专利名称：一种海洋真菌培养物的提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种南海红树林内生真菌培养物的提取物及其制备方法，以及该提取物在制备抗棉铃虫和鱼类寄生虫中华鳋的农药中的应用。
背景技术：
棉铃虫Heliothis armigera(Hühner)是棉花蕾铃期主要害虫之一。棉铃虫发生期早、为害时间长、发生量大、发生面广、发生不平衡，世代重叠。适应性强是90年代棉铃虫发生重的内因，棉铃虫食性杂，除为害棉花外，还能取食玉米、小麦、大豆、花生、果树、蔬菜等多种植物，繁殖力强，产卵量大，对温度的适应范围广，使棉铃虫得以充分利用各种植物资源最大限度地繁衍种群。不合理用药，棉铃虫抗药性增强，天敌减少，90年代以前棉铃虫仅在少数年份发生重，大部分年份发生较轻，发生为害集中，在卵高峰期用药即可。进入90年代后，棉铃虫接连大发生，为害时间长，在卵高峰用药偏迟，有的甚至完全凭借经验，有虫三遍药，无虫药三遍，没有抓住防治的最佳时期。连续使用同一种或作用机制相同的同一类药剂，任意加大使用浓度或降低用量，使用次数增多，任意药剂复配，导致田间较高的药剂选择压力，使抗性种群不断扩大，棉铃虫的抗性增强。过早使用化学农药，杀伤大量棉铃虫天敌，破坏了良好的生态环境，失去了天敌对棉铃虫的控制作用，形成了恶性循环。
抗药性棉铃虫是严重为害棉花和多种作物的害虫，近年来在我国长江流域、黄河流域以及新疆等主要产棉区发生量大，并且对常用的3种不同类型化学农药即有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药均产生了不同程度的抗性，尤其是对拟除虫菊酯类农药的抗性发展速度最快，给有效防治造成了很大困难，使我国的棉花生产遭受了很大损失。因此，从海洋微生物中开发研究生物农药以防治抗药性棉铃虫具有重要意义。
中华鳋(Sinergasilus spp)是鱼的常见严重寄生虫，常常造成鱼减产和大批死亡。目前防治此类寄生虫的药剂主要是敌百虫等药剂。这些药剂的长期使用已造成寄生虫对药剂产生抗药性。因此，寻找新的生物农药是当务之急。[潘金培，鱼病诊断与防治手册，上海科技出版社(上海)，1997，P117-126；陈万义等，新农药研究与开发，化学工业出版社，(北京)，1995，P121-143]从海洋生物中寻找新的生物农药，是一种有效的途径。一个非常成功的例子是日本开发的巴丹，它是从海洋沙蚕毒素发展出来的，是一种高效广谱的农药，占日本杀虫剂总消耗量20％以上，并大量出口。[龙康侯，巫中德，海洋天然产物化学(第一卷)，海洋出版社(北京)，1983，P282]本发明所涉及的海洋真菌是一种红树林内生真菌。植物内生真菌(Endophytic fung)生活在高等植物的组织中，对于内生真菌的次级代谢物的研究还较为缺乏，据保守的估计内生真菌的种类繁多，大约有1.5×106种，由于数量庞大，而且与其他生物之间紧密的生态关系，使这类真菌成为潜在的具有产生丰富的次级代谢物的来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的具有潜在农药价值的海洋真菌培养物的提取物及其提取分离方法，以及该提取物在制备抗棉铃虫和鱼类寄生虫中华鳋农药的用途。
本发明所用的海洋真菌是南海红树林内生真菌NO1893，该真菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCCNOM202035，保藏日为2002年9月9日。该真菌以下简称为海洋真菌CCTCC M202035。
本发明的海洋真菌培养物提取物，是海洋真菌CCTCC M202035培养物的乙酸乙酯提取物中的有效部分油状物。
本发明提取物可以从海洋真菌CCTCC M202035的培养物(发酵液)的乙酸乙酯提取物中提取分离而得到。其具体制备方法包括以下步骤a.海洋真菌CCTCC M202035的种子培养培养基(按重量比)葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；b.海洋真菌CCTCC M202035的发酵培养发酵培养基(按重量比)葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，氯化钠3-5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2月；c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.将发酵液加热浓缩至原液体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗，然后用乙酸乙酯/石油醚＝50％为洗脱剂洗脱；e.收集50％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，浓缩得棕色油状物即为所需的本发明提取物。
实验证明，本发明的提取物(油状物)能杀死棉铃虫和鱼类寄生虫中华鳋。具体效果可达到1000μg/ml，24hr，100％杀灭棉铃虫；1.2μg/ml，48hr，100％杀灭中华鳋。所以，本发明的提取物可用于制备抗棉铃虫的农药和用于制备抗鱼类寄生虫中华鳋的农药。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1 本发明提取物——棕色油状物的分离制备方法a.真菌NO1893的种子培养培养基(按重量比)葡萄糖1，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，琼脂1，氯化钠3，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，35℃培养7天；b.真菌NO1893的发酵培养发酵培养基(按重量比)葡萄糖2kg，酵母提取物0.2kg，蛋白胨0.4kg，氯化钠6kg，水200L；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1.5月；
c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.将发酵液加热浓缩至原液体积的50L，用等量乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，得到8g浓缩物，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗，然后用乙酸乙酯/石油醚＝50％为洗脱剂洗脱；e.收集洗脱液，浓缩得棕色油状物3.3g。实施例2 本发明提取物——棕色油状物杀灭中华鳋和棉铃虫活性试验1.抗棉铃虫试验将实施例1得到的棕色油状物按1000μg/ml进行系列浓度稀释，然后均匀地将其喷雾到菜心叶子上，自然晾干后，将人工养殖的2～3龄棉铃虫用毛笔接到各处理的叶子上，在26℃的条件下养殖，每24小时调查一次各处理棉铃虫的死亡百分率，以无菌水为空白对照，每处理3个重复。结果1000μg/ml，24hr，100％杀灭棉铃虫。
2.抗鱼类寄生虫中华鳋的试验用500ml三角瓶将实施例1得到的棕色油状物进行系列浓度稀释，然后将中华鳋接到各处理的三角瓶中，在26℃的条件下养殖，每4小时调查一次各处理中华鳋的死亡百分率，以无菌水为空白对照，每处理3个重复。实验结果见表1。从表1的结果数据可知本发明提取物对鱼类寄生虫中华鳋具有明显的杀灭作用，而且存在明显的量效关系当8μg/ml浓度时，4小时便能100％杀灭害虫；而从1.2-2μg/ml，则需要48小时；0.8μg/ml，基本无活性.。
表1.本发明提取物对中华鳋的杀灭效果
权利要求
1.一种海洋真菌培养物的提取物，其特征是该提取物是海洋真菌CCTCC M202035培养物的乙酸乙酯提取物中的有效部分油状物。
2.权利要求1所述提取物的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤a.海洋真菌CCTCC M202035的种子培养培养基组成按重量比为葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；b.海洋真菌CCTCC M202035的发酵培养发酵培养基组成按重量比为葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，粗海盐1.5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2月；c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.将发酵液加热浓缩至原液体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗后，再用乙酸乙酯/石油醚＝50％为洗脱剂洗脱；e.收集50％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，浓缩得棕色油状物即为所需的提取物。
3.权利要求1所述的提取物用于制备抗棉铃虫的农药。
4.权利要求1所述的提取物用于制备抗鱼类寄生虫中华鳋的农药。
全文摘要
本发明涉及一种南海红树林内生真菌的培养物的乙酸乙酯提取物有效部分油状物及其制备方法和该提取物在制备杀灭棉铃虫[Heliothis armigera(Hühner)]和鱼类寄生虫中华鳋(Sinergasilus spp)的农药中的应用。
文档编号A01N63/04GK1409967SQ0213496
公开日2003年4月16日 申请日期2002年10月17日 优先权日2002年10月17日
发明者林永成, 陈光英, 佘志刚, 李厚金, 周世宁, 林壁润, 关利平 申请人:中山大学