pakC18MGII(5ym，4.6mmX250mm)，
[0055]电子天平:XS105DU
[0056] 2试药与试剂
[0057] 对照药材:祖师麻（中检院，批号：1243-0301)。
[0058] 对照品：祖师麻甲素（中检院提供，批号110900-201006)、7_羟基香豆素（中检院， 批号：111739-200501 )。
[0059]试剂：甲醇为色谱纯;水为去离子水;其他试剂均为分析纯。
[0060] 样品：秦皇岛市山海关药业有限责任公司20131206批样品。
[0061] 3供试品溶液制备为简化操作，取含量测定项下供试品溶液。
[0062] 4对照溶液制备
[0063] 4.1对照物溶液制备
[0064]拟选取祖师麻对照药材制备对照物溶液。
[0065] 4.1.1祖师麻对照药材对照物溶液制备取祖师麻对照药材2g，加水煎煮1小时，滤 过，滤液浓缩至约1 〇ml，加甲醇使成为70 %的甲醇溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0066] 4.2对照品溶液制备称取祖师麻甲素、7-羟基香豆素对照品适量，精密称定，加 85%甲醇制成每lml各含0.lmg和20yg的混合溶液，作为对照品溶液。
[0067] 5特征峰的确定
[0068] 5.1对照药材色谱峰确定对照药材色谱中色谱峰多于样品色谱峰，如何选择才能 既体现各味药材的特征，又易于判断成为关键。经反复试验，综合不同色谱柱、不同仪器所 得的对照药材色谱，主要显示了 8个特征色谱峰(见图3)，经对照药材色谱与祖师麻甲素对 照品、7-羟基香豆素对照品色谱比对，确认4号峰为祖师麻甲素，5号峰为7-羟基香豆素。 [0069] 5.2供试品图谱中显示与混合对照药材图谱保留时间一致的8个色谱峰(见图1)。 图1对照药材、对照品、样品色谱图[0070] 6色谱条件与系统适用性试验
[0071 ]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1 %冰醋酸溶液为流 动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波长327nm。理论板数按祖师麻甲素峰计算应不 低于4000。
[0072] 6.1流动相
[0073]在考虑指纹图谱尽量与含量测定的流动相及比例相同，使各成分峰尽可能地与其 他成分有较好的分离度，经多次试验，综合考虑各成分峰的分离度，确定用甲醇(流动相A) 和0.1 %的冰醋酸溶液(流动相B)作为流动相，以下表进行梯度洗脱。
[0074]梯度洗脱表
[0075]
[0076]6 · 2检测波长采取二极管阵列检测器检测，提取各波长下色谱图，在327nm波长下 祖师麻有色谱峰出现，各色谱峰面积、高度适中，分离度好，所以确定检测波长为327nm，结 果见图2、3。
[0077]图2祖师麻甲素、7-羟基香豆素对照品波长扫描图[0078]图3样品色谱图 [0079] 7耐用性研究
[0080]7.1药材批号的影响生产厂家共计提供了 9批祖师麻药材，结果9批药材色谱基本 一致(见图4)。
[0081]图4不同批号祖师麻色谱图
[0082] 7.2仪器与色谱柱的影响分别试验了三种色谱柱及三个不同厂家仪器，结果供试 品色谱均呈现与对照指纹图谱相一致的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计 算，相似度分别为〇. 90以上。图5-10。
[0083]色谱柱：
[0084] I.DiamonsilC18(5ym，4.6mmX250mm)、
[0085] Π ·Thermo 12〇A.'_C18(5ym，4· 6mmX 250mm)、
[0086]m.ShiseidoCapcellpakC18MGII(5ym,4.6mmX150mm)
[0087]仪器：
[0088] I.Ultimate 3000
[0089] Π .ShimadzuLC20A
[0090] ΙΠ.Agilent 1260
[0091] 图5色谱柱I、ShimadzuLC20A色谱（上为混合对照药材，下为样品），相似度为 0.969
[0092] 图6色谱柱Π、Agilent1260色谱(上为对照药材，下为样品），相似度为0.966
[0093] 图7色谱柱ΙΠ、ShimadzuLC20A色谱(上为对照药材，下为样品），相似度为0.970
[0094] 图8仪器I、ShiseidoCapcellpakC18MGII色谱柱（上为对照药材，下为样品）， 相似度0.972
[0095] 图9仪器Π、ShiseidoCapcellpakC18MGII色谱柱（上为对照药材，下为样品）， 相似度为0.970
[0096] 图10仪器m、Thermo 色谱柱(上为对照药材，下为样品），相似度为0.966
[0097]7.3柱温的影响考察了不同柱温下各成分峰的分离度，分别在25、30、40°〇进样测 定，结果柱温在25、30、40°C时各成分峰均能达到很好的分离效果，供试品色谱均呈现与对 照药材色谱相一致的色谱峰(见图11)
[0098]图11不同柱温下样品色谱图[0099] 8重复性试验
[0100] 取同一批样品（秦皇岛市山海关药业有限责任公司，批号：20131206)，9份分别为 0.3g、0.6g、0.9g各3份按正文方法进行测定。结果表明，本方法保留时间重复性良好，9份样 品的共有峰一致(结果见表1)
[0101] 表1重复性试验结果
[0102]
[0104] 9稳定性试验
[0105] 取同一份供试品溶液，间隔一段时间进样一次，考察样品溶液的稳定性。结果表 明，供试品溶液室温下放置，至少在24小时内稳定(结果见表2)。
[0106] 表2稳定性试验结果
[0107]
[0108] 10样品测定结果
[0109] 取收集的6批样品批号分别为20131 206、20130302、20121 103、20130205、 20131106、20121105进行测定，结果样品中均呈现8个特征峰，均符合规定，相似度大于 0.90，结果见图12、13和表3。
[0110] 图12 6批样品HPLC色谱图 图13 6批样品相似度评价结果 [0112]表3 6批样品相似度测定结果 「01131
[om]【含量测定】
[0115]为更全面有效控制产品的质量，本品拟测定祖师麻甲素和7-羟基香豆素的含量。 《中国药典》2010年版一部祖师麻片质量标准收载了祖师麻甲素的含量测定，质量检验中为 了降低劳动强度和节约时间，在研究指纹图谱的试验中我们尽量将指纹图谱和含量测定方 法在同一系统中同时完成，因此在拟定标准中将祖师麻甲素和7-羟基香豆素的含量测定同 时进行了测定。
[0116] 1实验仪器
[0117] 高效液相色谱仪:Shimadzu LC20A
[0118] 色谱柱：Shiseido Capcell pak C18MGII (5ym，4.6mmX250mm)
[0119] 电子天平:Mettler AE163;Mettler AE240
[0120] 2试药与试剂
[0121] 祖师麻甲素（中检院提供，批号110900-201006)、7_羟基香豆素（中检院，批号： 111739-200501)。
[0122] 试剂：甲醇为色谱纯;水为去离子水;其他试剂均为分析纯。
[0123]样品：秦皇岛市山海关药业有限责任公司20131206批样品，阴性样品自制。
[0124]制备阴性对照用的药材:碳酸钙、糊精、淀粉由秦皇岛市山海关药业有限责任公司 提供。
[0125] 3方法学考察
[0126] 3.1测定波长的选择取祖师麻甲素和7-羟基香豆素对照品，按正文方法制备对照 品溶液，使用二极管阵列检测器在200~400nm范围内扫描光谱，结果见图14,《中国药典》 2010年版一部中祖师麻片中祖师麻甲素含量测定的最大吸收波长为327nm，由图可以看出 7-羟基香豆素的最大吸收波长与祖师麻甲素基本相同，故本方法中的最大吸收波长仍按现 行标准取327nm作为测定波长。
[0127]图14祖师麻甲素和7-羟基香豆素对照品波长扫描图
[0128] 3.2流动相的优化
[0129]在对祖师麻甲素和7-羟基香豆素测定时，为了达到较好的分离效果流动相比例采 用了梯度洗脱，梯度洗脱时曾尝试用纯水作为水相，但基线不太