本发明提供的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原具有良好的特 异性，用其制成的胶体金试纸条特异性强，灵敏度高，与现有技术相比，该试纸条具有检测 快速、操作简便、不需要专门的仪器设备和专业技术人员。该试纸条易于保存和运输，使用 检测样品量少，检测成本较低，该试纸条的研制，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎 流行病学调查提供良好的检测手段，具有广阔的应用前景。
[0064] 本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明 的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发 明也意图包含这些改动和变形。
【主权项】
1. 一种水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述试纸条固定有水泡性 口炎病毒重组N蛋白抗原，所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的氨基酸序列为SEQID No. 1所示。2. 根据权利要求1所述的水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于：所述水 泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其基因的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。3. 根据权利要求1或2所述的水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于：所 述试纸条包括背衬和硝酸纤维膜、金标复合物垫、样品垫、吸水垫，所述硝酸纤维膜的上有 检测线，所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原垫是固定在检测线上。4. 根据权利要求3所述的水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于：所述检 测线，水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的包被量为0. 175μg/条。5. 根据权利要求1-4中任一条所述的水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在 于：所述硝酸纤维膜上还点有兔抗链球菌G蛋白IgG作为对照线。6. 根据权利要求5所述的水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于：所述对 照线，兔抗链球菌G蛋白IgG的包被量为0. 35μg/条。7. 根据权利要求6所述的水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于：所述对 照线与检测线之间距离为5mm。8. 根据权利要求7所述的水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于：所述试 纸条为经过切条机加工成7〇mmX3. 5mm的成品。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术和病毒抗体检测领域，具体地涉及一种水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条。一种水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条，所述试纸条固定有水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ？ID？No.1所示。将本发明的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原应用于制备快速检测水泡性口炎病毒抗体的试纸条，特异性好，灵敏度高，具有检测快速、操作简便，检测样品量少，检测成本较低等优点，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手段。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105372433
【申请号】CN201510664731
【发明人】杨俊兴, 孙洁, 连慧香, 花群义, 刘建利, 吕建强, 张彩虹, 林彦星, 曹琛福, 阮周曦
【申请人】深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年10月15日