扮^10^01161:-1。
[0119]在一个具体的实施方式中，表达载体可为质粒载体，包括但不限于pET-28、pET-
32、pET-l 5或pET-11质粒载体等;表达宿主还可为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞等能够进行蛋白表达的宿主。
[0120]B.SPG蛋白纳米线-磁性微珠复合物的制备
[0121](I)生物素化种子的制备:将生物素化的融合蛋白Sup35-BAP单体置于4°C孵育一周后，通过超声所产生的剪切力将长的纳米线打断成为纳米线片段制备种子，该种子通过生物素结合在亲和素修饰的磁性微珠表面，快速的诱发自组装功能融合蛋白快速生长在其末端。
[0122](2) SPG蛋白纳米线-磁性微珠复合物的制备:如附图4所示，将亲和素修饰的磁性微珠与过量制备好的生物素化的种子在37°C孵育，通过磁场分离洗涤，加入功能化的融合蛋白Sup35-SPG单体，在室温下孵育，使蛋白纳米线在磁性微珠表面进行生长，通过磁场分离洗涤，即获得Sup35-SPG/Sup35-BAP基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，复合物表面高密度固定了用于特异性固定抗体的SPG。
[0123]实施例4基于SPG蛋白纳米线-磁性微珠复合物的高灵敏3D免疫检测
[0124]本发明一【具体实施方式】中，将SPG蛋白纳米线-磁性微珠应用于高灵敏3D夹心免疫检测，对目标抗原(P24)进行快速、高灵敏检测。
[0125]抗体检测原理参照附图4，由于蛋白纳米线具有着较大的比表面积，展示其上的亲和分子SPG能够更充分的与溶液中固定抗体相结合，从而提高目标分子P24的捕获效率;配合磁性微珠可以快速分离的性质，可以实现对样品中目标分子的快速、高灵敏检测。
[0126]夹心免疫检测的具体步骤如下:
[0127](I)将10yL待测样品与等体积的酶标一抗进行混合；
[0128](2)将实施例3制备好的SPG蛋白纳米线-磁性微珠复合物33.3yg与上述
[0129]步骤(I)所得的待测样品-酶标抗体混合，在37°C下孵育5-15min;
[0130](3)磁场分离l-2min，用10yL PBS洗涤6次；
[0131](4)加入200yL TMB显色液，显色1min;
[0132](5)加入50yL 2M硫酸终止反应；
[ΟΙ33] (6)在450nm波长下测定吸光度。
[0134]检测结果如附图5所示，由附图5可知，采用本发明复合物对于目标分子p24的检测浓度可低至0.01ng/mL。
[0135]本领域技术人员知晓，功能配体SPG也可采用其它对抗体具有特异性结合能力的蛋白如SPA、SPL等，采用夹心免疫的方法，当结合不同的捕获抗体时，可对与捕获抗体发生特异性结合的相应目标分子(例如巨球蛋白、降钙素、癌症相关抗原等)进行检测。
【主权项】
1.一种基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，包括磁性微珠和蛋白纳米线，所述蛋白纳米线通过成线蛋白自组装形成，且所述蛋白纳米线表面包括至少一种功能配体和至少一种连接配体，所述蛋白纳米线通过连接配体连接在磁性微珠表面。2.如权利要求1所述的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，其特征在于:所述成线蛋白为酵母朊蛋白Sup35、淀粉样蛋白Ure2、丝素蛋白；优选的，所述成线蛋白为酵母朊蛋白Sup35。3.如权利要求1所述的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，其特征在于:所述功能配体和连接配体可相同或不同，并独立的选自以下组中的一种或多种:抗原、具有特异性结合能力的功能化抗体、SPA、SPG、SPL、BJP、f32m、CT、hCG、ACTG、PHT、荧光蛋白、生物素和亲和素。4.如权利要求3所述的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，其特征在于:所述连接配体为生物素;所述功能配体选自抗原、SPG、SPA或SPL，优选自以下组中的一种或多种:HIV-p24、HIV-gp41、HIV-gpl20、HIV-gpl60、HIV-nef、HAl、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HBsAg、HBcAg、EboIa、EV71、SV40、HTLV-1、CBV、EB、SARS、CEA、AFP、PSA、POA、PSCA、PSMA、CAl25、CAl9-9、CAl5-3、CA50、CA242、SPA、SPG和SPL。5.如权利要求1-4任一项所述的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，其特征在于:所述蛋白纳米线通过生物素-亲和素相互作用、化学共价交联或特异性DNA-蛋白相互作用的方式连接在磁性微珠表面;优选的，所述蛋白纳米线通过生物素-亲和素相互作用的方式连接在磁性微珠表面。6.—种如权利要求1-5任一项所述的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物的制备方法，包括以下步骤: (1)通过分子克隆将成线蛋白的自组装结构域与至少一种功能配体融合后形成融合蛋白基因LP-L，经表达纯化后得到融合蛋白LP-L; (2)通过分子克隆将成线蛋白的自组装结构域与至少一种连接配体融合后形成融合蛋白基因LP-CL，经表达纯化后得到融合蛋白LP-CL;或者， 通过分子克隆将成线蛋白的自组装结构域与至少一种功能配体融合后，再与至少一种连接配体融合，形成融合蛋白基因LP-CL，经表达纯化后得到融合蛋白LP-CL; (3)将步骤(2)得到的融合蛋白LP-CL破碎作为种子，并将所述种子连接在磁性微珠表面，得到种子-磁性微珠复合物； (4)将步骤(3)得到的种子-磁性微珠复合物表面进行种子诱导自组装，将步骤(I)得到的融合蛋白LP-L组装成蛋白纳米线，得到所述基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于:所述连接配体为生物素，所述步骤(2)具体包括如下步骤: 通过分子克隆将成线蛋白的自组装结构域与生物素接受多肽融合后形成融合蛋白基因LP-BAP;或者，通过分子克隆将成线蛋白的自组装结构域与至少一种功能配体融合后，再与生物接受多肽融合，形成融合蛋白基因LP-BAP ； 将融合蛋白基因LP-BAP克隆入表达载体，将生物素蛋白连接酶克隆入共表达载体中； 将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素； 经破碎、纯化后制得生物素化的融合蛋白LP-BAP。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)具体包括以下步骤: 将生物素化的融合蛋白LP-BAP置于4°C下孵育一周后，形成纳米线，通过超声将纳米线破碎为纳米线片段，制备生物素化的LP-BAP种子;将亲和素修饰的磁性微珠与过量生物素化的种子LP-BAP在37°C下孵育，通过磁场分离洗涤，得到种子-磁性微珠复合物。9.如权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)具体包括以下步骤: 将步骤(3)得到的种子-磁性微珠复合物表面进行种子诱导自组装，加入含功能配体的融合蛋白LP-L，在室温下孵育，使蛋白纳米线在磁性微珠表面进行生长，通过磁场分离洗涤，得到所述基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物。10.—种用于免疫分析的产品，其特征在于:所述产品包括如权利要求1-5任一项所述的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物或如权利要求6-9任一项所述制备方法制得的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物。11.一种如权利要求1-5任一项所述的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物或如权利要求6-9任一项所述制备方法制得的基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物在免疫分析中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种基于蛋白纳米线的3D探针?磁性微珠复合物，包括磁性微珠和蛋白纳米线，所述蛋白纳米线表面包括至少一种功能配体和至少一种连接配体，所述蛋白纳米线通过连接配体连接在磁性微珠表面。本发明利用纳米线较大的比表面积，展示在其上的配体形成3D高密度固定，一方面提高配体数量，利用高密度展示形成多价效应，提高特异性配体的结合力；另一方面通过自组装的方式实现抗原或抗体等分子的定向固定，最大程度的保留功能分子活性，减少常规化学交联的损伤，从而提高对样品中待测目标的捕获效率。复合物通过连接配体将蛋白纳米线与磁性微珠相连，利用磁性微珠快速分离的性质，减少检测时间，进而实现快速高通量的病原筛查或疾病检测。
【IPC分类】G01N33/543
【公开号】CN105717287
【申请号】CN201610051186
【发明人】门冬, 张先恩, 周娟, 张治平, 李唯
【申请人】中国科学院武汉病毒研究所
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年1月26日