)肺炎支原体抗体MPh2_胶体金-碳纳米管标记物的制备及纯化： 取调节pH值至8. 5的所述胶体金lmL于10.OmL烧杯中，向烧杯中加入10μg/ml的 肺炎支原体抗体MP-h2,盖上薄膜密封，用磁力搅拌器混匀20min后静置lOmin; 向所述烧杯中加入l〇〇yL5%BSA溶液，用磁力搅拌器混匀20min，静置lOmin，制得 金标抗体； 继续加入5yL10%碳纳米管，继续混勾lOmin，即肺炎支原体抗体MPh2-胶体金-碳 纳米管复合标记物； 将制得的复合标记物溶液于4°C2500r/min，离心lOmin，去除下层沉淀，将上清液转 到另一离心管中，于4°C9500r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀 释至原体积的1/20,于4°C保存备用； 3)试纸条的组装： (1) 将硝酸纤维素包被膜和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住硝酸纤维素包被 膜上方1-2mm; (2) 将粘贴好硝酸纤维素包被膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试 纸条； (3) 将样品垫和结合垫切成4_宽的条，同时将结合垫浸泡在肺炎支原体抗体 MPh2-胶体金-碳纳米管标记物溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫； (4) 烘干后的金标垫剪成lcm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住硝酸纤维素 包被膜下方1_2_，同时用样品垫压住金标垫下方1_2_，根据试纸条长度修剪样品垫； (5)在结合垫和吸收垫之间的硝酸纤维素包被膜上依次包被肺炎支原体抗体MP-hl抗体和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用金标划膜仪进行包被划线，具体参数为 平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8μL/cm，质控线为1.ΟμL/cm，使得肺炎支原 体抗体MP-hl包被浓度为1.Omg/mL;羊抗鼠IgG包被浓度为1.Omg/mL。
[0015] 在该制备方法中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与结 合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗糖、5%BSA和终体积浓度为0.1% 的pH为8. 5的0.Olmol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37°C条件下烘干 12h备用，这项前处理步骤可以使样品垫与金标垫具有优异的吸水能力及释放能力，进而 大大提尚了检测能力。
[0016] 该制备方法还包括对容器的清洗，具体为：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液 中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于 二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡lmin后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放 置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37°C进行干燥处理，备 用。对容器的清洗可以提高金标抗体的稳定性。
[0017] 通过实施例来对本发明进行说明： 实施例1如图1所示，本发明揭示了一种检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条， 包括样品垫、结合垫(金垫)、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结 合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上：所述结合垫包被 设有MP-hl抗体-胶体金-碳纳米管标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质 控线，所述检测线包被有MP-hl抗体，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0018]实施例2 -种检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法 包括以下步骤： 步骤一、取1个250mL烧杯，于250mL三角烧瓶中加入99mL纯水，于恒温磁力搅拌器 上使用温度档200°C对其进行加热，转速为200r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温 度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入lmL1%柠檬酸三钠溶液。快速按下计时器，1分钟后快速 加入1%氯金酸溶液lmL。烧杯中的溶液变为红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室 温，1〇〇容量瓶定容，通过紫外分光光度计测量最大吸收波长是否为525nm，作为检验标准。 即制得胶体金4°C，密封保存； 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为8. 5的所述胶体金lmL于10.OmL烧杯 中，向烧杯中加入10μg/ml的肺炎支原体抗体MP-h2,盖上薄膜密封，用磁力搅拌器混匀 20min后静置10min;向烧杯中中加入100yL5%BSA溶液，用磁力搅拌器混匀20min，静 置10min，制得金标抗体，继续加入5μL10%碳纳米管，继续混勾10min，即肺炎支原体抗 体-胶体金-碳纳米管复合标记物；同时，将制得的金标抗体溶液于4°C2500r/min，离心 lOmin，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4°C9500r/min，离心30min，去除上 清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用； 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm;(2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机 上切割成4mm宽的试纸条；（3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡金 标抗体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成lcm长的小块并贴 于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据 试纸条长度修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被肺炎支原体抗体 MP-hl抗体和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用上海金标划膜仪进行包被划线， 具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8μL/cm，质控线为1.ΟμL/cm，使 得肺炎支原体抗体MP-hl包被浓度为1.Omg/mL;羊抗鼠IgG包被浓度为1.Omg/mL。
[0019] 实施例3样品垫和金标垫的预处理 包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别 切成4_宽的长条，用含有5%的蔗糖、5%BSA和终体积浓度为0.1%的pH为7. 4的 O.Olmol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37°C条件下烘干12h备用。
[0020] 实施例4对试验所用容器的清洗 首先将试验所用容器在浓硫酸重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次 清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡lmin 后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯 水清洗干净并于烘箱中37 °C进行干燥处理，备用。
[0021] 实施例5胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定 氯化钠破坏法：用pH=9. 0、0. 01mol/LPBS将肺炎支原体MP-h2抗体稀释至lmg/mL。 将胶体金溶液调制最佳pH，取若干个小离心管，每管准确量取lmL胶体金溶液，分别 加入0、2、4、6、8、10、12、14μLlmg/mL肺炎支原体MP-h2抗体，振荡混匀5min，室温静 置10min;然后再加入100μ1 10%NaCl于每管胶体金中，混匀、并静置2h，观察颜色变化 及聚沉情况。最适抗体浓度在最低稳定量的基础上再加20%。
[0022] 探索胶体金标记抗体蛋白的最佳标记量，各离心管中的溶液发生反应后颜色发生 了变化，其中，1、2、3号管抗体蛋白的加入量不能够稳定胶体金体系，加入氯化钠后，产生 的盐离子效应，破坏了胶体金的平衡，使溶液出现了由红色变蓝色或紫色的不同程度的聚 沉现象，4号管溶液有轻微变色，说明加入氯化钠后对溶液的影响较小，5号管加入的抗体 量可以稳定胶体金体系，所以加入氯化钠后对溶液没有影响，即最低抗体标记量为10μg/ mL〇
[0023] 实施例6试纸条的性能评价 5. 1试纸条的灵敏度 用生理盐水将肺炎支原体培养液（107CFU/mL)稀释成不同浓度的样品溶液：0(阴性空 白样液生理盐水作对照）、10 \ 10 2、