专利名称：简易α(1，3)半乳糖转移酶表达阴性猪的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种低移植排斥反应异种移植供体猪，特征是α(1，3)半乳糖转移酶表达阴性或降低，作为异种移植供体，减少移植排斥反应的发生。制备方法主要应用小RNA干扰技术，同源重组和核移植技术。这种猪可以用于细胞疗法或异种移植。
背景技术：
由于供体器官短缺，人们希望异种移植作为器官供应的替代方式。猪，特别是小型猪，具有强大的供应能力，较低的动物源性感染几率，适当的器官大小，较少的社会伦理关注，是一种非常吸引人的非人灵长类异种移植供体。异种移植最大的障碍是超急排斥现象(HAR)。这是一种非常快速而严重的体液免疫排斥反应，导致供体器官移植后几分钟到几小时内破坏。HAR是系列反应的复合体，包括补体系统激活，凝血蛋白激活，内皮细胞激活和炎性蛋白释放。大量证据提示存在预先形成的抗体，即天然抗体，是种间移植存在HAR的基础。
HAR中的人的天然抗体可以广泛识别猪抗原，但实际上，90％以上人血清内的补体依赖性排异反应天然抗体只识别猪抗原的一个结构，就是α(1，3)半乳糖基，它是猪抗原的抗原决定簇，这些抗原都特异性地携带一个α(1，3)半乳糖基的末端结构，α(1，3)半乳糖基的形成，主要由α(1，3)半乳糖转移酶催化，这种酶在低等动物和新世界猴体内表达，人、猿、及旧世界猴体内都缺乏这种酶。由于人体不表达α(1，3)半乳糖转移酶，也不携带α(1，3)半乳糖的抗原决定簇，因此频繁地与该抗原接触使得体内的天然抗体有很高的效价。敲除猪的α(1，3)半乳糖转移酶基因，可以在很大程度上减少HAR的发生。
1989年Capecchi等设计了正负筛选技术来筛选同源重组的克隆。首先，体外构建打靶载体，在靶基因的同源序列之间插入新霉素抗性基因(Neor)作为正筛选的标志，在同源序列的3′端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择，HSV-tk基因由邻近的Neor基因启动子调节。将打靶载体通过电穿孔法导入细胞后，因为随机整合使Neor基因与tk基因同时整合至基因组中，tk基因的表达产物能代谢9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(ganciclovir，GCV)生成致死核苷从而杀死随机整合细胞，而同源重组细胞由于仅有位于同源序列之间的Neor基因整合，在G418和GCV的双重筛选下仍能存活。这种技术能将同源重组细胞浓缩20-1000倍，从而有可能从大量的随机整合细胞中筛选到同源重组克隆。
小RNA干扰技术(siRNAs)荣登美国著名《科学》杂志2002年度重大科技突破的榜首。我们利用其强大的沉默靶基因的能力，设计针对猪的α(1，3)半乳糖转移酶的小RNA干扰元件，克隆入α(1，3)半乳糖转移酶第9外显子缺失的同源重组载体，使得同源重组时获得的阳性克隆，即使等位基因杂合缺失，也能达到α(1，3)半乳糖转移酶阴性表达或低表达的目的。
哺乳动物体细胞核移植技术是二十世纪生物学领域重大突破。用通常的选育方法，选育一个优良个体要几十年，用体细胞核移植技术可以在短时间内获得某一优良个体的大量复制品，并可免去后裔测定。通常的动物保种是靠维持一定数量个体来实现，需要大量人力和财力。依靠体细胞核移植技术，保存一定数量个体的体细胞就可以达到动物保种目的，在必要时通过体细胞核移植生产动物就可满足需要。另外Le Bourhis等报道用细胞核移植技术可以生产某一特定性别的后代，比人工选择后代性别或通过胚胎性别鉴定更方便、更准确。
发明内容
为了减少异种移植时HAR的发生，作者利用同源重组技术敲除了猪的基因组中α(1，3)半乳糖转移酶的第9外显子，引入针对猪的α(1，3)半乳糖转移酶的小RNA干扰元件，使得即使等位基因杂合缺失阳性克隆，也出现α(1，3)半乳糖转移酶阴性表达或低表达，试验结果令人鼓舞，这种方法产生的猪的器官和组织不表达α(1，3)半乳糖的抗原决定簇。
本项发明提供了这种猪制备和应用方法一、异种移植供体猪制备方法提供了一种用分子生物学，核移植和胚胎工程技术学方法制备低移植排斥反应异种移植供体猪的的方法。这种方法敲除了猪的基因组中α(1，3)半乳糖转移酶的第9外显子，引入针对猪的α(1，3)半乳糖转移酶的小RNA干扰元件。
例如，低移植排斥反应异种移植供体猪这样准备(a)构建敲除猪的基因组中α(1，3)半乳糖转移酶的第9外显子，引入针对猪的α(1，3)半乳糖转移酶的小RNA干扰元件的同源重组载体；(b)将(a)中载体利用同源重组技术整合到猪细胞系中筛选出正确阳性克隆；
(c)以(b)中正确阳性克隆的细胞核为供体核，以猪激活去核卵母细胞为受体，用核移植技术构建目的移核胚；(d)用胚胎工程技术将目的移核胚植入同步妊娠猪，获得完全发育目的个体；(e)回交获得目的个体的纯合子。
二、异种移植供体猪应用方法此项发明提供了一种异种移植的方法。这种方法拓展了器官移植供体来源。例如，低移植排斥反应异种移植供体猪这样准备一个较好的具体实例是，恢复切除肾脏的功能，方法如下(a)切除灵长类动物的双肾；然后(b)移植低移植排斥反应异种移植供体猪双肾，恢复肾脏功能。
实施例1例如，低移植排斥反应异种移植供体猪这样准备(a)构建敲除猪的基因组中α(1，3)半乳糖转移酶的第9外显子，引入针对猪的α(1，3)半乳糖转移酶的小RNA干扰元件的同源重组载体；(b)将(a)中载体利用同源重组技术整合到猪细胞系中筛选出正确阳性克隆；(c)以(b)中正确阳性克隆的细胞核为供体核，以猪激活去核卵母细胞为受体，用核移植技术构建目的移核胚；(d)用胚胎工程技术将目的移核胚植入同步妊娠猪，获得完全发育目的个体；(e)回交获得目的个体的纯合子。
实施例2一个较好的具体实例是，恢复切除肾脏的功能，方法如下(a)切除灵长类动物的双肾；然后(b)移植低移植排斥反应异种移植供体猪双肾，恢复肾脏功能。
权利要求
1.一种低移植排斥反应异种移植供体猪，用于细胞疗法或异种移植。其特征是具有如下性质(1)α(1，3)半乳糖转移酶表达阴性或降低；(2)作为异种移植供体，减少移植排斥反应的发生；(3)制备方法主要应用小RNA干扰技术，同源重组和核移植技术；(4)杂合父系或回交获得的子代，α(1，3)半乳糖转移酶表达阴性或降低。
2.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是α(1，3)半乳糖转移酶表达阴性或降低。
3.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是作为异种移植供体，减少移植排斥反应的发生。
4.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是制备方法主要应用小RNA干扰技术(siRNAs)，同源重组和核移植技术。
5.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是利用α(1，3)半乳糖转移酶第9外显子缺失的同源重组载体敲除。
6.根据权利要求5所述的供体猪，其特征是；α(1，3)半乳糖转移酶第9外显子缺失的同源重组载体的同源序列内部含有沉默α(1，3)半乳糖转移酶的小RNA干扰元件。
7.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是杂合父系至少一个等位基因包含沉默α(1，3)半乳糖转移酶的小RNA干扰元件，缺失α(1，3)半乳糖转移酶第9外显子。
8.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是纯合子代两个等位基因缺失α(1，3)半乳糖转移酶第9外显子。
9.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是利用核移植技术和胚胎工程技术获取。
10.根据权利要求1所述的供体猪，其特征是杂合父系或回交获得的子代，α(1，3)半乳糖转移酶表达阴性或降低。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种低移植排斥反应异种移植供体猪，特征是α(1，3)半乳糖转移酶表达阴性或降低，作为异种移植供体，减少移植排斥反应的发生。制备方法主要应用小RNA干扰技术，同源重组和核移植技术。这种猪可以用于细胞疗法或异种移植。
文档编号A01K67/02GK1526280SQ0314735
公开日2004年9月8日 申请日期2003年7月12日 优先权日2003年7月12日
发明者杨捷, 严泉剑, 陶晓灵, 杨 捷 申请人:杨捷, 严泉剑, 陶晓灵, 杨 捷