玫瑰的花青素还原酶RrANR基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地指一种玫瑰的花青素还原酶RrANR基 因及其编码蛋白和应用，该基因与植物原花青素合成有关。
【背景技术】
[0002] 原花青素（Procyanidins，PAs)是植物界中广泛存在的一大类多酷类化化合物的 总称（吕丽爽等，2007)。大量研宄发现原花青素是迄今为止所发现的最强有效的自由基 清除剂之一，其清除氧自由基的能力比常用的天然抗氧化剂，比如类胡萝卜素、维生素C和 维生素E等都要强很多，它可以保护植物不受UV的伤害以及真菌的侵染，原花青素含量的 增加可以提高植物的抗氧化能力（Winkel-Shirley, 2002 ;Dixon, 2005 ;Yuan，2013)。国内 报道从黑莓、葡萄、荔枝、茶和落叶松等提取原花青素都具有不同程度抗氧化作用（徐怀德 等，2008 ;周玮婧等，2012 ;王威等，2011 ;姜贵全，2013 ;蒋其钟，2010)。自由基和氧化应激 是导致众多心血管疾病的重要原因，原花青素可通过强大的抗氧化活性，保护心血管系统。 动物实验和临床研宄表明，原花青素可通过降低胆固醇水平，减少血管壁上的胆固醇沉积， 提高血管弹性来降低血压（Packeret，1998)。原花青素的抗肿瘤功效国外己有许多研宄报 道，证实原花青素对多种癌细胞有不同程度的抑制作用，对皮肤癌、口腔癌、肝癌、肺癌、胰 腺癌、胃癌、结肠癌等均有一定的预防或治疗作用（杜晓芬等，2005)。原花青素的抗癌机 制，主要由于原花青素具有强大的抗氧化和清除自由基的能力，而致癌的诱发阶段与促进 阶段均与活性氧自由基相关，原花青素可以抑制诱导癌细胞生长并诱导细胞调亡。
[0003] 玫瑰（RosarugosaThunb.)是蔷薇科蔷薇属落叶丛生灌木，花型秀美，芳香四溢， 色彩绚丽，在中国传统名花中评价极高，素有"花中皇后"之称。玫瑰具有重要的经济价值， 其花瓣果实均含有原花青素，可以提取、分离纯化出原花青素，进行工艺优化，使之更加科 学化、高效化和产业化，创造出更大的经济效益有利于提高产品的附加值，开发出符合人们 需要的功能食品、保健食品、营养滋补品和药品等系列产品，使特种资源变成经济优势，其 前景将更加广阔。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种玫瑰的花青素还原酶（Anthocyanidin Reductase)RrANR基因及其编码蛋白和应用。该基因与植物原花青素合成有关。将该基因 的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体，转基因植株的花色发 生变化，原花青素含量显著增加，转基因植株的抗氧化能力明显增强。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种玫瑰的花青素还原酶RrANR基因，其核 苷酸序列为SEQIDNo. 1所示，其长度为1020bp。
[0006] 进一步地，获得所述RrANR基因核苷酸序列引物对为：
[0007]P1 正向引物：5' -ATGGCCACCCCCCAACCC-3' ；
[0008]P2 反向引物：5 ' -CTAGCTCTGCAGCTCCCC-3 '。
[0009] 本发明还提供了一种RrANR基因编码的花青素还原酶RrANR，其氨基酸序列为由 SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，其长度为339bp。
[0010] 本发明还提供一种重组表达载体，它含有权利要求1所述的原核表达载体。
[0011] 进一步地，所述的原核表达载体为遗传转化载体pCAMBIA2300s。
[0012] 本发明还提供了一种含有重组表达载体的大肠杆菌DH5a表达菌株。
[0013] 本发明还提供了一种含有重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞 为农杆菌EHA105。
[0014] 本发明还提供了下述各项之一在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用， 包括：
[0015] 1)权利要求3或4所述的重组表达载体，
[0016] 2)含有权利要求3或4所述重组表达载体的大肠杆菌DHlOBac表达菌株；
[0017] 3)含有权利要求3或4所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细 胞为农杆菌EHA105。
[0018] 进一步地，所述的植物为烟草。
[0019] 本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括以下步骤：
[0020] 1)目的基因的克隆；
[0021] 2)植物表达载体构建；
[0022] 3)受体的遗传转化；
[0023]4)阳性转基因植株的鉴定；
[0024]5)转基因植物表型及生理分析。
[0025] 进一步地，所述阳性转基因植株的鉴定的引物对为：
[0026]P3正向引物：5 '-TGAAGGGAGCTTCGATGCTGCTA-3'；
[0027]P4反向引物：5 '-TITCGTCCGCAATCAAGCCTGTG-3'。
[0028] 本发明可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，通过直接DNA转 化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的RrANR的编码基因导入植物细 胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体 中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对 转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性 的抗生素标记物（例如卡那霉素或潮霉素等）。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植 物，培育不同花色的植物种类。
[0029] 本发明的有益效果在于：
[0030] 本发明将玫瑰中克隆分离得到花青素还原酶基因（RrANR)导入烟草植株中，可以 显著提高转基因植株中原花青素的含量，从而可以提取、分离纯化出更多的原花青素，创造 出更大的经济效益有利于提高产品的附加值；并且将RrANR转化植株可以增强植物的抗逆 性，为下一步培育具有高含量原花青素高抗氧化性的转基因玫瑰新品种奠定基础。
【附图说明】
[0031] 图1为是本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图；
[0032] 图2为本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300sRrANR构建示意图；
[0033] 图3为对照早花烟草与转化RrANR基因的早花烟草的花色比较图；
[0034] 图中：图3A为对照早花烟草花色；图3B为本发明转RrANR早花烟草的花色；
[0035] 图4为RrANR基因在转基因植株中的表达量情况图；
[0036] 图中：Col为早花烟草（作为转基因早花烟草的对照），#5, #9和#12为3个转基 因株系；
[0037] 图5为对照早花烟草与转化RrANR基因的早花烟草花瓣花青素含量图；
[0038] 图中：Control为早花烟草（作为转基因早花烟草的对照），#5, #9和#12为3个 转基因株系，*，林和林*分别表明P〈〇. 05,P〈0. 01和P〈0. 001的差异水平；
[0039] 图6为对照早花烟草与转化RrANR基因的早花烟草花瓣原花青素含量图；
[0040] 图中：Control为早花烟草（作为转基因早花烟草的对照），#5, #9和#12为3个 转基因株系。*，**和林*分别表明P〈〇. 05,P〈0. 01和P〈0. 001的差异水平；
[0041] 图7为脱水前后未转化植株和三个转基因株系表型；
[0042] 图中：图7A为脱水前后氮蓝四唑（NBT)对超氧阴离子的染色；
[0043] 图7B为脱水处理后电导率的测定；*，林和林*分别表明P〈0.05,P〈0.01和 P〈0. 001的差异水平；Control为早花烟草（作为转基因早花烟草的对照），#5, #9和#12为 3个转基因株系。
[0044] 图8为过氧化氢处理未转化植株和三个转基因株系表型；
[0045] 图中：图8A为过氧化氢处理后二氨基联苯胺（DAB)对过氧化氢染色；图8B为过氧 化氢处理后丙二醛含量的测定。*，**和林*分别表明P〈〇. 05,P〈0. 01和P〈0. 001的差异 水平；Control为早花烟草（作为转基因早花烟草的对照），#5, #9和#12为3个转基因株 系。
【具体实施方式】
[0046] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但