一种利拉鲁肽中游离棕榈酸的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物合成技术领域，具体设及一种利拉鲁肤中游离栋桐酸的检测方 法。
【背景技术】
[0002] 利拉鲁肤，是一种长效治疗2型糖尿病的膜高血糖素样肤1 (GLP-I)类似物。GLP-I 是人体内存在的一种生理性多肤，它能够根据体内葡萄糖水平的高低，按需促进膜岛P细 胞分泌膜岛素，抑制膜岛素括抗激素膜高血糖素的分泌，从而发挥降糖作用。然而，人体 产生的GLP-I很不稳定，很快就会被体内的二肤基肤酶IV值PP-IV)降解，因此若使用天然 GLP-I降低血糖，需持续静脉输注或持续皮下注射。
[0003] 利拉鲁肤是一种GLP-I类似物，与人GLP-I具有97 %的序列同源性，人GLP-I可 W结合并激活GLP-I受体。GLP-I受体为天然GLP-I的祀点，GLP-I是一种内源性肠促膜岛 素激素，能够促进膜腺P细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌膜岛素。与天然GLP-I不同的是， 利拉鲁肤在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射 给药后，其作用时间延长的机理包括了使吸收减慢的自联作用，与白蛋白的结合W及对二 肤基肤酶IV值PP-IV)和中性内肤酶（肥巧具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰 期。利拉鲁肤的活性由其与GLP-I受体间特定的相互作用介导，导致环憐酸腺巧（CAM巧的 增加。利拉鲁肤能够W葡萄糖浓度依赖的模式刺激膜岛素的分泌，同时W葡萄糖浓度依赖 的模式降低过高的膜高糖素的分泌。因此，当血糖升高时，膜岛素分泌受到刺激，同时膜高 糖素分泌受到抑制。
[0004] 化学合成的利拉鲁肤为31肤，分子式为Ci72H265N43〇51，分子量为3751. 2。外观为白 色至类白色粉末或疏松块状物，有引湿性，几乎不溶于水，溶于0.1mol/L氨氧化钢溶液，其 结构式如附图1所示。
[0005] 利拉鲁肤结构中的栋桐酸侧链，是在合成工艺的下游被酷化上去的，其对于利拉 鲁肤的物理化学性质具有重要的影响。同时，其对治疗2型糖尿病的长效特性也有重要的 影响。因此，对利拉鲁肤中游离栋桐酸进行质量控制非常重要。由于栋桐酸在紫外光下没 有明显的吸收，所W选择一种适当的检测器在利拉鲁肤的生产中就具有非常重要的现实意 义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，提供了一种利拉鲁肤中游离栋桐酸的检 测方法，该方法在对利拉鲁肤中的游离脂肪酸进行高效液相色谱分析过程中，采用电喷雾 检测器进行检测。
[0007] 在本发明优选的实施方案中，高效液相色谱采用如下的色谱条件：色谱柱为C18 柱（100mm*4. 6mm，3um)，流动相为含有40~60m mol/L甲酸溶液的乙腊和甲醇的混合溶液， 乙腊和甲醇的体积比为65:35~85:15;流速为0.5~1.〇1111/111111;柱溫为25~35°(：;进样 量为IOul ;洗脱方式为等梯度洗脱。
[0008] 在本发明更加优选的实施方案中，高效液相色谱采用如下的色谱条件：色谱柱为 YMC-Triart C18柱（100mm*4. 6mm，3um)，流动相为含有50mmol/L甲酸溶液的乙腊和甲醇 的混合溶液，乙腊和甲醇的体积比为80 :20 ;流速为0. 75ml/min ;柱溫为30°C ;进样量为 IOul ;洗脱方式为等梯度洗脱。
[0009] 在本发明优选的实施方案中，电喷雾检测器的载气为氮气，压力为35psi，范围为 IOOpAo
[0010] 在本发明优选的实施方案中，利拉鲁肤溶液经0. 2 ym的滤膜过滤。
[0011] 由本发明的描述可知，与现有的检测方法相比，本发明在对利拉鲁肤中的游离脂 肪酸进行高效液相色谱分析过程中，采用电喷雾检测器进行检测，具有专属性好（检测无 干扰）、灵敏度高（检测限为2. 05ng)、稳定性高（精密度高）、方法可靠（回收率大于90 % ) 等优点，非常适合于对利拉鲁肤中游离栋桐酸的准确测量。
【附图说明】
[0012] 图1 :利拉鲁肤的结构式示意图。 阳01引图2 :空白溶液的色谱图。
[0014] 图3对照品溶液（系统适用性溶液）的色谱图。
[0015] 图4 :供试品溶液的色谱图。
[0016] 图5 :供试品加标溶液的色谱图。
[0017] 图6 :定量限溶液的色谱图。 阳01引图7 :检测限溶液的色谱图。
[0019] 图8 :栋桐酸在3. 07~25. 60ug/ml的浓度范围内峰面积与浓度的线性关系图。
[0020] 图9 :供试品加标50%水平溶液的色谱图。
[0021] 图10 :供试品加标100%水平溶液的色谱图。
[0022] 图11 :供试品加标150%水平溶液的色谱图。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发 明进行若干改进和修饰，运些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0024] 实施例1 :本发明的实验仪器与色谱条件 阳0巧]1、实验仪器
[0026] (1)叫tiMate 3000高效液相色谱仪灯hermo);
[0027] (2) Corona叫付〇 RS电喷雾检测器灯hermo)。
[0028] 2、色谱条件
[0029] (1)色谱柱 JMC-Triad C18 柱（100mm*4. 6mm，3um);
[0030] 似流动相：乙腊：甲醇（体积比为80:20)含有50m mol/L的甲酸溶液；
[0031] (3)流速：0. 75ml/min ; 阳的2] (4)柱溫：30°C ; 阳03；3] 妨进样量：IOul ;
[0034] (6)检测器：电喷雾检测器（CAD);载气：氮气；压力：35psi ;范围：100pA ;
[0035] (7)洗脱方式：等梯度洗脱。
[0036] 3、实验试剂
[0037] (1)乙腊出PLC 级，Merck 公司；
[0038] 似甲醇出PLC级，Merck公司；
[0039] (3)甲酸：LCMS 级，Anaqua 公司； W40] (4)栋桐酸：RS级，Sigma公司；
[OOW 妨利拉鲁肤：本公司自制。
[0042] 实施例2 :系统适用性实验 阳0创一、实验步骤 W44] 1、溶液配制 W45] (1)对照储备液的配制
[0046] 取栋桐酸约25mg，精密称定，置于250ml容量瓶中，加乙腊溶解并定容，摇匀即得。
[0047] 似对照品溶液的配制 W48] 精密量取栋桐酸对照储备液5. Oml，置于50ml容量瓶中，加乙腊稀释并定容，摇匀 即得。 W例 做空白溶液
[0050] 采用乙腊作为空白溶液。
[0051] (4)系统适用性溶液
[0052] 采用对照品溶液作为系统适用性溶液。
[0053] 2、上机测定
[0054] 分别精密量取空白溶液、系统适用性溶液W及系统复核溶液（即系统适用性溶 液，是指在完成系统适用性试验之后，再进行一针系统适用性溶液作为系统复核溶液，W进 行系统复核）各lOul，按如下方式进样测试： 阳化5] 空白溶液------------------------------------------------1针（色谱图参 见附图2)
[0056] 系统适用性溶液---------------------------------------6针（色谱图参见 附图3)
[0057] 系统复核溶液-------------------------------------------1针 阳05引二、检测结果
[0059] 具体检测结果如表1所示。
[0060] 表1系统适用性实验结果
[0061]
[0062]
[0063] 由W上检测结果可W看出，理论塔板数按栋桐酸计为17078(不低于10000);拖尾 因子为1. 23(不大于1. 5);主峰连续6针的面积的RSD为1. 75% (不大于2. 0% )，7针的 面积（加上用于系统复核的一针对照品1的面积）的RSD为1. 84% (不大于2. 0% ) ;6针 各离子的保留时间的RSD为0. 14% (不大于0. 5% )，7针的保留时间（加上用于系统复核 的一针对照品1的保留时间）的RSD为0. 01% (不大于0. 5% )。说明本发明检测方法的 系统适用性良好，方法稳定性好。 W64] 实施例3 :专属性实验 W65] -、实验步骤
[0066] 1、溶液配制
[0067] (1)对照储备液的配制
[0068] 取栋桐酸约25mg，精密称定，置于250ml容量瓶中，加乙腊溶解并定容，摇匀即得。 W例 似对照品溶液的配制 阳070] 精密量取栋桐酸对照储备液5. Oml，置于50ml容量瓶中，加乙腊稀释并定容，摇匀 即得。
[0071] (3)供试品溶液的配制 阳07引取利拉鲁肤适量约20mg，精密称定，置于IOml容量瓶中，加乙腊溶解并定容，用 〇.2ym滤膜过滤即得。
[0073] (4)供试品加标溶液
[0074] 取利拉鲁肤适量约20mg，精密称定，置于IOml容量瓶中，加入对照品溶液溶解并 定容，用0. 2 Ji m滤膜过滤即得。 阳0巧]巧）空白溶'液
[0076] 采用乙腊作为空白溶液。
[0077] 2、上机测定
[0078] 分别精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液W及供试品加标溶液各lOul，按 如下方式进样测试： 阳0巧]空白溶液-----------------------------------------------1针（色谱图参 见附图2)
[0080] 对照品溶液--------------------------------------------1针（色谱图参见 附图3)
[0081] 供试品溶液--------------------------------------------1针（色谱图参见 附图4)
[0082] 供试品加标溶液--------------------------------------1针（色谱图参见附 图5) 阳〇8引二、检测结果
[0084] 具体检测结果如表2所示。 阳0化]表2专属性实验结果 [0086]
[0087] 口 丄T化巧川巧术叫但口，工口伯 A义1工1巧賊口口伯 A义/THWJ批口口伯 A义下