Th9过继到正常小 鼠体内，结果发现除Th2细胞外，Thl、Thl7和Th9都能够诱发EAE。Thl细胞分化的转录因 子STAT4和T-bet对诱导EAE的发生也是必需的。在疾病恶化期，Thl细胞效应明显，产生 典型的Thl炎症反应。
[0063] 以往认为Thl/Th2失衡是导致多发性硬化的发病因素，而现在越来越多的证据 表明Thl7/Treg的失衡更能解释多发性硬化的发病。在MS病人的血和脑脊液中，存在着一 种或多种自身抗体与反应性T淋巴细胞；其外周血CD4+ CD25+细胞的Foxp3 mRNA与蛋白水 平均显著降低；与正常对照相比，在一定浓度的anti-⑶3抗体刺激下，来自MS的⑶4+⑶25+ T细胞抑制抗原特异性T细胞的增殖反应与免疫应答的能力均显著降低，Treg功能下降与 Foxp3表达降低密切相关。MS来源的⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞的抑制功能异常与疾 病病程相关，推测Treg可能参与疾病。此外，Treg可分泌一些抑制性细胞因子调节来间接 发挥免疫抑制作用，如IL-10和TGF-β均是天然Treg分泌的抑制性细胞因子之一，可以 抑制T细胞的增殖和抑制T细胞产生细胞因子。本实验进一步提示人类细胞因子CCDC134 基因或蛋白是通过上调Foxp3的转录水平，促进iTreg细胞的分化来抑制⑶4+ T细胞的增 殖，进而抑制EAE疾病的发展。
[0064] 实施例7 :利用EAE小鼠模型从分子和细胞水平探讨(XDC134在EAE发生发展中 的免疫学机制 7. 1形态学方法观察EAE发病模型中（XDC134转基因和正常对照小鼠的差别 方法：在EAE发病高峰期（第17~20天）处死小鼠，每组各取3只小鼠，经水合氯醛麻 醉后，取脊髓腰骶段石蜡包埋，5μπι连续切片，进行HE染色分析。蒸馏水冲洗，95%酒精 脱水，二甲苯透明，中性树胶封片保存。
[0065] 结果：如图10所示，与阴性对照鼠相比，转基因小鼠的脊髓浸润免疫细胞明显减 少，提示其发病较轻。
[0066] 7. 2脾脏、引流淋巴结和中枢神经系统中浸润免疫细胞分析 方法：在EAE发病高峰期(第17~20天)处死小鼠，每组各取5~7只（XDC134转基因和 阴性对照小鼠，进而分离小鼠脾脏免疫细胞、腹股沟引流淋巴结和中枢神经系统浸润的免 疫细胞，对于脾脏和腹股沟引流淋巴结，直接研磨，过150目筛网得到单细胞悬液并计数即 可置于冰上备用；而对于中枢神经系统浸润的免疫细胞分离，获得全部的脊髓，研磨过150目筛网得到单细胞悬液并计数。之后采用percoll密度梯度离心的经典方法从该悬液中分 离免疫细胞，用3mL 40%的percoll重悬，轻轻铺于3mL 60%的percoll之上；400g无刹车 离心30分钟，吸净淋巴细胞层的细胞，计数该层总细胞数，用PBS洗两遍置于冰上备用。
[0067] 细胞膜分子检测：加入200μL预冷的封闭液（5%FBS/PBS，v/v)，4°C封闭30min， 1800rpm离心5min，随后加入直标的抗体(抗体用量参照说明书)，4°C避光孵育30min;使用 相应IgG作为同型对照。最后用PBS洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest 软件对结果进行分析。
[0068] 细胞内分子检测：利用引流淋巴结单细胞悬液用PMA(100ng/mL)和ionomycin (1μΜ)刺激细胞6小时，提前两小时加入BFA(终浓度：10μg/mL)抑制细胞因子的分泌， 之后收获细胞，用冷的PBS洗涤两次，首先用4%多聚甲醛冰上固定30min;然后用打孔封 闭液室温孵育l〇min，1800rpm离心5min，弃上清，随后加入不同标记的抗体，4°C避光孵育 40min;使用相应IgG作为同型对照。最后用PBS洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使 用Cellquest软件对结果进行分析。
[0069] 细胞培养上清中细胞因子水平检测：利用引流淋巴结单细胞悬液铺板，用不同浓 度mM0G35-55多肽再次活化引流淋巴结免疫细胞，利用ELISA分析上清中细胞因子IL-17A，IFN-γ，IL-6的分泌情况。
[0070] 细胞因子mRNA水平检测：研磨对照小鼠和转基因小鼠脊髓组织(每组各3~5只小 鼠)，参照说明书提取总RNA，每个样品取5ug，逆转录合成单链cDNA文库。分别使用细胞 因子特异性引物进行PCR扩增；Gapdh作为内参。试剂PCRmasterMix购自PowerSYBR Green公司，引物由北京生工公司合成。通过7500HTFastReal-TimePCRSystem完成测 试分析。
[0071] 结果：(XDC134转基因鼠与对照鼠相比，⑶4+T细胞数量明显减少，Thl和Treg细 胞比例稍有增加，Thl7细胞比例没有明显变化，B细胞数量增加（图11)。与对照组相比， (XDC134转基因鼠中特异性T细胞IFN-γ分泌增加，而IL-17A和IL-10的分泌没有明显 差异（图12)。mRNA水平检测显示相比较对照小鼠，转基因小鼠脊髓中IFN-γ和TGF-β mRNA水平上调（图13)。上述结果提示提示(XDC134通过介导Thl和Treg细胞功能进而调 节EAE发病情况。
[0072] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 人类细胞因子CCDC134在自身免疫性疾病中的应用，其特征在于，以该细胞因子的 基因或蛋白质作为检测标志物，制备CD4+T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病的检 测试剂。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CD4 +T细胞亚群为Thl和/或Treg。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为CD4 +T细胞亚群 Thl和Treg功能异常介导的多发性硬化症。4. 一种体外检测人类细胞因子CCDC134蛋白的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂： 包被缓冲液：〇. 05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9. 6 ; 样品分析缓冲液：含有〇. 05%(v/v)吐温20的PBS; 标准品：纯化的重组(XDC134蛋白； R1包被抗体：兔抗(XDC134多克隆抗体； Ml检测抗体：鼠抗(XDC134单克隆抗体； HRP标记羊抗鼠二抗； 封闭液：含 2%BSA(w/v)和 0. 05%(v/v)吐温 20 的PBS; 浓缩洗涤液：含1%(ν/ν)吐温-20的20XPBS; TMB底物； 终止液：2N硫酸。5. 人类细胞因子CCDC134的应用，其特征在于，以该细胞因子的基因或蛋白质作为药 物有效成分，制备CD4+T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病的治疗药物；所述基因的 核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物用于促进naiveCD4+T细胞向 Thl和/或Treg细胞分化。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制CD4 +T细胞增殖。8. 根据权利要求5~7任一所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬 化症。9. 一种人类细胞因子(XDC134蛋白的真核表达载体，其特征在于，是将SEQIDNO: 1所 示的核苷酸序列5'端连接Igk信号肽的核苷酸序列后插入表达载体pMH的多克隆位点形 成的重组质粒；所述Igk信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO: 3所示。
【专利摘要】本发明公开了人类细胞因子CCDC134在自身免疫性疾病的应用，具体是以该细胞因子的基因或蛋白质作为检测标志物和/或治疗药物有效成分，制备CD4+？T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病的检测试剂和/或治疗药物；所述基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:2所示。经过研究发现，人类细胞因子CCDC134能够抑制na？ve？CD4+？T细胞的增殖，也能促进na？ve？CD4+？T细胞向Th1和/或Treg细胞分化，因此其可以应用于CD4+？T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病。
【IPC分类】A61P25/00, G01N33/68, A61K38/19, G01N33/577, A61P37/02, C12N15/85
【公开号】CN105388299
【申请号】CN201510776270
【发明人】黄晶, 夏鹏, 余骉亿, 巩晓婷, 肖 琳, 邱晓彦
【申请人】北京大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月13日