s/yL。
[0038]4)加样:将2.(1)中稀释好的cAMP溶液按每个浓度1个复孔，10yL每孔加入384孔板中，再加入1孔10yL的SB作为negative control(NC);将2.(2)中稀释好的Forskolin溶液按每个浓度2个复孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入2孔每孔各5yL的SB作为cell negativecontrol (CNC)。接着向不同浓度的Forskol in溶液及CNC中加入2.(3)配制好的不同浓度的细胞稀释液各5yL。将384孔板在500rpm下离心15s，使10yL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育45min。
[0039]5)终止试剂:用Lysis buffer(LB)将cAMP_d2稀释40倍，将ant1-cAMP稀释20倍。取适量LB与稀释好的ant1-cAMP溶液按1:1混合，向NC及CNC中每孔各加入10yL;将剩余cAMP-d2溶液与ant1-cAMP溶液按1:1混匀后加入到其余各孔，每孔10yL。将384孔板在500rpm下离心15s，使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[°04°] 6)检测:孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm?Detect1n Platform上检测。处理数据，确定最佳细胞数及Forskol in的ECso。
[0041 ] (3)激动剂验证
[0042]1)EP4激动剂PGD2使用DMS0配制成10mM储备液，因EP4偶联Gai，需加入Forskolin刺激cAMP产生。首先根据2.(6)中Forskolin的EC8Q配制FSB，再用FSB逐级稀释为最终浓度的2倍。
[0043]2)配制含最佳细胞数的溶液:用SB将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2.(6)中得到的最佳细胞浓度。
[0044]3)加样:将3.(1)中稀释好的PGD2溶液按每个浓度2个复孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5yL的SB，其中2孔作为CNC，另2孔作为non-stimulated control(NSC)。将3.⑵配制的细胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心15s，使10yL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育45min。
[0045]4)按2.(5)配制终止试剂。向CNC中每孔加入10yL LB/ant1-cAMP溶液(1:1)，向NSC及其余各孔每孔加入10此: 1)。将384孔板在500rpm下离心15s使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60mino
[0046]5)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Beckman Paradigm上检测。处理数据，确定pgd2的EC5Q及EC80。
[0047](4)拮抗剂验证
[0048]l)293cl8/EP4拮抗剂L-161982使用DMS0溶液配制成100mM储备液，以SB逐级稀释为最终浓度的4倍。
[0049]2)配制含最佳细胞数的溶液:用SB将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2.(6)中得到的最佳细胞浓度。
[0050]3)加样:将4.(1)中稀释好的L-16182溶液按每个浓度2个复孔，2.5yL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5yL的SB，其中2孔作为CNC，另2孔作为NSC，再加入2孔每孔各2.5μL的SB，作为cell positive control (CPC)。将4.(2)配制的细胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心15s，使7.5yL试剂(CNC及NSC为10yL)混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。[0051 ] 4)根据 2.(6)中Forskolin的EC8()配制FSB，用FSB按3.(5)中PGD2的EC8()配制PGD2溶液。向CPC中加入FSB，每孔2.5yL ；其余各孔加入PGD2溶液，每孔2.5yL ； CNC及NSC不加操作。将384孔板在500rpm下离心15s，使10yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育45min。
[0052]5)按2.(5)配制终止试剂。向CNC中每孔加入1 OyL LB/ant 1-cAMP溶液(1:1)，向NSC、CPC及其余各孔每孔加入10yL cAMP-d2/anti_cAMP溶液(1: 1)。将384孔板在500rpm下离心15s使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0053]6)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm?Detect1n Platform上检测。处理数据，确定措抗剂的ICso。
[0054]实验结果
[0055]确定了稳转细胞株293cl8/EP4的拮抗剂药物筛选模型造模条件，每孔细胞数为50006118/^1^，即为250006118/\￥611，所得到?0^1^01;[11刺激结果与标准曲线趋势最为一致(见图1)。通过该模型验证了P⑶2对EP4的激动作用，其EC5Q为1.333198.4nM(见图2);验证了L-161982对EP4的拮抗作用，其IC5Q为580.7nM(见图3)。
【主权项】
1.前列腺素E2受体4拮抗剂药物筛选模型高通量筛选模型，用激动剂对培养过的293cl8/EP4稳转细胞株进行反应后加入d2标记的cAMP示踪剂与样本cAMP竞争结合Eu3+穴状物标记的cAMP特异性抗体的结合位点反应1小时，最后在Paradigm? Detect1n Platform检测信号强度评价样品中cAMP浓度。其特征在于确定了稳转细胞株293cl8/EP4的拮抗剂药物筛选模型造模条件，所用的CAMP-d2assay方法简便省时，只需两到三个小时即可得到结果，即开即用，毋需用放射性同位素和有机溶剂。灵敏度高，步骤少，无损失，结果准确，能够满足高通量筛选的要求。
【专利摘要】一种利用分辨荧光技术实现的前列腺素E2受体4拮抗剂活性高通量筛选，通过确定稳转细胞株293c18/EP4的拮抗剂药物筛选模型造模条件，确定最佳细胞数为2500cells/well，所得到Forskolin刺激结果与标准曲线趋势最为一致。该模型验证了PGD2对EP4的激动作用，和L-161982对EP4的拮抗作用。包括以下步骤：(1)前列腺素E2受体4拮抗剂筛选模型的建立与优化：标准曲线的测定及最佳细胞数确定；(2)验证模型可靠性：激动剂和拮抗剂验证。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。
【IPC分类】G01N33/50
【公开号】CN105486851
【申请号】CN201510828104
【发明人】严明, 俞沁玮, 骆深玲, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月20日