一种同时定量检测saa/pct/crp的检测装置的制备方法_2

文档序号:9706946阅读:来源:国知局
得到的:
[0024]人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试纸的胶体金垫:取每100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2M K2C03调至pH6.5-8.0,再加入0.5_2mg标记用SAA抗体,室温搅拌1小时,用酪蛋白或者BSA封闭,13000r/min离心30分钟,弃上清,用胶体金工作液复溶至70ml,然后用喷金机均匀地喷涂在无纺布上,于室温相对湿度不高于30 % (一般在湿度为15-30 % )的条件下干燥,密封保存备用;
[0025]人降钙素原(PCT)检测试纸的胶体金垫:取每100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2MK2C03调至pH6.5-8.0,再加入0.5_2mg标记用PCT抗体,室温搅拌1小时,用酪蛋白或者BSA封闭,13000r/min离心30分钟,弃上清,用胶体金工作液复溶至70ml,然后用喷金机均匀地喷涂在无纺布上,于室温相对湿度不高于30% (一般在湿度为15-30 % )的条件下干燥,密封保存备用;
[0026]C-反应蛋白(CRP)检测试纸的胶体金垫:取每100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2MK2C03调至pH6.5-8.0,再加入0.5_2mg标记用CRP抗体,室温搅拌1小时,用酪蛋白或者BSA封闭,13000r/min离心30分钟,弃上清,用胶体金工作液复溶至70ml,然后用喷金机均匀地喷涂在无纺布上,于室温相对湿度不高于30% (一般在湿度为15-30 % )的条件下干燥,密封保存备用。
[0027]优选的,上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置,所述胶体金液为采用氯金酸一柠檬酸三钠法制备的直径40 土 5nm的胶体金溶液。
[0028]优选的,上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置,所述胶体金工作液pH7.8,包括 1 % 牛血清白蛋白、0.lMTris-HCl缓冲液、5% 蔗糖、1 %Tween-20和0.5%Trt1n-100。
[0029]优选的,上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置,还包括相互配合使用的三联卡壳和免疫层析判读结果记录仪,所述三联卡壳由上盖和下盖两个部分配合组装形成封闭盒体,所述下盖内部平行放置有人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试纸、人降钙素原(PCT)检测试纸和C-反应蛋白(CRP)检测试纸,上盖于各试纸硝酸纤维素膜中部的正上方对应处分别设有SAA视窗口、PCT视窗口和CRP视窗口,用于观察硝酸纤维素膜上的C、T线,显示判定结果;所述上盖上位于SAA视窗口下方对应SAA样品垫部分设有第一样品孔,用于加入稀释后的样本液,所述上盖上位于PCT视窗口下方对应PCT样品垫部分设有第二样品孔和稀释液孔,用于加入样本和稀释液,所述上盖上位于CRP视窗口下方对应CRP样品垫部分设有第三样品孔,用于加入稀释后的样本液。
[0030]使用过程中,三联卡壳插入免疫层析判读结果记录仪中,免疫层析判读结果记录仪通过拍照方式读取数据,在15-20分钟内,用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。
[0031]优选的,上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置,所述免疫层析判读结果记录仪是一种光学检测系统,内置有对人血清淀粉样蛋白A、人降钙素原和C-反应蛋白的标准曲线和判定方法,用于对各对应试纸检测结果进行定量判定,所述人血清淀粉样蛋白A、人降钙素原和C-反应蛋白的试纸检测范围分别为5-100mg/L,0.5-20mg/UPl-200mg/L。
[0032]上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置的制备方法,具体步骤如下:在相对湿度不高于30% (—般在湿度为15-30%)的条件下,取各自的塑料底板,将已包被SAA、PCT和CRP的硝酸纤维素膜(NC膜)分别粘贴在划好下划线的各自对应的塑料底板的中部,在NC膜T线一侧粘贴对应的胶体金垫,在胶体金垫另一侧粘贴对应的样品垫;在NC膜C线一侧粘贴吸样垫;各粘贴组分接口相互叠压1_2_,粘贴好的大板切成3-4mm宽的试纸条,然后将所得的三种试纸条分别放置于卡壳下盖的槽中,然后盖上上盖,压紧,完成装配。
[0033]上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置在同时检测SAA/PCT/CRP过程中,具体应用方法如下:
[0034]检测SAA:将5ul的被检样本如血清、血浆或者10ul全血加入到lmL稀释液中,然后在稀释液孔中加入lOOul稀释好的样本;
[0035]检测CRP:将5ul的被检样本如血清、血浆或者10ul全血加入到lmL稀释液中,然后在稀释液孔中加入lOOul稀释好的样本;
[0036]检测PCT:将10ul的被检样本如血清、血浆或者20ul的全血加入到样本孔中,然后在稀释液孔加入80ul稀释液。
[0037]上述稀释液为稀释液是50mM Tris,PH7.6。
[0038]本发明的有益效果是:
[0039]本发明提供了同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置的制备方法,所得到的检测装置利用免疫层析及免疫双抗体夹心的原理配合免疫层析判读仪可实现同时对SAA/PCT/CRP三项目进行快速检测,检测灵敏度高;该检测装置成本低廉、检测方法简便稳定,适合现场检测,且不需要专业人员操作,试剂卡性能准确、稳定,灵敏度高并能同时快速定量检测SAA/PCT/CRP三项炎症指标,适用于细菌与病毒感染的快速鉴别诊断,微创取样的特点特别适用于婴幼儿的检测,并且不需抽取大量血液样本,降低了医疗费用。
【附图说明】
[0040]图1为本发明所述检测试纸的结构示意图;
[0041]图2为本发明所述三联卡壳结构图的结构示意图。
[0042]图中,1-吸样垫π-硝酸纤维素膜m-τ线ιν-c线
[0043]V-胶体金垫 V1-样品垫
[0044]1-SAA 视窗口 2-PCT 视窗口3-CRP 视窗口
[0045]4_第一样品孔 5_第二样品孔 6_第二样品孔7_稀释液孔
【具体实施方式】
[0046]下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0047]实施例1:
[0048]1主要材料
[0049]1.1生物原料SAA、PCT和CRP配对抗体,从芬兰HYTEST公司购买;羊抗鼠IgG:自制;氯金酸:Sigma公司产品;NC膜:Sartor ius公司产品;牛血清白蛋白(BSA),聚乙二醇PEG20000: Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
[0050]1.2临床样本由公司在相关医院获得,共120份,其中确诊为炎症感染型病人血清样本60份,SAA检测值为5-200mg/L,PCT检测值为0.5-20mg/L和l-200mg/L。正常人血清样本60份,SAA、PCT和CRP值未检测。
[0051 ] 1.3三联测试卡:由本公司设计,相关公司按要求生产、提供。
[0052]1.4免疫层析结果结判读记录仪:型号:NS3001,天津中新科炬生物制药有限公司
τ?: 口广PR ο
[0053]2 方法
[0054]2.1 SAA、PCT和CRP抗体胶体金标记采用氯金酸一柠檬酸三钠法制备直径为40 土5nm的胶体金溶液,取三份胶体金溶液,分别用0.2M K2C03将溶液调到pH6.5、pH7.0和pH8.0,然后将胶体金缓慢搅拌,按每ml溶液加入5ug、10ug、20ug将SAA标记抗体加入到溶液中,继续搅拌30分钟,再加入到终浓度为0.5%的PEG2000和0.5%的牛血清蛋白(BSA)进行封闭,标记结束后以13000r/min离心,弃上清,沉淀按70%原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(PH7.8,包括1 %牛血清白蛋白、0.lMTri s-HCl缓冲液、5 %蔗糖、1 % Tween-20和
0.5%Trt1n-100)。然后将标记胶体金溶液按lml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上,在温度20-25°C,相对湿度在<30 %的干燥间干燥3-5小时,制成胶体金垫。PCT或者CRP抗体标记方法和SAA—致,只是加入的抗体为PCT或者CRP抗体。
[0055]2.2 NC膜包被用0.01M pH7.4PBS将配对的SAA抗体配制成0.8,1.0和1.5mg/mL,羊抗鼠IgG分别稀释成lmg/ml、2mg/ml,然后用喷膜仪在NC膜上按1.4ul/cm进行分别划线包被,包被完成后将NC膜在在温度20-25°C,相对湿度在<30%的干燥
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