果：
[0043] 基于本发明，可W制备凝集素忍片、酶标板等测试载体，快速、有效鉴别肺癌类型 (小细胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌)及其分期，且检测操作简单、成本可控。
【附图说明】
[0044] 图1为凝集素忍片上凝集素探针布局图；
[0045] 图2为凝集素忍片结果扫描图，具体有健康志愿者化V)，肺部良性病变(BLD)患者， 小细胞肺癌局限期（S化C-LS)患者，小细胞肺癌广泛期（S化C-ES)患者，肺鱗癌早期（SCC- ES)患者，肺鱗癌晚期（SCC-AS)患者，肺腺癌早期(ADC-ES)患者及肺腺癌晚期(ADC-AS)患者 血清蛋白凝集素忍片巧光检测结果。
【具体实施方式】
[0046] W下主要介绍本发明在研究过程中的重点过程。
[0047] 1、实验部分 [004引1.1试剂与材料
[0049]甘氨酸，憐酸氨二钢，憐酸二氨钢，吐溫-20和蛋白酶抑制剂均购自美国Sigma- A1化ich公司。牛血清白蛋白（BSA)购自德国Merck公司。切3巧光均购自美国Amerhsma公司。 其他化学试剂均为分析纯级别，在使用前没有经过进一步纯化。所有实验用水都为经 Milli-Q50纯水系统（美国Millipore公司）处理的超纯水。Sephadex G-25柱脱盐购自美国 GE化althcare公司。忍片杂交盒购自美国Bio-Rad伯乐公司。其它常见玻璃器皿均为国产。 37种凝集素(具体名称见表1)分别购自Sigma-Aldrich公司、德国Vector公司。 [0050]表1凝集素名称及其特异识别糖链
[0化1 ]
[0化2]
[0化3]
[0化4] 1.2实验仪器
[0055] 电热鼓风干燥箱:天津泰斯特公司；高压灭菌锅：日本T0MY公司；超速冷冻离屯、机 5804R:德国Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国Implen公司；生物忍片扫描仪 4000B:美国Axon公司；忍片点样仪:博奥晶忍SmadArrayer48点样仪;忍片杂交箱化-2000: 美国UVP公司。
[0056] 1.3研究人群和全血清采集
[0057] 该实验获得西安交通大学第一附属医院和西北大学伦理委员会及样本提供者同 意。符合条件的肺部良性病变、肺癌患者不能同时罹患其它疾病，4化内没有服用任何药物。 医院专业人员采集肺部良性病变、肺癌患者和健康志愿者新鲜血液各数例(表2)。全血收集 后静置于室溫下15-30min，待自然凝结后，在冷冻离屯、机中1000-2000g离屯、lOmin后取上 清，即为血清。将血清立刻分装入干净无菌的〇.5mL离屯、管中-20°CW下冻存。血清不可有溶 血现象，也避免反复冻融。
[0058] 表2肺部良性病变患者、肺腺癌患者、肺鱗癌患者情况表 [0化9]
[0060] 1.4血清混合及巧光标记
[0061] 为了消除个体差异带来的影响并归一化个体样本，本研究中，按照健康志愿者、肺 部良性病变、小细胞肺癌局限期、小细胞肺癌广泛期、肺腺癌早期、肺腺癌晚期、肺鱗癌早期 和肺鱗癌晚期进行分组，每例样本取10化进行混合，然后用化an壯ord法蛋白定量。混合样 本经切3巧光染料标记后用S邱hadex G-25除盐柱去掉游离巧光。标记好的蛋白准备用于凝 集素忍片解育。个例样本用于血清忍片的点制。
[0062] 1.5凝集素忍片和数据分析
[0063] 1.51凝集素忍片的制备
[0064] 将玻片用无水乙醇清洗Ξ次，每次lOmin。离屯、机中甩干玻片。浸泡入250mL 10% NaO田容液中，避光，摇床上反应1化后超声15min。然后用超纯水清洗四次，每次2min，无水乙 醇清洗两次，每次2min。甩干。再将玻片浸泡到200mL 10%GPTS溶液中，避光，摇床上解育反 应化，对玻片进行环氧化修饰。超声清洗15min，无水乙醇清洗Ξ次，每次lOmin。甩干后将玻 片置于37°C真空干燥箱中，干燥化。最后将环氧化玻片放置于室溫干燥器中保存备用。
[0065] 设计凝集素忍片矩阵（图1)，选用Img/mL BSA作阴性质控，切3巧光染料标记的BSA 作位置标记，与37种凝集素共同构成12X10矩阵，每种凝集素重复点样3次，每张忍片上重 复4个矩阵。在384孔板中按矩阵设计顺序依次加入配制好的点样液，使用博奥晶忍48点样 仪的针点系统，在环氧修饰片基上点制忍片。在室溫且湿度为55%~65%的环境中解育化 后，37Γ真空干燥忍片，使凝集素固定于忍片上。将制备好的凝集素忍片放置于4Γ干燥 器，避光保存，备用。
[0066] 1.52凝集素忍片的解育及数据分析
[0067] (1)凝集素忍片的封闭
[006引将点制好的凝集素忍片从4°C干燥器中取出，回溫。首先用PBST、PBS各清洗玻片一 次，每次5min，离屯、甩干。将凝集素忍片与700μ1封闭缓冲液在忍片杂交盒中解育，25°C旋转 反应化。封闭结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5min，甩干。用Gen邱ix4000B忍片扫 描仪扫描封闭后忍片，检查封闭效果。
[0069] (2)血清样本的凝集素忍片检测
[0070] 将巧光标记的血清蛋白扣g与解育缓冲液混匀（比例约1:9)，并在盖玻片均匀加入 700μ1，盖上封闭后的凝集素忍片，于忍片杂交仪中25°C避光旋转解育化。解育结束后用 PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5min，罔屯、甩干。
[0071] (3)数据的扫描与分析
[0072] 使用Gen邱ix4000B忍片扫描仪扫描忍片，GenePix3.0软件从忍片扫描结果图圈点 分析后，导出GH?文件，根据其中的数据信息进行分析。原始数据中小于两倍背景标准偏差 的值去掉，每张忍片上每个样本九个重复点的有效值再取平均值(AS)，每组平均值表示为 组内每个样本平均值(AS)的均值(46)±标准偏差(SDG)。
[0073] 2、结果部分
[0074] 2.1小细胞肺癌局限期及广泛期血清糖蛋白糖链的变化
[0075] 利用凝集素忍片分别对健康志愿者、肺部良性病变患者、小细胞肺癌局限期及广 泛期患者血清进行检测，通过专业软件获取忍片数据并归一化处理后，首先将两组肺癌结 果分别与健康组和良性病变组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后巧光强度 (NFI)在小细胞肺癌局限期组(S化C-LS)和小细胞肺癌广泛期组(S化C-ES)分别比健康志愿 者组化V)和肺部良性病变患者组(BLD)得到化Id-change值。我们认为化ld-change〉1.5和 化ld-change<0.67为肺病患者相较于健康人和肺部良性病变患者在血清中上调和下调表 达的糖蛋白糖链。结果如下：
[0076] (1)37种不同的凝集素对各组血清糖蛋白糖链均有不同程度的识别，说明在小细 胞肺癌发生发展的过程中，血清中的糖蛋白糖链均发生了变化。
[0077] (2)相对于健康志愿者，分别有5种和巧巾凝集素识别的糖链在S化C-LS和SCLC-ES 患者血清中差异表达；相对于肺部良性病变患者，分别有9种和7种凝集素识别的糖链在 S化C-LS和SCLC-ES患者血清中差异表达。（表3和图2)其中多数属于甘露糖型的糖链、唾液 酸化的糖链和半乳糖型的糖链，说明甘露糖型的糖链、唾液酸化的糖链和半乳糖型的糖链 在小细胞肺癌发生发展过程中，其表达发生着显著的变化。
[0078] 表3:小细胞肺癌局限期及广泛期患者血清糖蛋白糖链谱的表达
[0079]
[0080] 表中数据表示该组的凝集素忍片结果中每个凝集素对应NFI相对于对照组NFI的 Fo Id-change值。HV，健康志愿者；BLD，肺部良性病变；S化C-LS，小细胞肺癌局限期；S化C- ES，小