本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0047] 实施例1分离克隆RrANR基因
[0048] 本发明的前期对丰花玫瑰（又称"平阴一号"，http://tc.cctv. com/20100412/103621.shtml，丰花玫瑰的选育文献已经公开发表，见：吕传润（平阴玫瑰 研宄所），玫瑰新品种-丰花玫瑰及栽培技术，山东林业科技，2007, 5 :77 ;华中农业大学园 艺林学学院园艺植物生物学花丼实践教学基地从山东省平阴县平阴玫瑰研宄所引种）不 同时期的花朵进行了转录组测序（转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成），在转 录组测序结果设计特异引物：
[0049]P1正向引物：5 '-ATGGCCACCCCCCAACCC-3'，
[0050]P2反向引物：5'-CTAGCTCTGCAGCTCCCC-3'；
[0051] 将测序序列的l_1020bp从玫瑰品种'丰花'（即丰花玫瑰）花瓣RNA反转录得到 的cDNA中扩增出来，扩增得到的片段如SEQIDNo. 1所示：
[0052] 其具体步骤如下：具体步骤为：
[0053] 1、采用常用的CTAB法（参照：《植物基因工程》，王关林，方宏筠主编）从玫瑰品种 '丰花'中提取花瓣总RNA，具体步骤如下：
[0054] 1)向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液（2% (W/V)CTAB， NaCl1. 4mol/L,EDTA(乙二胺四乙酸）20mmol/L,Tris*Cl100mmol/L，2 % (W/V)pvp)和 10%的e-巯基乙醇，在水浴锅中预热；
[0055] 2)将玫瑰花瓣用液氮冷却研磨，加入提取液中，混勾，65°C水浴10分钟；
[0056] 3)加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24 :1)混合液，颠倒混匀，静置lOmin，4°C 下 12000g离心lOmin;
[0057] 4)取上清，重复步骤3);
[0058] 5)取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，12000g，4°C离心15分 钟，弃上清，用75%乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯）处理水中待用；
[0059] 6)以从玫瑰品种'丰花'中提取花瓣总RNA为模板，利用反转录酶（购自宝生物 工程大连有限公司）将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65°C5min，42°C50min， 70°ClOmin；
[0060] 7)根据转录测序中的序列设计的特异引物：
[0061]P1 正向引物：5 '-ATGGCCACCCCCCAACCC-3'，
[0062]P2 反向引物：5' -CTAGCTCTGCAGCTCCCC-3'；
[0063] 将RrANR从玫瑰品种'丰花'花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来；
[0064] 反应条件：
[0065] 94°C预变性 4min;94°C30sec，60°C30sec, 72°Clmin, 37 个循环；72°C延伸 10min〇 将扩增获得的PCR产物连入pMD?18-T载体（购自宝生物工程大连有限公司），筛选阳性 克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆被命名为pMD?18-RrANR质粒。
[0066] 实施例2RrANR基因超量表达载体的构建，转化
[0067] 为了能更好地阐明该基因的功能，将其在烟草中超量表达，从转基因植株的表型 来验证。具体步骤是：
[0068] 首先将实施例1中得到的阳性克隆pMD?18-RrANR质粒用BamHI和SalI双酶 切，回收目的片段；同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化载 体pCAMBIA2300s(该遗传转化载体来自湖北省武汉市华中农业大学作物遗传改良国家重点 实验室构建和赠送）。酶切完毕，用包含RrANR基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(图 1)载体做连接反应，转化大肠杆菌DH5a(大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司）。 通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体，将其命名为pCAMBIA2300s-RrANR。
[0069] 通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将其导入到早花烟草中，经过侵染、共培养、 筛选同时具有卡那霉素抗性和潮霉素抗性的转化苗，再通过生根、练苗移栽等常规步骤，得 到转基因植株。
[0070] 遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：
[0071] (1)试剂和溶液缩写
[0072] 本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下： 6-BA(6-BenzylaminoPurine，6_ 节氨基嗓呤）；NAA(Naphthaleneaceticacid，萘乙酸）； Kan(Kanamycin，卡那霉素）；Cef(Cefotaxime，头孢霉素）；Hyg(Hygromycin，潮霉素）
[0073] (2)用于早花烟草遗传转化的培养基配方
[0074] 表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。
[0075] 表1早花烟草转化培养基设计
【主权项】
1. 一种玫瑰的花青素还原酶RrANR基因，其核苷酸序列为SEQIDNo. 1所示，其长度为 1020bp〇
2. 根据权利要求1所述的RrANR基因，其特征在于：获得所述RrANR基因核苷酸序列 引物对为： Pl正向引物：5' -ATGGCCACCCCCCAACCC-3' ； P2 反向引物：5' -CTAGCTCTGCAGCTCCCC-3'。
3. -种权利要求1所述的RrANR基因编码的花青素还原酶RrANR，其氨基酸序列为由 SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4. 一种重组表达载体，其特征在于：它含有权利要求1所述的原核表达载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的原核表达载体为遗传转 化载体pCAMBIA2300s。
6. 含有权利要求4或5所述重组表达载体的大肠杆菌DH5a表达菌株。
7. 含有权利要求4或5所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为 农杆菌EHA105。
8. 下述各项之一在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用，其特征在于： 1) 权利要求4或5所述的重组表达载体； 2) 含有权利要求4或5所述重组表达载体的大肠杆菌DHlOBac表达菌株； 3) 含有权利要求4或5所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为 农杆菌EHA105。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的植物为烟草。
10. -种培育具有干旱性和盐害性的转基因植物的方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 目的基因的克隆； 2) 植物表达载体构建； 3) 受体的遗传转化； 4) 阳性转基因植株的鉴定； 5) 转基因植物表型及生理分析。
11. 根据权利要求培育转基因植物的方法，其特征在于：所述阳性转基因植株的鉴定 的引物对为： P3 正向引物：5' -TGAAGGGAGCTTCGATGCTGCTA-3' ； P4 反向引物：5 ' -ITTCGTCCGCAATCAAGCCTGTG-3 '。
【专利摘要】本发明公开了一种玫瑰的花青素还原酶RrANR基因及其编码蛋白和应用，玫瑰的花青素还原酶RrANR基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其长度为1020bp。该基因与植物原花青素合成有关。RrANR基因编码的花青素还原酶RrANR，其氨基酸序列为由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明将玫瑰中克隆分离得到花青素还原酶基因(RrANR)导入烟草植株中，可以显著提高转基因植株中原花青素的含量，从而可以提取、分离纯化出更多的原花青素，创造出更大的经济效益有利于提高产品的附加值；并且将RrANR转化植株可以增强植物的抗逆性，为下一步培育具有高含量原花青素高抗氧化性的转基因玫瑰新品种奠定基础。
【IPC分类】C12N15-53, A01H5-00, C12N9-02, C12Q1-68, C12N15-11, C12R1-19, C12N15-82, C12N1-21, C12N15-70
【公开号】CN104694491
【申请号】CN201510025206
【发明人】宁国贵, 罗平, 包满珠, 申玉晓, 黄莎莎
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年1月19日