细胞增殖、发育分化受到改变的植物细胞和植物的制作方法

专利名称：细胞增殖、发育分化受到改变的植物细胞和植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及调控植物的细胞增殖和/或发育分化的方法，并涉及为此目的所使用的分子。本发明还涉及对细胞增殖和/或发育分化相关的基因进行调控而制备的植物及其利用技术。
背景技术：
植物具有与其它真核生物不同的独特胚胎学特征。因为植物细胞不移动，所以认为细胞分裂、生长和程序性细胞死亡决定了形态形成。细胞在茎端和根端这两极存在的分裂组织中增殖，随着所增殖细胞的分化和累积，个体发生发育分化，形成个体的细胞数和细胞大小决定了植物的大小。通过环境条件的变化等改变细胞周期，从而改变细胞增殖，使植物个体的大小与环境相适应。另外，在植物个体的分化阶段，对细胞周期的调控也是重要的。例如，根的内鞘细胞在细胞周期的特定时期(G2期)生长停滞时，由所述细胞是否开始分裂决定了侧根的分化。另外，虽然在植物的胚轴中细胞数是确定的，但如果放置在暗处，细胞周期会变化，由于核内再复制，细胞的大小发生变化。
因此，认为作为植物的生长、形态、应激反应等为课题总体上进行植物育种的新方法，调节植物的细胞分裂尤其是调控细胞周期的方法是重要的。
一个细胞经过称为细胞周期的一系列过程，分裂为两个子细胞，其中所述细胞周期由G1期(间期1)、S期(DNA合成期)、G2期(间期2)和M期(分裂期)这4个时期组成。对所述细胞周期的S期以及M期的调控相关机制进行了深入研究。其中M期也称为有丝分裂期，是将S期复制的染色体正确分配至子细胞的时期。在向M期进入时，以细胞周期蛋白B为代表的细胞周期蛋白与CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)结合，形成活性复合体，促进染色体的凝集、核膜的解体。然后，M期经历染色体分配之后的称为细胞质分裂的细胞质二分过程而结束，在为植物细胞的情况下，形成特殊的结构即成膜体而进行细胞质分裂。由驱动蛋白样蛋白质NACK1、NACK2调控所述成膜体的形成。
植物细胞自向M期进入开始至结束所经历的过程中显示重要功能的细胞周期蛋白B、NACK1及NACK2呈现出G2/M期特异的基因表达模式。据报导这些基因的时期特异性表达是在启动子区存在的称为M特异的激活子(MSA)这一特定调控序列的调控下进行的(非专利文献1)。另外，至今已了解到除了作为植物特有的CDK即CDKB、在蛋白质分解相关的E2酶中与细胞周期蛋白特异的E2酶具有高相似性的基因外，还有许多功能未知的基因显示出M期特异的表达模式。通过分析启动子区，发现这些基因的启动子中存在MSA序列的情况较多，由此认为由MSA序列产生的G2/M期特异基因表达调控机制在植物中是普遍保守的。
至今鉴定出了来自烟草的与MSA序列结合的因子NtmybA1、NtmybA2、NtmybB(下文中将它们总称为Ntmyb进行使用)。Ntmyb蛋白质在氨基酸序列上存在的一大特征为与动物c-myb等中存在的由不完全的3个重复序列组成的myb DNA结合区(具有此区域的蛋白质在下文中简称为3Rmyb)显示出高的相似性。在植物中，虽然存在许多具有myb样DNA结合区的基因，但几乎都是由2个重复序列或没有重复序列的myb区域组成。例如对其基因组已全部经测序的拟南芥菜，在全长基因组中具有myb样DNA结合区的基因有100多种，但显示为由前述3个重复序列组成的myb DNA结合区(3Rmyb)的基因只有5种，所以了解了其在组成植物myb样蛋白质的超家族中是一种特殊的存在结构(非专利文献2)。
在植物细胞内进行的关于Ntmyb功能的瞬时表达实验中，据报导在进行的报告基因转录调节实验中，由NtmybA1和NtmybA2活化CYM(长春花细胞周期蛋白B)启动子、NACK1启动子的转录，而NtmybB抑制它们的转录得出Ntmyb结合MSA序列，为在G2/M期特异表达的基因的转录调节因子(非专利文献3)。但是，这些报导中对许多基因周期性表达调控的细胞周期，只有关于在细胞周期的某一时刻瞬时表达的Ntmyb对报告基因的转录活化结果。还没有揭示在细胞周期和细胞分裂等中Ntmyb的功能。
至今已报导了经G2/M期特异表达的基因转化的植物生长发育受到改变的例子。例如，在异位表达细胞周期蛋白B的经转化植物中，促进了其根的延伸(非专利文献4)，另外，在抑制M期结束所需基因NACK1表达的植物和经显性失活型NACK1转化的植物中，细胞质分裂是不完全的，从而抑制了植物的高度(非专利文献5)。但是，这些仅为利用个别涉及M期进程的基因而调控细胞增殖的尝试，还没有有关将G2/M期特异基因合起来进行表达调控的经转化植物的报导，其中所述G2/M期特异基因包括通过MSA序列而调控表达的未知基因。
Ntmyb具有与c-myb同源性高的myb DNA结合区。认为c-myb蛋白质中的EVES基序与myb DNA结合区结合时，c-myb处于转录的非活化状态，但蛋白激酶使EVES基序磷酸化，从而改变该蛋白质内的立体结构，共激活因子P100变得可结合myb DNA结合区并活化转录(非专利文献6)。由于观察到Ntmyb在myb DNA结合区以外与c-myb无相似性，EVES基序等的调控序列也不保守，由此认为c-myb蛋白的转录活化功能的调节机理与Ntmyb的调节机理不同。至今还没有有关调节Ntmyb转录活化功能的区域的报导。
至今仅报导了在烟草、拟南芥菜的双子叶植物中具有编码植物3Rmyb全长的DNA，在单子叶植物中未报道全长的3Rmyb。由此可见，没有有关MSA序列和3Rmyb介导的G2/M期特异的基因表达调控机理在单子叶植物和双子叶植物中均保守的明确的例子。
公知与大多数为2倍体的动物不同，植物有多种多倍性。小麦属有6倍体，茼蒿属有10倍体。显示这些多倍性的植物通常在农业上表现出有用的特性，制备多倍性植物作为一种育种手段而使用。至今广泛使用秋水仙碱处理而制备多倍体的技术。将植物种子、幼株、或器官的组织培养细胞用秋水仙碱处理，然后再生植物体并选择。将DNA复制结束后的倍数化细胞用秋水仙碱作用防止纺锤体的形成，可获得不经过分裂期的倍数化细胞。然而，必须研究用秋水仙碱处理的器官及处理时间，在所有植物中实施并非易事。
非专利文献1Ito等，Plant Cell，10331(1998)非专利文献2Stracke等，Curr.Opin.Plant Biol.4447.(2001)非专利文献3Ito等，Plant Cell，131891(2001)非专利文献4Doerner等，Nature，380520(1996)非专利文献5Nishihama等，Cell，10987(2002)非专利文献6Dash等，Genes Dev.，101858(1996)发明详述如上所述，由于在植物育种中对细胞周期的调控是重要的，本发明的目的是提供改变植物细胞的增殖的新技术。即本发明的目的是提供通过改变植物细胞的增殖而改变植物个体的发育分化的技术，并提供为此而使用的植物基因。
另外，本发明的目的是提供明显改变植物3Rmyb基因功能的方法，并提供功能改变的新3Rmyb蛋白分子。
本发明人通过深入研究，阐明了植物3Rmyb基因是植物细胞增殖的必需因子，完成了以该基因为靶标而改变植物细胞增殖的技术及改变植物个体发育分化的技术。另外，发现这些技术为可应用于广泛植物的技术。
即制备了植物3Rmyb蛋白活性受到改变的植物细胞和植物体，明确了这些植物细胞和植物体中细胞增殖和/或发育分化受到改变。
另外，首次明确了具有特定氨基酸序列的植物3Rmyb(以NtmybA2等所代表)为细胞周期及细胞分裂相关的正调控因子，而与它们具有不同氨基酸序列的植物3Rmyb(以NtmybB代表)为细胞周期及细胞分裂相关的负调控因子，并将它们用于前述植物3Rmyb蛋白的活性受到改变的植物细胞和植物体。
另外，本发明人首次制备了植物3Rmyb蛋白这一转录因子的变体，发现了其功能的改变。发现使用这些变体的植物细胞和植物体内的植物3Rmyb蛋白的活性受到改变。即在植物3Rmyb蛋白的氨基酸序列中，发现了调节下游基因转录活性的区域，成功制备了改变转录活性的分子。成功制备了转录活性显著提高的植物3Rmyb蛋白变体、对植物3Rmyb基因的转录物显性失活地发挥作用的分子。
另外，本发明人自单子叶植物稻中分离了新的植物3Rmyb基因即编码Os3RmybA1蛋白的DNA，发现Os3RmybA1蛋白与烟草3Rmyb蛋白质NtmybA2蛋白显示出同等的功能。
基于以上了解完成了本发明。
即本发明涉及在以植物3Rmyb基因为靶标的植物中与细胞增殖的调控和/或植物个体发育分化的调控、植物细胞分裂有关的Os3RmybA1基因、其类似基因及编码这些基因的蛋白质。
在本发明中，表示与特定氨基酸或氨基酸序列的相似性的分值(比对分值)为使用CLUSTALW程序(http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-j.html)比较氨基酸序列而在结果中显示相同或类似的氨基酸比率。进一步地，前述氨基酸序列的比较通过比对以最佳形式排列的氨基酸序列对象而进行。在以下的说明中除非特别指出，两个氨基酸序列是以最佳形式排列进行比对。参数为缺省设置，以OUTPUT＝clustal、OUTORDER＝aliged、MATRIX＝blosum、GAPDIST＝8、MAXDIV＝40、ENDGAPS＝OFF、NOPGAPS＝OFF、NOHGAPS＝OFF进行。
更具体地，本发明提供了(1)与相应的野生型植物细胞相比较，植物3Rmyb蛋白活性受到改变的植物细胞。
(2)植物细胞为这样的(1)的植物细胞，所述植物细胞为具有下述(a)～(f)中任意一项所述的DNA或(g)所述的重组DNA或载体或由其转化的植物细胞(a)编码植物3Rmyb蛋白的氨基酸序列的DNA，
(b)编码与植物3Rmyb蛋白具有等同功能的蛋白质的DNA，其为与编码植物3Rmyb蛋白的氨基酸序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，(c)编码具有核酶活性RNA的DNA，其中所述具有核酶活性的RNA特异断裂编码植物3Rmyb蛋白的DNA的转录物，(d)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过共抑制作用抑制编码植物3Rmyb蛋白的DNA表达，而且，其与编码植物3Rmyb蛋白的DNA具有90％或以上的同源性，(e)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过RNA干扰作用抑制编码植物3Rmyb蛋白的DNA表达，(f)编码反义RNA的DNA，所述反义RNA与编码植物3Rmyb蛋白的DNA的转录物互补，(g)包含下述(i)至(iii)的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的上述(a)～(f)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
(3)(1)或(2)所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白为通过MSA序列活化G2/M期特异性转录的转录因子。
(4)(1)或(2)所述的植物细胞，其中通过MSA序列活化G2/M期特异性转录的转录因子-植物3Rmyb蛋白为包含氨基酸序列SILX1KRXRXLX3X4PX2XX5X1RXX5KK(序列号94，X为任意氨基酸，X1为K或R，X2为L、I或V，X3为L或V，X4为S或T，X5为D或E)的蛋白质。
(5)(1)至(4)中任意一项所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白具有的氨基酸序列为序列号32、序列号51、序列号53、序列号75或序列号76中的任意一种氨基酸序列。
(6)(1)或(2)所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白为通过MSA序列抑制G2/M期特异性转录的转录因子。
(7)(1)或(2)所述的植物细胞，其中通过MSA序列抑制G2/M期特异性转录的转录因子-植物3Rmyb蛋白为包含氨基酸序列SCSSXSX6(序列号95，X为任意氨基酸，X6为K、R、D、E或H)的蛋白质。
(8)(1)、(2)、(6)或(7)所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白具有选自序列号55、序列号77或序列号78的氨基酸序列。
(9)(1)至(8)任意一项所述的植物细胞，与相应的野生型植物细胞相比较，植物3Rmyb蛋白的表达量受到改变。
(10)(1)至(8)任意一项所述的植物细胞，与相应的野生型植物细胞相比较，细胞增殖受到改变。
(11)包含上述(1)至(10)中任意一项所述植物细胞的植物体。
(12)上述(11)所述经转化植物体的子代植物体或克隆植物体。
(13)(11)或(12)所述的植物体，与相应的野生型植物体相比较，细胞增殖和/或发育分化受到改变。
(14)为了改变细胞增殖和/或发育分化而使用的(11)或(12)所述植物体。
(15)编码与相应的野生型蛋白质相比较转录活化功能增强的植物3Rmyb蛋白的DNA。
(16)(15)所述的DNA，其中转录活化功能增强的植物3Rmyb蛋白的特征在于调节转录活化功能的调节区功能丧失。
(17)(16)所述的DNA，其中丧失功能的所述调节区的特征在于其位于序列号89所示氨基酸序列TPSILKKRHR C端。
(18)(16)所述的DNA，其中丧失功能的所述调节区的特征在于其位于序列号90所示氨基酸序列NXXTPXRLWX(X表示任意氨基酸)中W的C端。
(19)编码植物3Rmyb蛋白的(16)所述的DNA，其中丧失功能的所述调节区的特征在于其为自序列号91所述的氨基酸序列PPRFPSXDXPF(X表示任意氨基酸)起始至C端的区域。
(20)编码植物3Rmyb蛋白的(15)至(19)任意一项所述的DNA，其中功能的丧失源自氨基酸的替换、删除和/或插入。
(21)编码植物3Rmyb蛋白的(15)至(19)任意一项所述的DNA，其中功能的丧失源自氨基酸的删除。
(22)编码对内源性植物3Rmyb蛋白显示出显性失活活性的蛋白质的DNA。
(23)(22)所述的DNA，所述DNA编码的蛋白质的特征在于包含植物3Rmyb的DNA结合结构域的氨基酸序列。
(24)包含下述(i)至(iii)的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的上述(15)～(23)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
(25)具有上述(15)至(24)任意一项所述的DNA或重组DNA或载体或经它们转化的植物细胞。
(26)与相应的野生型植物细胞相比较、细胞增殖受到改变的(25)所述的植物细胞。
(27)包含上述(25)所述的植物细胞的植物体。
(28)上述(27)所述植物体的子代或克隆的植物体。
(29)与相应的野生型植物体相比较，细胞增殖和/或发育分化受到改变的(27)或(28)所述的植物体。
(30)下述(a)～(i)中任一项所述的DNA(a)编码包含序列号32所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；(b)包含序列号31所示碱基序列的DNA；(c)这样的DNA，其编码的蛋白质包含在序列号32所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的替换、删除或添加的氨基酸序列，并且分别与由序列号32所示氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(d)与包含序列号31所示碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，并且所编码的蛋白质分别与由序列号32所示氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(e)这样的DNA，其编码的蛋白质与序列号32所示的氨基酸序列进行比对，分值(比对分值)大于或等于60的氨基酸序列，并且其编码的蛋白质分别与由序列号32所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(f)编码这样的反义RNA的DNA，其中所述反义RNA与上述(a)～(e)中任一项所述DNA的转录物互补；(g)编码这样的RNA的DNA，其中所述RNA具有特异切割上述(a)～(e)中任一项所述DNA的转录物的核酶活性；(h)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过共抑制作用抑制上述(a)～(e)中任一项所述的DNA的表达，而且，其与上述(a)～(e)中任一项所述的DNA具有90％或以上的同源性，(i)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过RNA干扰作用抑制上述(a)～(e)中任一项所述的DNA的表达，而且，其与上述(a)～(e)中任一项所述的DNA具有相同的20个或以上连续碱基。
本发明的植物3Rmyb蛋白为包含含有不完全的3个重复DNA结合结构域的c-myb样myb区氨基酸序列的蛋白质，优选地，为与人c-myb蛋白质的myb DNA结合结构域(序列号88的第43位至第192位的氨基酸序列)的氨基酸序列比较时，包含显示氨基酸序列相似性的分值(比对分值)大于或等于60的氨基酸序列的蛋白质，更优选地为c-myb样myb DNA结合区中包含3个重复的序列号92所示的保守氨基酸序列W[S，T]XXE[D，E]XX[L，I，V](本序列中X为任意氨基酸，[]为显示其中供选择的任一种氨基酸)且在所述重复序列间任意插入有42个氨基酸的蛋白质。更优选地为包含序列号93所示的以下150个氨基酸序列WTXEEDXXLXXXVXXUXGX7XWKXIAXXXXXROX5JQCLHRWQKVLXPXLJKGXWOXEEDXXJXXXJXX7XGXXKWSXJOXXXXGRIGKQCRERWUNHLXPXIXX7XXWTXXEX5XXLXXXHXXXGNX7WAEJXX7XLXGX7ODNOIKNXWXSOXKKX7(本序列中X为任意氨基酸，J为I、V或L中的任一种氨基酸，O为G、S、T、C、A中的任一种氨基酸、X7为K、R、H中的任一种氨基酸，U为H、W、Y、F中的任一种氨基酸，X5为D、E中的任一种氨基酸)的蛋白质。更优选地，上述150个氨基酸的序列为WTXEEDXXLXX[A，V]VXX[F，Y]XG[K，R][N，S，R]WK[K，R，N]IAXXXXXR[S，T][D，E][V，L]QCLHRWQKVL[N，D，H]P[D，E，N]L[V，I]KG[P，S，A]W[S，T]XEED[D，E，N]X[I，L]X[E，D，Q][L，M][V，I]X[K，R][Y，N，L]G[P，A，C]XKWSX[I，V][A，S]XX[L，M][P，A]GRIGKQCRERW[H，Y]NHL[D，N]PXI[K，N，R][K，R][D，E，N][A，P]WTX[E，Q]E[E，D]XXL[I，M，C]X[A，S，Y]H[Q，R]X[N，Y，H]GN[K，R]WAE[I，L]X[K，R]XL[P，H]G[R，K][S，T]DN[S，A，G]IKN[H，L]W[H，N]S[S，T][L，V，M]KK[K，R](本序列中X为任意氨基酸，[]为显示其中供选择的任一种氨基酸，例如，[K，R]表示K或R中的任一种氨基酸)的蛋白质。甚至更优选地，植物3Rmyb蛋白质为例如序列号32、序列号51、序列号53、序列号55、序列号75、序列号76、序列号77或序列号78的任一氨基酸序列所示的蛋白质。另外，甚至更优选地，植物3Rmyb蛋白为例如序列号32、序列号51、序列号53、序列号55的任一氨基酸序列所示的蛋白质。因此，本发明提供了以下内容。
(1)具有下述(a)～(f)中任意一项所述的DNA或(g)所述的重组DNA或载体的经转化细胞(a)序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示的任一DNA，(b)编码与序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示任一DNA的转录物互补的反义RNA的DNA，(c)编码这样的具有核酶活性RNA的DNA，其中所述具有核酶活性的RNA特异断裂序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示任一DNA的转录物，(d)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过共抑制作用抑制序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示任一DNA的表达，而且，其与序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示任一DNA具有90％或以上的同源性，(e)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过RNA干扰作用抑制序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示任一DNA的表达，而且，其与序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示任一DNA 具有相同的20个或以上连续碱基，(f)这样的DNA，其编码的蛋白质相对于植物细胞内源性的序列号31、序列号50、序列号52、序列号54所示任一DNA所编码的蛋白质，显示显性失活活性，(g)下述(i)至(iii)中任一项所述的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的上述(a)～(f)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
(2)具有(1)的(a)～(f)中任意一项所述DNA或(1)的(g)所述重组DNA或载体的经转化植物细胞。
(3)(2)所述的经转化植物细胞，其用于改变植物细胞的增殖。
(4)植物细胞的增殖受到改变的(2)所述的经转化植物细胞。
(5)包含(2)～(4)所述的经转化植物细胞的经转化植物体。
(6)(5)所述的经转化植物体的子代或克隆的经转化植物体。
(7)植物细胞的增殖受到改变的(5)或(6)所述的经转化植物体。
(8)(5)或(6)所述的经转化植物，其用于改变植物个体的发育分化。
(9)植物个体的发育分化受到改变的(5)或(6)所述的经转化植物。
(10)由(2)～(4)所述的植物细胞或(5)～(8)中任一项所述的植物体产生的食品和/或饲料组合物。
(11)由(2)～(4)所述的植物细胞或(5)～(8)中任一项所述的植物体产生的化学品。
(12)由(2)～(4)所述的植物细胞或(5)～(8)中任一项所述的植物体产生的蛋白质。
(13)由(2)～(4)所述的植物细胞或(5)～(8)中任一项所述的植物体产生的核酸。
另外，本发明还提供了(14)下述(a)至(e)中任一项所述的DNA(a)编码包含序列号32所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，(b)包含序列号31所示碱基序列的DNA，(c)这样的DNA，其编码的蛋白质为在序列号32所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的替换、删除或添加的氨基酸序列，并且分别与由序列号32所示氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(d)与包含序列号31所示碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，并且所编码的蛋白质分别与由序列号32所示氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(e)这样的DNA，其编码的蛋白质与序列号32所示的氨基酸序列进行比对，具有分值(比对分值)大于或等于60的氨基酸序列，并且其编码的蛋白质分别与由序列号32所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能。
(15)编码反义RNA的DNA，其中所述反义RNA与(14)的(a)～(e)中任一项所述DNA的转录物互补。
(16)编码这样的RNA的DNA，其中所述RNA具有特异切割(14)的(a)～(e)中任一项所述DNA的转录物的核酶活性。
(17)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过共抑制作用抑制(14)的(a)～(e)中任一项所述的DNA的表达，而且，其与(14)的(a)～(e)中任一项所述的DNA具有90％或以上的同源性。
(18)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过RNA干扰作用抑制(14)的(a)～(e)中任一项所述的DNA的表达，而且，其与(14)的(a)～(e)中任一项所述的DNA具有相同的20个或以上连续碱基。
(19)这样的DNA，其编码的蛋白质相对于植物细胞内源性的(14)的(a)～(e)中任一项所述的DNA所编码的蛋白质，显示显性失活活性。
(20)(14)～(19)中任意一项所述的DNA，其用于改变植物细胞的增殖和/或发育分化。
(21)包含下述(i)至(iii)的元件的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的(14)～(19)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
(22)具有(14)～(19)中任意一项所述的DNA或(21)所述的重组DNA或载体的经转化细胞。
(23)由(14)所述的DNA编码的蛋白质或其肽段，或者相对于植物细胞内源性的(14)的(a)～(e)中任一项所述的DNA所编码的蛋白质显示显性失活活性的蛋白质或其肽段。
(24)(23)所述的蛋白质的制备方法，其包括培养具有(14)所述的DNA或包含该DNA的载体的经转化细胞，自该转化细胞或其培养上清回收所表达的蛋白质。
(25)具有(14)～(19)中任意一项所述的DNA或(21)所述的重组DNA或载体的经转化植物细胞。
(26)(25)所述的经转化植物细胞，其用于改变植物细胞的增殖。
(27)植物细胞的增殖受到改变的(25)所述的经转化植物细胞。
(28)包含(25)～(27)所述的经转化植物细胞的经转化植物体。
(29)(28)所述的经转化植物体的子代或克隆的经转化植物体。
(30)植物细胞的增殖受到改变的(28)或(29)所述的经转化植物体。
(31)(28)或(29)所述的经转化植物体，其用于改变植物个体的发育分化。
(32)植物个体的发育分化受到改变的(28)或(29)所述的经转化植物体。
(33)由(25)～(27)所述的植物细胞或(28)～(32)中任一项所述的植物体产生的食品及/或饲料组合物。
(34)由(25)～(27)所述的植物细胞或(28)～(32)中任一项所述的植物体产生的化学品。
(35)由(25)～(27)所述的植物细胞或(28)～(32)中任一项所述的植物体产生的蛋白质。
(36)由(25)～(27)所述的植物细胞或(28)～(32)中任一项所述的植物体产生的核酸。
(37)(14)的(a)～(e)中任一所述DNA的转录物。
(38)测定(37)所述转录物的量的方法。
(39)对多个受试样本中(37)所述转录物的量进行相对比较的方法。
(40)测定由(14)所述DNA编码的蛋白质量的方法。
(41)对多个受试样本中(14)所述DNA编码的蛋白质的量进行相对比较的方法。
本发明人发现了在NtmybA2蛋白的C端区存在对转录活化功能负调节的区域，在NtmybA2蛋白的中部存在活化转录的区域。如前所述，本发明人成功制备了改变NtmybA2蛋白的功能，使转录活化功能提高的NtmybA2变体，使转录活化功能降低的NtmybA2变体，即以显性失活发挥作用的NtmybA2变体。
本发明还提供了以下内容(42)编码丧失序列号53所示的NtmybA2蛋白中调节转录活化功能的调节区功能的氨基酸序列的DNA。
(43)(42)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第705～1042位的氨基酸区域。
(44)(42)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第631～1042位的氨基酸区域。
(45)(42)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第569～1042位的氨基酸区域。
(46)(42)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第413～1042位的氨基酸区域。
(47)(42)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第243～1042位的氨基酸区域。
(48)(42)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第188～1042位的氨基酸区域。
(49)(42)至(48)所述的DNA，所述该调节区的功能丧失是通过氨基酸的替换、删除和/或插入而产生的分子。
(50)(42)至(48)所述的DNA，所述该调节区的功能丧失是通过氨基酸的删除而产生的分子。
(51)编码作为序列号53所示NtmybA2蛋白功能受到改变的分子的、序列号53所示氨基酸序列的第1～704位氨基酸序列的DNA。
(52)编码作为序列号53所示NtmybA2蛋白功能受到改变的分子的、序列号53所示氨基酸序列的第1～630位氨基酸序列的DNA。
(53)编码作为序列号53所示NtmybA2蛋白功能受到改变的分子的、序列号53所示氨基酸序列的第1～568位氨基酸序列的DNA。
(54)编码作为序列号53所示NtmybA2蛋白功能受到改变的分子的、序列号53所示氨基酸序列的第1～412位氨基酸序列的DNA。
(55)编码作为序列号53所示NtmybA2蛋白功能受到改变的分子的、序列号53所示氨基酸序列的第1～242位氨基酸序列的DNA。
(56)编码作为序列号53所示NtmybA2蛋白功能受到改变的分子的、序列号53所示氨基酸序列的第1～187位氨基酸序列的DNA。
(57)编码丧失序列号51所示的NtmybA1蛋白中调节转录活化功能的调节区功能的氨基酸序列分子的DNA。
(58)(57)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第715～1003位的氨基酸区域。
(59)(57)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第641～1003位的氨基酸区域。
(60)(57)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第579～1003位的氨基酸区域。
(61)(57)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第459～1003位的氨基酸区域。
(62)(57)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第299～1003位的氨基酸区域。
(63)(57)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第186～1003位的氨基酸区域。
(64)(57)至(63)所述的DNA，所述该调节区的功能丧失是通过氨基酸的替换、删除和/或插入而产生的分子。
(65)(57)至(63)所述的DNA，所述该调节区的功能丧失是通过氨基酸的删除而产生的分子。
(66)编码作为序列号51所示NtmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号51所示氨基酸序列的第1～714位氨基酸序列的DNA。
(67)编码作为序列号51所示NtmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号51所示氨基酸序列的第1～640位氨基酸序列的DNA。
(68)编码作为序列号51所示NtmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号51所示氨基酸序列的第1～578位氨基酸序列的DNA。
(69)编码作为序列号51所示NtmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号51所示氨基酸序列的第1～458位氨基酸序列的DNA。
(70)编码作为序列号51所示NtmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号51所示氨基酸序列的第1～298位氨基酸序列的DNA。
(71)编码作为序列号51所示NtmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号51所示氨基酸序列的第1～185位氨基酸序列的DNA。
(72)编码丧失序列号32所示的Os3RmybA1蛋白中调节转录活化功能的调节区功能的氨基酸序列分子的DNA。
(73)(72)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第709～993位的氨基酸区域。
(74)(72)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第635～993位的氨基酸区域。
(75)(72)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第575～993位的氨基酸区域。
(76)(72)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第426～993位的氨基酸区域。
(77)(72)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第257～993位的氨基酸区域。
(78)(72)的DNA，其编码的氨基酸序列分子中丧失功能的所述调节区为第203～993位的氨基酸区域。
(79)(72)至(78)所述的DNA，所述该调节区的功能丧失是通过氨基酸的替换、删除和/或插入而产生的分子。
(80)(72)至(78)所述的DNA，所述该调节区的功能丧失是通过氨基酸的删除而产生的分子。
(81)编码作为序列号32所示Os3RmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号32所示氨基酸序列的第1～708位氨基酸序列的DNA。
(82)编码作为序列号32所示Os3RmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号32所示氨基酸序列的第1～634位氨基酸序列的DNA。
(83)编码作为序列号32所示Os3RmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号32所示氨基酸序列的第1～574位氨基酸序列的DNA。
(84)编码作为序列号32所示Os3RmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号32所示氨基酸序列的第1～425位氨基酸序列的DNA。
(85)编码作为序列号32所示Os3RmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号32所示氨基酸序列的第1～256位氨基酸序列的DNA。
(86)编码作为序列号32所示Os3RmybA1蛋白功能受到改变的分子的、序列号32所示氨基酸序列的第1～202位氨基酸序列的DNA。
(87)下述(i)至(iii)中任一项所述的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的(42)至(86)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
(88)具有(42)至(86)所述的DNA或(87)所述的重组DNA或载体的经转化细胞。
(89)(88)所述的经转化植物细胞，其用于改变植物细胞的增殖。
(90)植物细胞的增殖受到改变的(88)所述的经转化植物细胞。
(91)包含(88)～(90)所述经转化植物细胞的经转化植物体。
(92)(91)所述经转化植物体的子代或克隆的经转化植物体。
(93)植物细胞的增殖受到改变的(91)或(92)所述的经转化植物体。
(94)(91)或(92)所述的经转化植物，其用于改变植物个体的发育分化。
(95)植物个体的发育分化受到改变的(91)或(92)所述的经转化植物。
(96)由(88)～(90)所述的植物细胞或(91)～(95)中任一项所述的植物体产生的食品及/或饲料组合物。
(97)由(88)～(90)所述的植物细胞或(91)～(95)中任一项所述的植物体产生的化学品。
(98)由(88)～(90)所述的植物细胞或(91)～(95)中任一项所述的植物体产生的蛋白质。
(99)由(88)～(90)所述的植物细胞或(91)～(95)中任一项所述的植物体产生的核酸。
进一步地，本发明包括(100)具有下述(a)～(f)中任意一项所述的DNA或(g)所述的重组DNA或载体的经转化细胞
(a)编码植物3Rmyb蛋白的DNA，(b)编码这样的反义RNA的DNA，所述反义RNA与编码植物3Rmyb蛋白的DNA的转录物互补，(c)编码这样的RNA的DNA，其中所述RNA具有特异切割编码植物3Rmyb蛋白的DNA的转录物的核酶活性，(d)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过共抑制作用抑制编码植物3Rmyb蛋白的DNA表达，而且，其与编码植物3Rmyb蛋白的DNA具有90％或以上的同源性，(e)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过RNA干扰作用抑制编码植物3Rmyb蛋白的DNA表达，而且，其与编码植物3Rmyb蛋白的DNA具有相同的20个或以上连续碱基，(f)编码对内源性植物3Rmyb蛋白显示出显性失活活性的蛋白质的DNA，(g)下述(i)至(iii)中任一项所述的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的(a)～(f)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
(101)具有(100)的(a)～(f)中任意一项所述的DNA或(100)的(g)所述的重组DNA或载体的经转化植物细胞。
(102)(101)所述的经转化植物细胞，其用于改变植物细胞的增殖。
(103)植物细胞的增殖受到改变的(101)所述的经转化植物细胞。
(104)包含(101)～(103)所述经转化植物细胞的经转化植物体。
(105)(104)所述经转化植物体的子代或克隆的经转化植物体。
(106)植物细胞的增殖受到改变的(104)或(105)所述的经转化植物体。
(107)(104)或(105)所述的经转化植物体，其用于改变植物个体的发育分化。
(108)植物个体的发育分化受到改变的(104)或(105)所述的经转化植物体。
(109)由(101)～(103)所述的植物细胞或(104)～(108)中任一项所述的植物体产生的食品及/或饲料组合物。
(110)由(101)～(103)所述的植物细胞或(104)～(108)中任一项所述的植物体产生的化学品。
(111)由(101)～(103)所述的植物细胞或(104)～(108)中任一项所述的植物体产生的蛋白质。
(112)由(101)～(103)所述的植物细胞或(104)～(108)中任一项所述的植物体产生的核酸。
进一步地，本发明包含转录活化功能提高的植物3Rmyb蛋白，具体地列举了以下蛋白质。另外，本发明也包含编码这些蛋白质的DNA。
(113)调节转录活化功能的调节区功能丧失的植物3Rmyb蛋白。
(114)(113)的植物3Rmyb蛋白，其中丧失功能的所述调节区为始于C端的600个氨基酸。
(115)(113)的植物3Rmyb蛋白，其中丧失功能的所述调节区为始于C端的500个氨基酸。
(116)(113)的植物3Rmyb蛋白，其中丧失功能的所述调节区为始于C端的420个氨基酸。
(117)(113)的植物3Rmyb蛋白，其中丧失功能的所述调节区为始于C端的350个氨基酸。
(118)(113)的植物3Rmyb蛋白，其中丧失功能的所述调节区为始于C端的280个氨基酸。
优选地，列举了以下蛋白质(119)功能的丧失源自氨基酸删除的(113)的植物3Rmyb蛋白。
(120)氨基酸的删除为删除C端的280个氨基酸至600个氨基酸的(113)的植物3Rmyb蛋白。
(121)氨基酸的删除为删除C端的280个氨基酸至500个氨基酸的(113)的植物3Rmyb蛋白。
更优选地，(122)氨基酸的删除为删除C端的350个氨基酸至420个氨基酸的(113)的植物3Rmyb蛋白。
(123)(113)～(122)中任意一项所述的蛋白质，其中植物3Rmyb蛋白质具有序列号32、序列号51、序列号53、序列号75、或序列号76中的任一氨基酸序列。
(124)(113)～(122)中任意一项所述的蛋白质，其中植物3Rmyb蛋白质具有序列号32、序列号51、或序列号53中的任一氨基酸序列。
发明的功效本发明提供了细胞增殖受到改变的植物细胞。另外提供了使用这些植物细胞可获得发育分化受到改变的植物体，并且提供了获得特定器官的肥大、雄性不育或逆境耐性的改善等具有所需特性的植物体的新方法。
本发明的其它目的、特征、优点及其方面，根据下文的描述本领域技术人员即可明了。但是，应该理解下文的描述及包含具体实施例等的本说明书描述仅为阐述的本发明优选的实施方式，并且仅为了说明的目的而给出。本领域技术人员易于理解根据下文的描述及本说明书其它部分的知识可在本发明的精神和范围内对本发明进行多种变化和/或改变(或修饰)改变。本说明书中引用的所有专利文献及参考文献是为了说明的目的而引用的，它们作为本说明书的一部分，其内容此处引用作为参考。
附图简述


图1显示了在DDBJ中以登录号BAB78687登录的推定的稻蛋白质的氨基酸序列与Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式进行的氨基酸序列比对。序列在图2及3中继续。
图2显示了以BAB78687登录的推定的稻蛋白质的氨基酸序列与Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式进行的氨基酸序列比对。序列续
图1，并在图3中继续。
图3显示了以BAB78687登录的推定的稻蛋白质的氨基酸序列与Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式进行的氨基酸序列比对。序列续
图1及2。
图4为将Os3RmybA1和NtmybA2的CYM启动子-LUC质粒作为报告质粒，以LUC比活性提高率显示对CYM启动子与LUC的融合基因的转录活化功能。数据显示为5次重复的均值，误差线为标准差。
图5为将NtmybA2及NtmybA2多种C端截短突变体的NACK1启动子-LUC质粒作为报告质粒，以LUC比活性提高率显示对NACK1启动子与LUC的融合基因的转录活化功能。数据显示为5次重复的均值，误差线为标准差。
图6为将NtmybA2与NtmybA2T5、或NtmybB与NtmybA2T5的共表达的CYM启动子-LUC质粒作为报告质粒，以LUC比活性提高率显示对CYM启动子与LUC的融合基因的转录活化功能。数据显示为5次重复的均值，误差线为标准差。
图7显示使用pPZP211-35S:A2RNAi转化、由于RNA干扰作用内源NtmybA2的表达量降低的经转化BY2愈伤组织大小的照片，以及使用pPZP211转化的愈伤组织大小的照片。载体为用pPZP211转化的愈伤组织、A2RNAi为用pPZP211-35S:A2RNAi转化的愈伤组织。
图8显示对使用pPZP211-35S:A2RNAi转化的由于RNA干扰作用而使内源NtmybA2表达量降低的经转化BY2愈伤组织以及用pPZP211转化的愈伤组织中核内DNA含量的测定结果。载体及载体对照为经pPZP211转化的愈伤组织、A2RNAi为经pPZP211-35S:A2RNAi转化的愈伤组织。
图9显示使用pPZP211-35S:BRNAi转化的由于RNA干扰作用而使内源NtmybB的表达量降低的经转化BY2愈伤组织大小的照片，以及使用pPZP211转化的愈伤组织大小的照片。载体及载体对照为用pPZP211转化的愈伤组织、B RNAi为用pPZP211-35S:BRNAi转化的愈伤组织。
图10显示对使用pPZP211及pPZP211-35S:BRNAi转化的由于RNA干扰作用而使内源NtmybB的表达量降低的经转化BY2愈伤组织以及用pPZP211转化的愈伤组织中核内DNA含量的测定结果。载体及载体对照为经pPZP211转化的愈伤组织、B RNAi为经pPZP211-35S:BRNAi转化的愈伤组织。
图11显示用pPZP211-35S:A2或pPZP211-35S:A2T2转化而稳定表达NtmybA2或NtmybA2T2的经转化BY2愈伤组织大小，以及用pPZP211转化的愈伤组织大小。载体表示经pPZP211转化的愈伤组织、35S:A2表示经pPZP211-35S:A2转化的愈伤组织、35S:A2T2表示经pPZP211-35S:A2T2转化的愈伤组织。
图12显示构成使用pPZP211-35S:A2或pPZP211-35S:A2T2转化而稳定表达NtmybA2或NtmybA2T2的经转化BY2愈伤组织以及使用pPZP211转化的愈伤组织的细胞数。载体表示经pPZP211转化的愈伤组织、35S:A2表示经pPZP211-35S:A2转化的愈伤组织、35S:A2T2表示经pPZP211-35S:A2T2转化的愈伤组织。
图13为对使用pPZP211-35S:A2或pPZP211-35S:A2T2转化而稳定表达NtmybA2或NtmybA2T2的经转化BY2愈伤组织以及使用pPZP211转化获得的愈伤组织的核内DNA含量进行测定的结果。对照表示经pPZP211转化的愈伤组织、35S:A2表示经pPZP211-35S:A2转化的愈伤组织、35S:A2T2表示经pPZP211-35S:A2T2转化的愈伤组织。
图14为显示使用pPZP211-35S:B转化且NtmybB稳定表达的经转化烟草、使用pPZP211-35S:B.RNAi转化的由于RNAi作用而抑制内源NtmybB表达的经转化烟草、或使用pPZP211转化的经转化烟草的生长发育照片。载体表示经pPZP211转化的烟草、35S:B表示经pPZP211-35S:B转化的烟草、B RNAi表示经pPZP211-35S:B.RNAi转化的烟草。
图15显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式比对的结果。在
图15～17中，箭头为获得NtmybA2的多种C端区截短突变体的区域，而且显示了与之相应的NtmybA1、Os3RmybA1氨基酸区域。在通过CLUSTALW程序而显示氨基酸相似性的输出结果中，图中“*”、“.”、“:”中的“*”为完全保守的氨基酸位点、“:”为高度保守的氨基酸位点、“.”为中等程度保守的氨基酸位点。序列在
图16至18中继续。
图16显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续
图15，并在
图17及18中继续。
图17显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。图中用四角围起来的区域认为显示为NtmybA2的删除区域附近的与NtmybA1、Os3RmybA1保守的序列位置。四角上所示的氨基酸序列显示为保守序列，X表示任意氨基酸。序列续
图15及16，并在
图18中继续。
图18显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续
图15至17。
图19显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R1(
图19～25中记为AtMYB3R-1)、At MYB3R4(
图19～25中记为AtMYB3R-4)蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。在通过CLUSTALW程序而显示氨基酸相似性的输出结果中，图中“*”、“.”、“:”中的“*”为完全保守的氨基酸位点、“:”为高度保守的氨基酸位点、“.”为中等程度保守的氨基酸位点。序列在图20至25中继续。
图20显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续
图19，并在图21至25中继续。
图21显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续
图19及20，并在图22至25中继续。
图22显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续
图19至21，并在图23至25中继续。
图23显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。图中粗黑条显示为在myb DNA结合区以外特别高度保守的氨基酸序列区域。粗黑条所示区域中认为保守的序列以粗体字显示，本序列中所示的X为任意氨基酸，J为选自I、V、L中的任一种氨基酸，O为选自S、T中的任一种氨基酸，X1为选自K、R中的任一种氨基酸，U为选自V、L中的任一种氨基酸、X5为选自D、E中的任一种氨基酸。序列续
图19至22，并在图24至25中继续。
图24显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续
图19至23，并在图25中连续。
图25显示了NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1、AtMYB3R-1、AtMYB3R-4蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续
图19至24。
图26显示了NtmybB、AtMYB3R3(在图26～28中记为AtMYB3R-3)、AtMYB3R5(在图26～28中记为AtMYB3R-5)蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。在通过CLUSTALW程序而显示氨基酸相似性的输出结果中，图中“*”、“.”、“:”中的“*”为完全保守的氨基酸位点、“:”为高度保守的氨基酸位点、“.”为中等程度保守的氨基酸位点结果。图中粗黑条显示为在myb DNA结合区以外特别高度保守的氨基酸序列区域。粗黑条所示区域中认为保守的序列以粗体字显示，本序列中所示的X为任意氨基酸，X6为K、R、D、E、H中的任一种氨基酸。序列在图27及28中继续。
图27显示了NtmybB、AtMYB3R-3、AtMYB3R-5蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续图26，并且在图28中继续。
图28显示了NtmybB、AtMYB3R-3、AtMYB3R-5蛋白质的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续图26及27。
图29为将自展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)分离的MYB3R-1(在图29～31中记为PhpMYB3R-1)、自Adiantum raddianum分离的MYB3R-1(在图29～31中记为AdrMYB3R-1)、自大麦(Hordeum vulgare)分离的MYB3R-1(在图29～31中记为HvMYB3R-1)、自黑麦(Secalecereale)分离的MYB3R-1(在图29～31中记为ScMYB3R-1)、自虞美人(Papaver rhoeas)分离的推定的Myb相关结构域(在图29～31中记为ParMYB3R-1)、AtMYB3R1(在图29～31中记为AtMYB3R-1)、AtMYB3R3(在图29～31中记为AtMYB3R-3)、AtMYB3R4(在图29～31中记为AtMYB3R-4)、AtMYB3R5(在图29～31中记为AtMYB3R-5)、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1蛋白中构成包含3个重复序列的myb样DNA结合区的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。在这13种氨基酸序列中，保存的氨基酸位点在图中表示为保守序列。保守序列中所示的X为任意氨基酸，J为I、V、L中的任一种氨基酸，O为G、S、T、C、A中的任一种氨基酸、X7为K、R、H中的任一种氨基酸，U为H、W、Y、F中的任一种氨基酸，X5为D、E中的任一种氨基酸。图中粗黑条为使用MOTIF程序(http//motif.genome.ad.jp/)进行搜索，得到的MYB#1(Myb DNA结合结构域重复标签1)所示的c-myb 3个重复myb DNA结合区中的共有序列。粗黑条间的箭头表示上述共有序列间存在的氨基酸数。序列在图30及31中继续。
图30为将pMYB3R-1、AdrMYB3R-1、HvMYB3R-1、ScMYB3R-1、ParMYB3R-1、AtMYB3R1、AtMYB3R3、AtMYB3R4、AtMYB3R5、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1蛋白中构成包含3个重复序列的myb样DNA结合区的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续图29，并在图31中继续。
图31为将pMYB3R-1、AdrMYB3R-1、HvMYB3R-1、ScMYB3R-1、ParMYB3R-1、AtMYB3R1、AtMYB3R3、AtMYB3R4、AtMYB3R5、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1蛋白中构成包含3个重复序列的myb样DNA结合区的氨基酸序列以最佳方式进行比对的结果。序列续图29及30。
图32显示栽培导入了NtmybA2基因的植物体(NtmybA2高表达烟草)的生长发育状况(植株高度)与没导入NtmybA2基因的植物体进行比较的结果。
图33显示栽培导入了NtmybA2基因的植物体(NtmybA2高表达烟草)的生长发育状况(真叶数)与没导入NtmybA2基因的植物体进行比较的结果。
实施发明的最佳方式在本发明中，利用「基因重组技术」分离目标核酸并确定其序列、制备重组体、可获得目标肽。作为可用于本说明书中的基因重组技术包括该领域公知的技术，如J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，″MolecularCloningA Laboratory Manual(第二版)″，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Glover等编著，″DNA Cloning″，第二版，Vol.1至4，(The Practical ApproachSeries)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；日本生化学会编、「续生化学实验讲座1、基因研究法II」、东京化学同人(1986)；日本生化学会编、「新生化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)」、东京化学同人(1992)；″Methods in Enzymology″，系列，Academic Press，New York，如R.Wu编著，″Methods in Enzymology″，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R.Wu等编著，″Methods inEnzymology″，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)& 101(RecombinantDNA，Part C)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu等编著，″Methods in Enzymology″，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E)& 155(Recombinant DNA，Part F)，AcademicPress，New York(1987)；J.H.Miller编著，″Methods in Enzymology″，Vol.204，Academic Press，New York(1991)；R.Wu 编著，″Methods inEnzymology″，Vol.216(Recombinant DNA，Part G)，Academic Press，NewYork(1992)；R.Wu编著，″Methods in Enzymology″，Vol.217(Recombinant DNA，Part H)& 218(Recombinant DNA，Part I)，AcademicPress，New York(1993)；G.M.Attardi等编著，″Methods in Enzymology″，Vol.260(Mitochondrial Biogenesis and Genetics，Part A)，Academic Press，New York(1995)；J.L.Campbell编著，″Methods in Enzymology″，Vol.262(DNA Replication)，Academic Press，New York(1995)；G.M.Attardi等编著，″Methods in Enzymology″，Vol.264(Mitochondrial Biogenesisand Genetics，Part B)，Academic Press，New York(1996)；P.M.Conn编著，″Methods in Enzymology″，Vol.302(Green Fluorescent Protein)，Academic Press，New York(1999)；S.Weissman编著，″Methods inEnzymology″，Vol.303(cDNA Preparation and Characterization)，Academic Press，New York(1999)；J.C.Glorioso等编著，″Methods inEnzymology″，Vol.306(Expression of Recombinant Genes in EukaryoticSystems )，Academic Press，New York(1999)；M.lan Phillips 编著，″Methods in Enzymology″，Vol.313(Antisense Technology，Part AGeneral Methods，Methods of Delivery and RNA Studies)& 314(AntisenseTechnology，Part BApplications)，Academic Press，New York(1999)；J.Thorner 等编著，″Methods in Enzymology″，Vol.326(Applications ofChimeric Genes and Hybrid Proteins，Part AGene E xpression andProtein Purification)，327(Applications of Chimeric Genes and HybridProteins，Part BCell Biology and Physiology)& 328(Applications ofChimeric Genes and Hybrid Proteins，Part CProtein-Protein Interactionsand Genomics)，Academic Press，New York(2000)等中所述的方法或其中所引用文献中所述的方法或实际上与它们是同样的方法或改变的方法(它们于此处引用作为参考)。
本发明提供了植物3Rmyb蛋白的活性受到改变的植物细胞及包含该植物细胞的植物体，在本发明中植物3Rmyb蛋白的活性改变包括植物3Rmyb基因的表达改变或植物3Rmyb蛋白的功能改变。
前述植物3Rmyb基因的表达改变包含使该基因的表达为稳定表达、过量表达、异位表达、诱导表达，或抑制所述表达，优选地为稳定表达、过量表达、或抑制所述表达。
另外，本发明提供了可在植物体内抑制植物3Rmyb基因表达的分子。「抑制植物3Rmyb基因表达」包括基因转录的抑制及翻译为蛋白质的抑制。另外，也包括植物3Rmyb基因表达的完全沉默和表达的降低。
作为对植物中特定内源基因表达的抑制方法，利用反义技术的方法为本领域技术人员最常使用的方法。植物细胞中的反义作用最先经Ecker等人使用瞬时基因表达法，通过电穿孔法导入的反义RNA在植物中发挥反义作用而证实(J.R.Ecker 及R.W.Davis，Proc.Natl.Acad.USA.835372(1986))。此后，也报道了在烟草和矮牵牛中由于反义RNA的表达，使目标基因的基因表达下降的实施方案(A.R.van der Krol等，Nature333866(1988))，现在确定为在植物中抑制基因表达的方法。
作为反义核酸抑制目的基因表达的作用，存在以下多个要因。即，由于形成三链体而阻止转录开始、与由于RNA聚合酶的作用而形成的局部开环结构部位杂交而抑制转录、与正在合成的RNA杂交而阻止转录、与内含子和外显子的接合点杂交形成剪接抑制、与剪接体形成部位杂交形成剪接抑制、与mRNA杂交形成自核向细胞质的移行抑制、与加帽部位或多聚(A)添加部位杂交形成剪接抑制、与翻译起始因子结合部位的杂交形成翻译起始抑制、与起始密码子附近的核糖体结合部位杂交形成翻译抑制、与mRNA的翻译区或多聚核糖体结合部位杂交而阻止肽链延伸、及与核酸和蛋白质的相互作用部位杂交形成抑制基因表达等。它们阻碍了转录、剪接或翻译过程，从而抑制目的基因表达。
本发明所用的反义序列也可通过上述任一作用抑制目的基因表达。在一个实施方案中，通过设计与基因的mRNA 5′端附近的非翻译区互补的反义序列，可有效阻止基因的翻译。但是，也可使用与编码区或3′端的非翻译区互补的序列。这样，不仅包含基因的翻译区而且包含非翻译区序列的反义序列的DNA也包含在本发明可利用的反义DNA中。使用的反义DNA连接在合适的启动子下游，优选地3′端与包含转录终止信号的序列连接。如此制备的DNA可以公知的方法转化目的植物。反义DNA的序列优选地为与所转化植物具有的内源基因或其部分互补的序列，只要能有效阻止基因的表达，不必完全互补。所转录的RNA相对于目的基因的转录物，优选地具有90％或以上、最优选地具有95％或以上的互补性。序列的互补性可通过上述检索确定。
对于使用反义序列有效地阻止目的基因表达，反义DNA的长短至少为15个碱基或以上，优选地为100个碱基或以上，更优选地500个碱基或以上。通常，使用的反义DNA长短为小于5kb，优选地小于2.5kb。
抑制内源基因表达还可利用编码核酶的DNA进行。核酶为具有催化活性的RNA分子。虽然核酶中存在具有不同活性的核酶，其中通过对作为可切割RNA的核酶的研究可设计出以位点特异性切割RNA为目的的核酶。核酶中不仅存在象I组内含子型、RnaseP中包含M1RNA这样的400个碱基或以上的大的核酶，而且存在具有称为锤头型或发夹型的40个碱基的活性结构域的核酶。
例如，已表明锤头型核酶的自身切割结构域虽然在G13U14C15的C15的3′侧进行切割，但对于活性而言，U14与9位的A形成碱基对是重要的，且15位的碱基除了C外，在为A或U时也被切割(M.Koizumi等，(1988)FEBS Lett.228225)。如果将核酶的底物结合部设计为与目的部位附近的RNA序列互补的话，可制备出识别目标RNA中UC、UU或UA序列的限制酶样的RNA切割核酶(M.Koizumi等，(1988)FEBS Lett.239285、M.Koizumi等，(1989)Nucleic Acids Res.177059)。例如，NtmybA2基因(序列号2)的编码区中可成为靶标的部位有多个。
另外，发夹型核酶可用于本发明的目的。观察到发夹型核酶在如烟草环斑病毒卫星RNA的负链中存在(J.M.Buzayan，Nature，323349，1986)。显示所述核酶也可设计为切割靶标特异RNA的核酶(Y.Kikuchi及N.Sasaki，Nucleic Acids Res.，196751(1992))。
对于为切割靶标而设计的核酶，为了在植物细胞中转录而将所述核酶与花椰菜花叶病毒35S启动子等的启动子及转录终止序列连接。但是此时由于在所转录的RNA的5′末端或3′末端添加了额外的序列，有时可丧失核酶活性。在这种情况下，为了自包含所转录核酶的RNA中仅正确地切出核酶部分，核酶部分的5′侧或3′侧中可放置进行修剪的顺式发挥作用的其它修剪性核酶(K.Taira等，Protein Eng.，3733(1990)；A.M.Dzianott及J.J.Bujarski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，864823(1989)；C.A.Grosshans及R.T.Cech，Nucleic Acids Res.，193875(1991)；K.Taira等，Nucleic AcidsRes.，195125(1991))。另外，将这样的结构单元串联排列允许可在目的基因内的多个部位切割，从而能更高地发挥作用(N.Yuyama等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1861271，1992)。在本发明中使用这样的核酶可特异地切割目的基因转录物，从而抑制该基因的表达。
内源基因表达的抑制进一步可通过转化具有与目的基因序列同一或类似序列的DNA而获得共抑制。「共抑制」为将具有与植物中目的内源基因同一或类似的序列的基因转化导入时，所导入的外来基因及目的内源基因这两者的表达均被抑制的现象。共抑制的机制尚未明确说明，但在植物中经常观察到(Curr.Biol.，7R793，1997；Curr.Biol.，6810，1996)。例如，为了获得NtmybA2基因被共抑制的植物体，将NtmybA2基因或具有与之类似序列的DNA可表达地制备的载体DNA转化目的植物，自所获得的植物选择生长和发育受到抑制的植物。共抑制中所用的基因不必与目的基因完全同一，但最少具有70％或以上、优选地80％或以上、更优选地90％或以上(例如，95％或以上)的序列同一性。序列同一性可利用上述检索确定。
进一步地，为了抑制内源基因表达，也可将与目的基因序列同一或类似的序列反向重复排列的DNA进行转化而实施RNA干扰。「RNA干扰」为将与植物目的内源基因同一或类似的序列反向重复排列的DNA进行转化而导入时，外源DNA表达双链RNA，从而抑制目的基因表达的现象。RNA干扰的机制为第一阶段，目的基因的mRNA与来自所导入序列的双链RNA形成复合体，以会合序列作为引物合成互补的RNA，第二阶段，由内源RNase将该复合体片段化，第3阶段，片段化为20-30碱基对的双链RNA作为二次RNA干扰信号发挥功能，再次分解内源性的目的基因mRNA。(Curr.Biol.，7R793，1997；Curr.Biol.，6810，1996)。例如，为了获得通过RNA干扰抑制NtmybB基因的植物体，将具有NtmybB基因或其类似序列的DNA反向重复排列的DNA以可表达为目的而制备的载体DNA转化目的植物，自所获得的植物体选择生长和发育受到促进的植物。RNA干扰所用的基因不必与目的基因完全同一、但至少10个碱基或以上与目的基因为连续同一，优选地20个碱基至100个碱基为连续同一，更优选地50个碱基为连续同一。另外，RNA干扰所用的基因为与目的基因至少具有70％或以上，优选地80％或以上，更优选地90％或以上(例如，95％或以上)的序列同一性的基因。进一步更优选地是具有与目的基因至少70％或以上，优选地80％或以上，更优选地90％或以上(例如，95％或以上)的序列同一性的基因反向重复排列。特别是，希望与这些目的基因具有序列同一性的基因为插有间隔序列的反向重复排列基因。序列同一性可通过利用上述检索确定。对于RNA干扰所用基因的长度，可使用目的基因全长、使用至少25个碱基，优选地50个碱基，更优选地100个碱基，更优选地500个碱基。
另外，RNAi可通过植物病毒感染而实施。具有基因组为单链RNA的植物病毒在其复制期间为双链RNA形式。因此，将在植物病毒基因组中共同插入目的基因序列与合适的启动子而产生的重组病毒感染植物时，随着该病毒的复制，目的基因序列形成双链RNA。结果可获得RNAi效果(Angell等，Plant J.20，357-362，(1999))。
进一步地，在本发明中抑制内源基因的表达可通过将具有显性失活目的基因特性的基因转化植物而实施。本发明中「编码具有显性失活特性的蛋白质的DNA」是指这样的DNA，由于该DNA的表达，其编码的蛋白质具有使植物体本来具有的由本发明内源基因编码的蛋白质的活性消失或下降这一功能。作为对象的DNA是否具有使本发明内源基因的活性消失或下降这一功能，可如上所述通过作为对象的DNA是否抑制植物细胞周期蛋白B基因或NACK1基因及它们的直向同源基因的转录量来判定。
引起内源的植物3Rmyb蛋白质功能下降的显性失活分子可转化入与分离NtmybA1蛋白或NtmybA2蛋白、Os3RmybA1蛋白的植物物种不同的植物物种。
另外，本发明中植物3Rmyb蛋白的活性受到改变的植物是指植物3Rmyb基因的表达或蛋白质的功能发生变化的植物，优选地为该基因的表达量或所表达蛋白质的功能与野生型比较以可检测到的水平发生变化的植物，其中表达量的变化包含稳定表达、诱导表达、过量表达、异位表达、表达的抑制。所述表达或功能变化的植物除了使用转化的基因操作法外，还可通过使用常规的突变及选择技术实现。
另外，本发明提供了插入有这样的DNA的重组DNA或载体，其中所述插入的DNA抑制上述本发明DNA、本发明DNA的表达或本发明DNA编码的蛋白质的表达。所述重组DNA或载体包括在重组蛋白的产生中使用的上述载体、为制备经转化植物体而在植物细胞内表达这样的DNA的载体，其中所述DNA抑制本发明DNA、本发明DNA的表达或本发明DNA编码的蛋白质的表达。这样的重组DNA或载体尤其不限于包含在植物细胞中可转录的启动子序列和含有使转录物稳定所需的聚腺苷酸化部位的终止子序列，其包括例如质粒「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」(均由Clontech社生产)、「pTA7001」、「pTA7002」(Aoyama等，(1997)PlantJ.11605)、「pPZP211」(Hajdukiewicz等，Plant Mol.Biol.25989(1994)等。
本发明的上述重组DNA或载体可包含使本发明的蛋白质稳定表达或诱导表达的启动子。本发明中在细胞内可表达的启动子优选为以下列举的启动子。
用于稳定表达的启动子为例如花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等，Nature，313810(1985))、稻的肌动蛋白启动子(Zhang等，Plant Cell，31155(1991))、玉米的遍在蛋白启动子(Cornejo等，Plant Mol.Biol.，23567(1993))等。
另外，用于诱导表达的启动子可列举例如由于丝状菌、细菌、病毒的感染或侵入、低温、高温、干燥、紫外线照射、特定化合物的应用等外因引起表达的公知启动子。这样的启动子为例如由于丝状菌、细菌、病毒的感染或侵入而表达的稻几丁质酶基因的启动子(Xu等，Plant Mol.Biol.，30387(1996))、烟草的PR蛋白基因的启动子(Ohshima等，Plant Cell295(1990))、低温诱导的稻「lip19」基因的启动子(Aguan等，Mol.GenGenet.，2401(1993))、高温诱导的稻「hsp80」基因与「hsp72」基因的启动子(Van Breusegem等，Planta，19357(1994))、干燥诱导的拟南芥「rab16」基因的启动子(Nundy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871406(1990))、紫外线照射诱导的芹菜查耳酮合成酶基因的启动子(Schulze-Lefert等，EMBO J.，8651(1989))、无氧条件下诱导的玉米醇脱氢酶基因的启动子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，846624(1987))等。另外，稻几丁质酶基因的启动子与烟草PR蛋白基因的启动子由水杨酸等特定化合物、「rab16」由使用植物激素脱落酸而诱导。另外，也包括使用通过糖皮质激素或雌激素的处理在植物内诱导基因表达的载体体系。通过糖皮质激素处理可诱导表达的载体例如为pTA7001、pTA7002(Aoyama等，Plant J.，11605(1997))、通过雌激素处理可诱导表达的载体例如为pER10(Zuo等，Plant J.，24265(2000))。另外，在增殖细胞中特异表达的启动子例如为S～M期表达的烟草NPK1基因的启动子(Nishihama等，Genes Dev.，15352(2000))、作为M期表达的启动子-烟草NACK1基因的启动子(Nishihama等，Cell，10987(2002))、长春花CYM基因启动子(Ito等，Plant J.，11983(1997))、S期表达的长春花CYS基因启动子(Ito等，Plant J.，11983(1997))、增殖细胞中通过细胞周期而表达的拟南芥cdc2a基因的启动子(Chung等，FEBS Lett.，362215(1995))等。另外，组织特异型启动子的例子可在以下专利文献中找到。US 5459252及US5633363(根特异)、US 5097025((i)种子、(ii)成熟植物)、US 5391725((i)叶绿体、(ii)胞质溶胶)、US 4886753(根瘤)、US 5646333(表皮)、US 5110732((i)根、(ii)贮藏根)、US 5618988(贮藏器官)、US 5401836及US 5792925(根)、US 4943674(果实)、US 5495007(韧皮部)、US 5824857(维管组织)，上述专利分别于本说明书中引用。除了这些启动子外，还可使用维管束的前形成层特异的启动子-拟南芥AtHB8启动子(Baima等，Development 1214171(1995))、茎或根特异的拟南芥ACL5启动子(Hanzawa等，The EMBO Journal，194248(2000))、地上部分特异的番茄RBCS3A启动子(Meier等Plant Physiol.1071105(1995))等。
雄性生殖器官或细胞中显示高的基因表达的启动子可为拟南芥AtNACK2基因启动子(PCT/JP02/12268)、拟南芥AVP1基因启动子(Mitsuda等，Plant Mol.Biol，46185(2001))、拟南芥DAD 1基因启动子(Ishiguro等，Plant Cell，132191(2001))、烟草TA20、TA29基因启动子(Goldberg等，Science，2401460(1988))、稻Osg6B基因启动子(Tuchiya等，Plant Mol.Biol，261737(1994))、番茄Lat52基因启动子(Twellr等，Development，109705(1990))、烟草g10基因启动子(Rogers等，Plant Mol.Biol.，45577(2001))、在花椰菜花叶病毒35S启动子中插入花药特异的基因表达调节序列的人工启动子(Ingrid等，Plant Cell，4253(1992))等。
另外，本发明提供了导入本发明的上述重组DNA或载体的经转化植物细胞。本发明的载体所导入的植物细胞包括用于制备经转化植物体的植物细胞。对植物细胞没有特别的限制，可自已知的植物如栽培植物、有用的植物等中选择而且具有实用性，包括谷类、豆类、块茎类、种子类、蔬菜类、果实类的已知植物，还包括来自园林花木树木等的植物。植物细胞的例子为例如茄科、芸苔科、禾本科、豆科、百合科、伞形科、葫芦科等，优选地为烟草、拟南芥、大豆、红豆、绿豆、豌豆、蚕豆、花生、芝麻、稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、马铃薯、番茄、绿胡椒、甘蓝、嫩茎花椰菜、芹菜、菠菜、甘薯、芋、魔芋、木薯、葡萄、苹果、桃、梨、柿、草莓、蓝莓、洋李、西瓜、黄瓜、甘蔗、橘子、柠檬、橙子、橄榄、棉花等的细胞。本发明的植物细胞除了培养细胞外，还包括植物体中的细胞。另外，还包括原生质体、苗条原基、多芽体、毛状根。载体向植物细胞的导入可为例如利用农杆菌的导入方法(Hood等，Transgenic Res.，2218(1993)；Hiei等，Plant J.，6271(1994))、电穿孔法(Tada等，Theor.Appl.Genet，80475(1990))、聚乙二醇法(Lazzeri等，Theor.Appl.Genet，81437(1991))、颗粒枪法(Sanford等，J.Part.Sci.tech.，527(1987))等，可自该领域公知的方法中适宜地选择并利用。
经转化植物细胞可通过再分化而产生植物体。虽然再分化的方法根据植物细胞的种类而并不相同，但例如稻可举例Fujimura等(Plant TissueCulture Lett.，274(1995))的方法，玉米可举例Shillito等(Bio/Technology，7581(1989))的方法或Gorden-Kamm等(Plant Cell，2603(1990))的方法，马铃薯可举例Visser等(Theor.Appl.Genet，78594(1989))的方法、烟草可举例Nagata和Takebe(Planta，9912(1971))的方法，拟南芥可举例Akama等(Plant Cell Reports，127-11(1992))的方法。
一旦基因组内导入了抑制本发明DNA或本发明DNA表达的DNA后，可得到经转化植物体、由该植物体可获得有性繁殖或无性繁殖产生的子代。另外，获得来自该植物体及其子代或克隆的繁殖材料(例如，种子、果实、插条、块茎、块根、株、愈伤组织、原生质体等)，以此为基础可大量产生该植物体。本发明包含导入了抑制本发明DNA或本发明DNA表达的DNA的植物细胞、含有该细胞的植物体、该植物体的子代及克隆、以及该植物体、其子代及克隆的繁殖材料。
本发明的植物体通过调节本发明DNA的表达使得与正常个体相比较，细胞增殖或发育分化受到改变。本发明中「细胞增殖的改变」是指例如细胞周期所需时间的缩短或延长、组成细胞周期的G1期、S期、G2期、M期的各期所需时间的缩短或延长、抑制进入组成细胞周期的G1期、S期、G2期、M期的各期、抑制组成细胞周期的G1期、S期、G2期、M期的各期结束、抑制组成细胞周期的G1期、S期、G2期、M期各期的存在、细胞大小的变化、成膜体扩大的变化、成膜体形成的变化、细胞板扩大的变化、细胞板形成的变化、细胞分裂次数的变化、细胞中包含核数的变化、或发生核内DNA含量的变化，优选地是指细胞周期所需时间的缩短或延长、细胞大小的变化、成膜体形成的变化、细胞板形成的变化、细胞分裂次数的变化、或发生核内DNA含量的变化。本发明中核内DNA含量的变化是指多倍性的变化，优选地是指多倍性的增加。另外，本发明中「发育分化的改变」包括例如由于促进细胞增殖而增加了组成植物体的细胞数、由于抑制细胞增殖而降低了组成植物体的细胞数、由于促进细胞增殖而促进植物体的生长和发育速度、由于抑制细胞增殖而抑制了植物体的生长和发育速度、促进植物体的生长和发育速度且缩短形成花芽的期间、抑制植物体的生长和发育速度且延长形成花芽的期间、虽然植物体的生长和发育速度受到促进但其形成花芽的调控机制未变化并在大的植物体中形成花芽、虽然植物体的生长和发育速度受到抑制但其形成花芽的调控机制未变化并在小的植物体中形成花芽、植物体的生长和发育速度受到促进且至老化的期间缩短、植物体的生长和发育速度受到抑制且至老化的期间延长、虽然植物体的生长和发育速度受到促进但直至老化开始的调控机制无变化并在直至老化开始时已形成了大的植物体、虽然植物体的生长和发育速度受到抑制但直至老化开始的调控机制无变化并在直至老化开始时已形成了小的植物体、由于促进或抑制细胞增殖而改变了组织形态的变化、由于促进或抑制细胞增殖而改变了组织的大小、由于促进或抑制细胞增殖而改变了器官形态、由于促进或抑制细胞增殖而改变了器官的大小、由于促进或抑制细胞增殖而改变了植物体、或由于促进或抑制细胞增殖而改变了植物体的大小，优选地，虽然植物体的生长和发育速度受到促进但形成花芽的调控机制无变化并在大的植物体中形成花芽、由于抑制细胞增殖而降低了组成植物体的细胞数、虽然植物体的生长和发育速度受到抑制但形成花芽的调控机制无变化并在小的植物体中形成花芽、由于促进或抑制细胞增殖而改变了器官大小、由于促进或抑制细胞增殖而改变了植物体大小，更优选地，由于促进或抑制细胞增殖而改变了植物体大小。本发明中，由于促进或抑制细胞增殖而改变了植物体大小是指由于促进细胞增殖而使植物体变大或由于抑制细胞增殖而使植物体变小。
一旦制备出本发明的内源性NtmybA1及NtmybA2的基因表达量下降的植物，即获得了细胞分裂或细胞质分裂受到抑制的细胞并因此生长和发育或增殖受到抑制的植物、制备出了内源性NtmybA2基因表达量下降的培养细胞、细胞周期受到改变的事实表明NtmybA1及NtmybA2为与细胞周期及细胞分裂有关的正调控因子，由此可制备出生长和发育受到抑制的植物。
在本发明中，制备出稳定表达NtmybA2的经转化植物或细胞后，可获得生长和发育迟缓的植物或培养细胞，可制备出通过NtmybA2的异位表达延长细胞周期从而生长和发育受到抑制的植物。
本发明内源NtmybB的基因表达量下降的经转化植物或培养细胞中，生长和发育或增殖受到促进表明NtmybB为与细胞周期及细胞分裂有关的负调控因子，由此了制备出生长和发育受到促进的植物。
在本发明的NtmybB稳定表达的植物中生长和发育受到抑制表明NtmybB为与细胞周期及细胞分裂有关的负调控因子，由此可制备出生长和发育受到抑制的植物。
本发明提供了细胞周期蛋白B基因、NACK相关基因的转录活化因子即稻Os3RmybA1基因。自稻分离了植物3Rmyb基因-Os3RmybA1的cDNA，确定了其碱基序列。Os3RmybA1 cDNA的碱基序列示于序列号31，该基因编码的Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列示于序列号32。
本发明提供了与Os3RmybA1功能等同的单子叶植物3Rmyb蛋白质。本发明中「具有等同功能」或「功能上等同」是指蛋白质具有作为细胞周期蛋白B基因或NACK相关基因的转录活化因子的功能。蛋白质是否为细胞周期蛋白B基因或NACK相关基因的转录调控因子，可通过在突变株中基于该蛋白质表达的功能互补试验或在植物细胞内瞬时表达该蛋白质而由其对细胞周期蛋白B基因或NACK1基因的转录活化确定。
用于分离与本发明特征性Os3RmybA1蛋白具有等同功能的蛋白质的植物可从单子叶植物中选择利用。它们可作为基因源而利用。
在一个获得并分离上述等同功能蛋白质的方法的实施方案中，向蛋白质中的氨基酸导入变异的方法为本领域技术人员所熟知。即本领域技术人员可通过公知的方法自天然型「Os3RmybA1」蛋白质(例如，序列号32所述的蛋白质)中进行合适的氨基酸替换、删除、添加等而制备与其具有等同功能的经修饰蛋白质。另外，自然界也产生氨基酸的变异体。本发明的蛋白质包含在天然型「Os3RmybA1」蛋白质中具有一个或多个氨基酸替换、删除或添加的氨基酸序列并且与天然型蛋白质具有等同功能的蛋白质。蛋白质中氨基酸的改变通常为全部氨基酸的50个氨基酸或以内，优选地30个氨基酸或以内，更优选地10个氨基酸或以内，更优选地3个氨基酸或以内。氨基酸的改变例如变异或替换可使用「Transformer Site-directedMutagenesis Kit」或「ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit」(Clontech公司生产)进行，另外删除可使用「Quantum leap NestedDeletion Kit」(Clontech公司生产)进行。
作为变异、变换和修饰法包括在日本生化学会编、「续生化学实验讲座1、基因研究法II」、p105(広瀬進)、东京化学同人(1986)；日本生化学会编、「新生化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)」、p233(広瀬進)、东京化学同人(1992)；R.Wu，L.Grossman编著，″Methods inEnzymology″，Vol.154，p.350 & p.367，Academic Press，New York(1987)；R.Wu，L.Grossman编著，″Methods in Enzymology″，Vol.100，p.457 & p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells等，Gene，34315，1985；T.Grundstroem等，Nucleic Acids Res.，133305，1985；J.Taylor等，Nucleic Acids Res.，138765，1985；R.Wu编著，″Methods in Enzymology″，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant等，Gene，44177，1986中描述的方法。例如利用合成的寡核苷酸等定点诱变(位点特异的诱变)(Zoller等，Nucl.Acids Res.，106487，1987；Carter等，Nucl.Acids Res.，134331，1986)、盒式诱变(cassette mutagenesisWells等，Gene，34315，1985)、限制选择诱变(restriction selection mutagenesisWells等，Philos.Trans.R.Soc.London Ser A，317415，1986)、丙氨酸扫描法(Cunningham & Wells，Science，2441081-1085，1989)、PCR诱变、Kunkel法、dNTP[αS]法(Eckstein)、使用亚硫酸或亚硝酸等进行指定区域的诱变等方法。
氨基酸的替换、删除或插入优选可导入变化，使构成该蛋白质的多肽的生理特性或化学特性发生了变化。具有所述替换、删除或插入的多肽与没有所述替换、删除或插入的多肽可基本上同一。所述氨基酸序列中氨基酸基本上同一的替换是指从该氨基酸所属类中选择其它的氨基酸。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等，极性(中性)氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，带正电荷氨基酸(碱性氨基酸)包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸等，带负电荷氨基酸(酸性氨基酸)包括天冬氨酸、谷氨酸等。视情况可将半胱氨酸替换为丝氨酸、甘氨酸替换为丙氨酸或亮氨酸、或亮氨酸替换为丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。
本发明的蛋白质可通过化学方法对其中含有的氨基酸残基进行修饰、通过酶例如肽酶如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、内肽酶、外肽酶等进行修饰、部分分解形成其衍生物或变体等。
另外，通过基因重组方法制备时，可作为融合蛋白表达，并且也可体内或体外变换或加工为与本发明目标蛋白质的天然形式具有基本上等同的生物学活性的蛋白质。可使用基因工程常用的融合方法产生，融合蛋白可利用其融合部分进行亲和层析而纯化。所述融合蛋白包括与组氨酸标签融合的融合蛋白、或与β-半乳糖苷酶(β-gal)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)或Cre重组酶的氨基酸序列融合的融合蛋白。同样，可向多肽添加异源表位标签，通过使用与所述表位特异结合的抗体而免疫亲和层析纯化。在更合适的实施方案中，所述表位标签包括例如AU5，c-Myc，CruzTag 09，CruzTag 22，CruzTag 41，Glu-Glu，HA，Ha.11，KT3，FLAG(注册商标，Sigma-Aldrich)，Omni-probe，S-probe，T7，Lex A，V5，VP16，GAL4，VSV-G等。(Field等，Molecular andCellular Biology，82159-2165页(1988)；Evan等，Molecular and CellularBiology，53610-3616页(1985)；Paborsky等，Protein Engineering，3(6)547-553页(1990)；Hopp等，BioTechnology，61204-1210页(1988)；Martin等，Science，255192-194页(1992)；Skinner等，J.Biol.Chem.，26615163-15166页(1991)；Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876393-6397页(1990)等)。也可使用酵母双杂交法。
进一步地，融合蛋白可为连接有标记物的可检测蛋白质。在更优选的实施方案中，该可检测标记物为生物素/链亲和素体系的Biotin Avi Tag、发荧光的物质。所述发荧光的物质包括来自发光水母维多利亚水母(Aequorea victorea)等的绿色荧光蛋白(GFP)、其经修饰变体(GFP变体)、例如EGFP(增强的人源化GFP)、rsGFP(red-shift GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、绿色荧光蛋白质(GFP)、蓝色荧光蛋白质(cyan fluorescentproteinCFP)、兰色荧光蛋白质(blue fluorescent proteinBFP)等(宫脇敦史编、实验医学别册后基因组时代的实验讲座3-GFP与生物影像、羊土社(2000年))。另外，可使用特异识别上述融合标签的抗体(包括单克隆抗体及其片段)进行检测。
本发明的蛋白质及其肽段的合成可采用肽合成领域公知的方法，例如液相合成法、固相合成法等化学合成法。所述方法中使用例如蛋白质或肽合成用树脂，将合适保护的氨基酸以本领域已知的多种缩合方法按照目的氨基酸序列依次结合至该树脂上。缩合反应优选地使用本领域已知的多种活化剂，所述活化剂可优选地使用碳二亚胺类例如二环己碳二亚胺。所得产物具有保护基时，可通过去除适宜保护基而获得目的物质。
本发明的蛋白质可通过本领域技术人员公知的方法制备为天然蛋白质，或利用基因重组技术制备为重组蛋白。天然蛋白质可如下制备例如将通过下述方法制备的重组蛋白免疫兔等小动物而获得的抗体结合至合适的吸附剂(CNBr活化的琼脂糖或甲苯磺酰基活化的琼脂糖)，从而制备柱，利用所得的柱纯化稻叶的蛋白质提取液。另外，重组蛋白可通过常规方法例如将编码本发明蛋白质的DNA插入合适的表达载体，然后将该载体导入合适的细胞，并自该转化细胞纯化而制备。
为了产生重组蛋白而使用的细胞包括例如植物细胞、大肠杆菌、酵母等微生物细胞、动物细胞、昆虫细胞等。另外，在细胞内表达重组蛋白的载体包括例如用于植物、酵母细胞的质粒「pBI121」或「pBI101」(Clontech公司生产)、用于大肠杆菌的质粒「pET表达系统」(Stratagene公司生产)或「GST基因融合载体」(Pharmacia公司生产)、用于哺乳类细胞的质粒「pMAM」(Clontech公司生产)、用于昆虫细胞的质粒「pBacPAK8.9」(Clontech公司生产)等。向载体中插入DNA可采用常规方法例如Molecular Cloning(Maniatis等，Cold Spring harborLaboratry Press)所述的方法进行。另外，向宿主细胞导入载体可采用常规方法使用相应于宿主细胞的电穿孔法、显微注射法、颗粒枪法等方法进行。
自所得到的转化细胞纯化本发明重组蛋白的方法可根据蛋白质的性质适当组合盐析或有机溶剂沉淀、离子交换层析、亲和层析、使用免疫吸附剂的柱层析、凝胶过滤、SDS电泳、等电点电泳等而进行。另外，将本发明的重组蛋白与谷胱甘肽S转移酶等标记物以融合蛋白表达时，可通过针对所述标记物进行亲和层析等而纯化。
另外，本发明提供了编码上述本发明蛋白质的DNA。本发明的DNA包括但不限于基因组DNA、cDNA、化学合成的DNA等，条件是只要其可编码本发明的蛋白质。可例如根据文献(Rogers和Bendich，Plant Mol.Biol.569(1985))所述的方法制备基因组DNA，以所制备的基因组DNA作为模板，使用根据本发明DNA的碱基序列(例如，序列号31所述的碱基序列)设计的引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction；PCR)而制备。另外，cDNA可根据常规方法(Maniatis等，Molecular Cloning ColdSpring harbor Laboratry Press)自植物制备mRNA，进行逆转录反应，使用上述相同的引物实施PCR而制备。另外，基因组DNA或cDNA可通过常规方法制备基因组DNA文库或cDNA文库，使用基于例如本发明DNA的碱基序列(例如，序列号31所述的碱基序列)合成的探针对该文库筛选而制备。
另外，分离功能上等同蛋白质的方法的其它实施方案包括杂交技术(Southern，J.Mol.Biol.98503(1975)；Maniatis等，″Molecular Cloning″，Cold Spring harbor Laboratry Press)或PCR技术(H.A.Erlich(编著)，″PCR technology″，Stockton Press，New York(1989))。即本领域技术人员熟知可以「Os3RmybA1」基因的碱基序列(序列号31)或其部分作为探针、以与「Os3RmybA1」基因碱基序列(序列号31)部分杂交的寡核苷酸作为引物，分离具有高同源性的DNA，自该DNA获得与「Os3RmybA1」蛋白质具有等同功能的蛋白质。本发明蛋白质包含通过上述杂交技术或PCR技术分离的与DNA编码的「Os3RmybA1」蛋白质具有等同功能的蛋白质。
本说明书中的PCR通常是指Saiki等，Science，239487(1988)；美国专利第4,683,195号说明书等中记载的方法，是指例如将目的核苷酸序列于体外酶扩增的方法。一般包括使用与模板核酸优先杂交的两条寡核苷酸引物，重复进行引物延伸合成的循环。典型地，PCR法所用引物为与模板内部待扩增的核苷酸序列互补的引物，优选地例如可使用与该待扩增核苷酸序列两端互补的引物，或使用该待扩增核苷酸序列侧翼的序列。优选地，典型的情况是5′端引物至少包含起始密码子或可扩增包含该起始密码子，另外，优选地，3′端引物至少包含终止密码子或可扩增包含该终止密码子。引物优选地为由5个或以上的碱基，更优选地10个或以上的碱基组成的寡核苷酸，更优选地包括由18～35个碱基组成的寡核苷酸。
PCR可根据本领域公知的方法或与之基本上同样的方法或改变方法，例如上述文献及其它文献，如R.Saiki，等，Science，2301350，1985；H.A.Erlich编著，PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover等编著，″DNA Cloning″，第二版，Vol.1，(The Practical Approach Series)，IRLPress，Oxford University Press(1995)；M.A.Innis等编著，″PCR Protocolsa guide to methods and applications″，Academic Press，New York(1990))；M.J.McPherson，P.Quirke和G.R.Taylor(编著)，PCRa practicalapproach，IRL Press，Oxford(1991)；M.A.Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002(1988)等记载的方法或对其改进、改变的方法。另外，PCR可使用相应的市售试剂盒，按照试剂盒制造商或试剂盒销售商明确提供的方法实施。
PCR典型的情况是将例如模板(例如，以mRNA为模板合成的DNA；第一链DNA等)、根据基因设计的引物、10×反应缓冲液(随Taq DNA聚合酶提供)、dNTPs(脱氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP，dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶及去离子蒸馏水进行混合。混合物使用例如GeneAmp2400 PCR system，Perkin-Elmer/Cetus等自动热循环仪在常规的PCR循环条件下重复循环25～60次，可根据扩增目的而决定适宜的循环数。PCR循环条件包括例如变性90～95℃ 5～100秒、退火40～60℃ 5～150秒、延伸65～75℃ 30～300秒的循环，优选地变性94℃ 15秒、退火58℃ 15秒、延伸72℃ 45秒的循环，其中退火的反应温度及时间可根据相应实验而选择合适的数值，变性反应及延伸反应的时间也可根据预期PCR产物的链长而选择合适的数值。优选地，退火的反应温度通常根据引物与模板DNA杂交的Tm值而发生变化。延伸反应的时间通常设定为大约1分钟延伸1000bp链长，但也可选择更短的时间。
所获得的DNA的碱基序列可利用例如「测序仪Model 310」(ABI公司生产)容易地确定。本发明的DNA例如也可用于上述重组蛋白的制备中。进一步地，由于本发明的DNA在植物体内表达，可获得细胞增殖变化了的经转化植物体或发育分化变化了的经转化植物体。
为了分离编码与Os3RmybA1功能上等同的蛋白质的基因而实施的杂交可在55℃杂交后，于含有0.1％SDS的2XSSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)或2XSSPE(3.6M NaCl，0.2M磷酸钠溶液(pH7.7)，0.02M Na2-EDTA)中55℃ 10分钟洗3次的条件下进行。更严格的杂交为65℃杂交后，于含有0.1％SDS的2XSSC或2XSSPE液中65℃ 10分钟洗3次而进行。进一步地，更严格的杂交为65℃杂交后，于含有0.1％SDS的2XSSC或2XSSPE液中65℃洗10分钟，然后于含有0.1％SDS的1XSSC或1XSSPE液中65℃ 10分钟洗2次。杂交液可使用「Molecular cloning(Maniatis T.等，ColdSpring Harbor Laboratory Press)」中所述的杂交液等。
本说明书中公开的相关蛋白质、其片段、进一步地包含DNA的核酸(包含mRNA或寡核苷酸)可单独或结合其它技术使用而可应用于基因组学及蛋白质组学技术，任选地与反义技术、包括单克隆抗体在内的抗体、转基因植物等适宜组合。另外，可应用于使用双链RNA(dsRNA)的RNAi(RNA干扰)技术中。因此，可进行以单碱基多型(SNP；单核苷酸多态性)为中心的基因多型分析、使用核酸阵列、蛋白质阵列的基因表达分析、基因功能分析、蛋白质间相互作用分析、相关基因分析、农药分析。例如，在核酸阵列技术中可通过使用cDNA文库，将通过PCR技术获得的DNA用点样装置高密度分布至基质，利用杂交而进行样本分析。
所述阵列化可通过将DNA使用针或针式物质或喷墨打印技术附着在载玻片、硅板、塑料板等基质的每一特定位置而实施。观察在该核酸阵列上的杂交结果所产生的信号而获取数据。所述信号为自荧光色素等标记物(例如，Cy3，Cy5，BODIPY，FITC，Alexa Fluor dyes(商品名)，得克萨斯红(商品名)等)产生的信号。可利用激光扫描仪等检测，将所得数据使用配备有合适算法程序的计算机系统进行处理。另外，对于蛋白质阵列技术，可使用连接有标签的重组蛋白质表达产物。在蛋白质阵列技术中可利用二维电泳(2-DE)、包含酶消化片段的质量分析(MS)(可包括使用电喷雾离子化法(electrospray ionizationESI)、基质辅助的激光解吸离子化法(matrix-assisted laser desorption/ionizationMALDI)等技术、MALDI-TOF分析仪、ESI-3联四极分析仪、ESI-离子阱分析仪等)、染色技术、同位素标记及分析、图像处理技术等。因此本发明也包含通过上述而可获得的与或可利用的与NACK2等及针对其的抗体相关的软件及数据库等。
本说明书中术语「抗体」取其广义用法，可以为针对目的Os3RmybA1蛋白、其构成多肽及相关肽片段的单克隆抗体，或者为对各种表位具有特异性的抗体组合物，还可以为1价抗体或多价抗体及多克隆抗体和单克隆抗体，还可以为天然型(完整)分子及其片段和衍生物，包含称为F(ab′)2、Fab′及Fab的片段，进一步地还可以为具有至少二个抗原或表位(epitope)结合部位的嵌合抗体或杂化抗体、或为例如quadrome、triome等双特异性重组抗体、种间杂化抗体、抗同种型抗体，进一步考虑了经化学修饰或加工等的衍生物、适用公知的细胞融合、杂交瘤技术或抗体工程并使用合成或半合成技术获得的抗体、适用自抗体生成观点公知的现有技术而使用DNA重组技术制备的抗体、本说明书描述且定义的对目的抗原物质或目的表位具有中和特性的抗体或具有结合特性的抗体。尤其优选的本发明抗体包括特异识别选自序列号32第53～202位区域的多肽的抗体。
针对抗原物质的单克隆抗体可通过培养一系列细胞系而产生抗体分子的任一方法产生。修饰语「单克隆」是显示所述抗体的特性为自基本上均质的抗体集合获得的，并不构成需要具体的方法产生所述抗体。每种单克隆抗体包含相同的抗体集合，除了可能自然产生的变体也许以少量存在之外。单克隆抗体为具有高特异性并且针对具有单一抗原性位点的抗体。与一般包含针对不同抗原决定簇(表位)的多种抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每一单克隆抗体为针对所述抗原上的单一抗原决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体由于自杂交瘤培养而合成，具有不含或很少含有其它免疫球蛋白类杂质的优点。单克隆抗体包含杂化抗体及重组抗体。它们可通过用恒定区结构域替换可变区结构域、或用重链替换轻链、用另一种链替换某种链、或与异源蛋白质融合而获得，只要其具有目的生物活性，与其来源、免疫球蛋白类或亚类无关(例如，美国专利第4816567号；Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，79-97页，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987年，等)。
制备单克隆抗体合适的方法包括例如杂交瘤法(G.Kohler和C.Milstein，Nature，256，495-497页(1975))；人B细胞杂交瘤法(Kozbor等，Immunology Today，4，72-79页(1983)；Kozbor，J.Immunol.，133，3001页(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)；triome法；EBV-杂交瘤法(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，77-96页(1985))(产生人单克隆抗体的方法)；美国专利第4946778号(产生单链抗体的技术)，并包括涉及抗体的以下文献S.Biocca等，EMBO J，9，101-108页(1990)；R.E.Bird等，Science，242，423-426页(1988)；M.A.Boss等，Nucl.Acids Res.，12，3791-3806页(1984)；J.Bukovsky等，Hybridoma，6，219-228页(1987)；M.DAINO等，Anal.Biochem.，166，223-229页(1987)；J.S.Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883页(1988)；P.T.Jones等，Nature，321，522-525页(1986)；J.J.Langone等(编著)，″Methods in E nzymology″，Vol.121(Immunochemical Techniques，Part IHybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)，AcademicPress，New York(1986)；S.Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6851-6855页(1984)；V.T.Oi等，BioTechniques，4，214-221页(1986)；L.Riechmann等，Nature，332，323-327页(1988)；A.Tramontano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，6736-6740页(1986)；C.Wood等，Nature，314，446-449页(1985)；Nature，314，452-454页(1985)或其中引用的文献(其中的公开在本说明书引用作为参考)。本发明的抗体除了可用于所述基因表达产物的分析、检测等外，还有多种用途。
本发明中分离编码植物3Rmyb蛋白质的DNA的方法可使用前述的杂交方法、PCR方法。利用PCR分离的情形为例如使用实施例1所述的简并引物进行PCR，可分离编码显示为3个重复结构的myb DNA结合区的DNA。为提高PCR的特异性，可进行巢式PCR，使用相对于目的序列而言较最初使用的PCR引物更靠近内侧的退火PCR引物。确定获得的DNA的碱基序列后，可使用cDNA末端快速扩增法(RACE法，Dorit等，Currentprotocols in moleculer biology.Unit15.6(1992))分离cDNA的5′及3′末端序列并测定其序列。
分离本发明特征性植物3Rmyb蛋白质的植物可选自双子叶植物。所述双子叶植物可作为基因源利用。
对本发明的特征性双子叶植物或单子叶植物没有特定的限制，可选自许多栽培植物或有用植物，包括谷类、豆类、根茎类、种子类、蔬菜类、果实类植物，进一步包括园林花木树木等。所述植物包括例如茄科、芸苔科、禾本科、豆科、百合科、伞形科、葫芦科等植物，优选地烟草、拟南芥、大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、花生、稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、剪股颖、玉米、大豆、马铃薯、甘薯、芋、魔芋、木薯等。
本发明提供了制备这样分子的方法，所述分子可改变NtmybA1蛋白、NtmybA2蛋白、Os3RmybA1蛋白、AtMYB3R1蛋白、AtMYB3R4蛋白的功能、提高这些蛋白质的转录活化功能。
本发明中提高NtmybA1蛋白转录活化功能的分子中至少一种分子选自(a)序列号51所示NtmybA1蛋白的第459～1003位氨基酸序列删除的分子；(b)更优选地，序列号51所示NtmybA1蛋白的第579～1003位氨基酸序列删除的分子、或第715～1003位氨基酸序列删除的分子；(c)最优选地，序列号51所示NtmybA1蛋白的第641～1003位氨基酸序列删除的分子。
本发明中提高NtmybA2蛋白转录活化功能的分子中至少一种分子选自(a)序列号53所示NtmybA2蛋白的第413～1042位氨基酸序列删除的分子；(b)更优选地，序列号53所示NtmybA2蛋白的第569～1042位氨基酸序列删除的分子、或第705～1042位氨基酸序列删除的分子；(c)最优选地，序列号53所示NtmybA2蛋白的第631～1042位氨基酸序列删除的分子。
本发明中提高Os3RmybA1蛋白转录活化功能的分子中至少一种分子选自(a)序列号32所示Os3RmybA1蛋白的第426～993位氨基酸序列删除的分子；(b)更优选地，序列号32所示Os3RmybA1蛋白的第575～993位氨基酸序列删除的分子、或第709～993位氨基酸序列删除的分子；(c)最优选地，序列号32所示Os3RmybA1蛋白的第635～993位氨基酸序列删除的分子。
本发明中提高AtMYB3R1蛋白转录活化功能的分子中至少一种分子选自(a)序列号75所示AtMYB3R1蛋白的第583～776位氨基酸序列删除的分子、或第691～776位氨基酸序列删除的分子；(b)优选地，序列号75所示AtMYB3R1蛋白的第621～776位氨基酸序列删除的分子。
本发明中提高AtMYB3R4蛋白转录活化功能的分子中至少一种分子选自(a)序列号76所示AtMYB3R4蛋白的第570～961位氨基酸序列删除的分子、或第667～961位氨基酸序列删除的分子；(b)优选地序列号76所示AtMYB3R4蛋白的第608～961位氨基酸序列删除的分子。
本发明提供了制备这样的分子的方法，所述分子改变NtmybA1蛋白、NtmybA2蛋白、Os3RmybA1蛋白、AtMYB3R1蛋白、AtMYB3R4蛋白的功能，使这些蛋白质的转录活化功能与野生型相比较呈现下降或消失，即相对于内源的植物3Rmyb分子为显性失活分子。
本发明的NtmybA1蛋白、NtmybA2蛋白、Os3RmybA1蛋白、AtMYB3R1蛋白、AtMYB3R4蛋白相对于内源的植物3Rmyb基因为显性失活的分子中至少一种分子选自(a)序列号51所示NtmybA1蛋白的第299～1003位氨基酸序列删除的分子；(b)更优选地，序列号51所示NtmybA1蛋白的第186～1003位氨基酸序列删除的分子；(c)序列号53所示NtmybA2蛋白的第243～1042位氨基酸序列删除的分子；(d)更优选地，序列号53所示NtmybA2蛋白的第188～1042位氨基酸序列删除的分子；
(e)序列号32所示Os3RmybA1蛋白的第257～993位氨基酸序列删除的分子；(f)更优选地，序列号32所示Os3RmybA1蛋白的第203～993位氨基酸序列删除的分子；(g)序列号75所示AtMYB3R1蛋白的241～776第位氨基酸序列删除的分子；(h)更优选地，序列号75所示AtMYB3R1蛋白的第187～776位氨基酸序列删除的分子；(i)序列号76所示AtMYB3R4蛋白的第235～961位氨基酸序列删除的分子；(j)更优选地序列号76所示AtMYB3R4蛋白的第181～961位氨基酸序列删除的分子。
NtmybA2蛋白第242～1042位氨基酸序列删除的分子、第188～1042位氨基酸序列删除的分子的转录活化功能较野生型NtmybA2蛋白下降、而且NtmybA2蛋白第188～1042位氨基酸序列删除的分子与全长NtmybA2蛋白的共表达抑制单独NtmybA2蛋白的转录活化功能、进一步地，全长NtmybB蛋白质与第188～1042位氨基酸序列删除的分子共表达抑制单独NtmybB蛋白质的转录抑制功能，这些事实表明NtmybA2蛋白第243～1042位氨基酸序列删除的分子或第188～1042位氨基酸序列删除的分子相对于内源的植物3Rmyb蛋白质显示显性失活功能。
说明书及附图中的用语根据IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature进行、或基于所述领域常用用语的意思。代表性用语的意思显示如下。
关于氨基酸序列A丙氨酸(Ala) M甲硫氨酸(Met)C半胱氨酸(Cys) N天冬酰胺(Asn)D天冬氨酸(Asp) P脯氨酸(Pro)E谷氨酸(Glu) Q谷氨酰胺(Gln)
F苯丙氨酸(Phe)R精氨酸(Arg)G甘氨酸(Gly) S丝氨酸(Ser)H组氨酸(His) T苏氨酸(Thr)I异亮氨酸(Ile)V缬氨酸(Val)K赖氨酸(Lys) W色氨酸(Trp)L亮氨酸(Leu) Y酪氨酸(Tyr)X上述的任一氨基酸或特定的任意氨基酸(在特别指定时为所指定的氨基酸)(Xaa)关于核苷酸序列A，a腺嘌呤 G，g鸟嘌呤C，c胞嘧啶 T，t胸腺嘧啶R，r鸟嘌呤或腺嘌呤 Y，y胸腺嘧啶/尿嘧啶或胞嘧啶M，m腺嘌呤或胞嘧啶 K，k鸟嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶S，s鸟嘌呤或胞嘧啶 W，w腺嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶D，d腺嘌呤或鸟嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶H，h腺嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶V，v腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶N，n对于是为腺嘌呤或鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶不明确，或者可为其它任意碱基(在特别指定时为所指定的碱基)实施例给出以下实施例具体说明本发明，这些实施例仅为用于本发明的说明目的而提供的具体实施方式
的参考。这些例子为用于本发明的特定具体实施方式
的说明目的，并不用于限定或限制所公开的本发明范围。对于本发明可以理解的是，基于本说明书的精神可有多种实施方式。
另外，DNA的切割、连接、大肠杆菌的转化、基因的碱基序列确定、杂交等常规基因重组所需方法基本遵循每一操作所用的市售试剂、机械装置等提供的说明书、实验书(包括例如「Molecular cloning(Maniatis T.等，Cold Spring Harbor Laboratory Press)」(J.Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(第二版，1989 & 第三版，2001))。全部实施例采用标准技术或可实施方法实施，除非另有详细描述外，这些为本领域技术人员周知的惯用方法。
实施例1稻Os3RmybA1基因的分离和碱基序列的测定自稻分离编码3Rmyb的cDNA、测定其碱基序列。为分离cDNA，使用参考烟草的3Rmyb即NtmybA1、NtmybA2、NtmybB的myb DNA结合区的氨基酸序列所设计的简并引物，以自稻愈伤组织制备的cDNA为模板进行PCR反应。为了提高简并PCR的特异性，通过实施巢式PCR而成功分离了显示3个重复的myb DNA结合区的cDNA片段。
自获得的片段，使用5′RACE法、3′RACE法确定全长cDNA的末端序列。
通过参考5′末端序列和3′末端序列而设计的引物成功分离包含基因全长的cDNA。如下详述。
(1)mRNA的纯化及cDNA合成稻(品种日本晴)种子去壳，用安替佛民灭菌后，置于添加了蔗糖30g/l、2，4-D 2mg/l、脱乙酰吉兰糖胶2g/l的N6CI培养基(N6无机盐、N6维生素(Chu等(1975)，Sientia Sinica 18659)，pH5.8)上，诱导来自胚盘的愈伤组织。
自所述愈伤组织130mg使用RNeasy plant mini kit(QIAGEN公司)提取总RNA。自提取的总RNA 50μg使用PolyATtract mRNA IsolationSystems(Promega公司)纯化mRNA。纯化的mRNA经乙醇沉淀浓缩后，使用RT-PCR的Superscript第一链合成体系(Invitrogen公司)合成cDNA。
(2)使用Myb结构域的简并引物进行PCR而克隆经合成的cDNA 50μl中取出2μl进行PCR反应。PCR反应所用的引物为DEGmybF(5′-GAIGTICARTGYYWICAYMGNTGG-3′；序列号1)及DEGmybR(5′-YTTYTTDAVIGAISWRTKCCA-3′；序列号2)。反应于50μl体积进行，使用Ex taq(Takara公司)、Ex taq附带的反应缓冲液、各200μM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、各10μM DEGmybF及DEGmybR。使用GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems公司)94℃ 30秒、42℃ 30秒、72℃ 30秒的步骤重复35个循环。反应结束后，使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化PCR反应液。
经纯化的PCR反应液取1μl作为模板进行巢式PCR。第二次PCR反应所用的引物为根据DEGmybF和DEGmybR内侧的区域设计的简并引物DEGmybF2(5′-CARTGYYTICAYMGITGGCARAARG-3′；序列号3)及DEGmybR2(5′-ACISWISWRTTCCARTTRTGYTT-3′；序列号4)。反应于50μl体积进行，使用Ex taq(Takara公司)、Ex taq附带的反应缓冲液、各200μM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、各10μM DEGmybF2及DEGmybR2。使用GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems公司)94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒的步骤重复35个循环。反应结束后，使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化PCR反应液。
经纯化的第二次PCR反应液取1μl作为模板，接下来进行巢式PCR。第三次PCR反应所用的引物为根据DEGmybF2及DEGmybR2内侧区域设计的简并引物DEGmybF3(5′-CAYMGITGGCARAARGTIYTIRAYCC-3′；序列号5)及DEGmybR3(5′-HIGCRTTITCISWICKICCIKGIA-3′；序列号6)。反应于50μl体积进行，使用Ex taq(Takara公司)、Ex taq附带的反应缓冲液、各200μMdATP、dTTP、dCTP、dGTP、各10μM DEGmybF3及DEGmybR3。使用GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems公司)94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒的步骤重复30个循环。反应结束后PCR反应液使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化。使用琼脂糖凝胶分析PCR反应液时，证实扩增了约300bp的DNA，将所述DNA片段使用pCR4-TOPO(Invitrogen公司)进行TA克隆。对自3个克隆获得的质粒中所插入的DNA使用T7引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；序列号7)测定碱基序列，获得了序列号8、序列号9、序列号10。
(3)稻3Rmyb cDNA的5’末端序列测定为了得到包含自(1)获得的3Rmyb DNA结合区的片段序列的稻3Rmyb基因全长cDNA，进行cDNA 5’末端侧的分离。5′末端侧的DNA使用GeneRacer Kit(Invitrogen公司)通过5′RACE法分离。自前述(1)所述方法诱导的来自稻胚盘的愈伤组织130mg使用RNeasy plant mini kit(QIAGEN 公司)提取总RNA。提取的总RNA取3μg用作模板，通过GeneRacer Kit(Invitrogen公司)合成cDNA。以此cDNA为模板，将参考序列号8、序列号9、序列号10设计的引物78687-R1(5′-CAGCTCGGCCCATTTATTTCCATACATT-3′；序列号11)及GeneRacerKit(Invitrogen公司)附带的引物GeneRacer 5′Primer(5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′；序列号12)用于进行PCR反应。反应使用Ex taq(Takara公司)于50μl体积进行。使用GeneAmp PCRsystem 9700(PE Applied Biosystems公司)94℃ 2分钟后，94℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行5个循环、94℃ 30秒、70℃ 3分钟的步骤进行5个循环、94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行25个循环、最后72℃ 10分进行反应。取PCR反应液1μl为模板、使用引物78687-R2(5′-CTTCTTGTGTCCATGCCTCCTTGTTTAT-3′；序列号13)及GeneRacerKit(Invitrogen公司)所附引物GeneRacer 5′Nested Primer(5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′；序列号14)进行PCR反应。反应使用Ex taq(Takara公司)于50μl体积进行。使用GeneAmp PCRsystem 9700(PE Applied Biosystems 公司)94℃ 2分钟后、94℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行5个循环、94℃ 30秒、70℃ 3分钟的步骤进行5个循环、94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行25个循环、最后进行72℃ 10分钟的反应。反应结束后使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN 公司)纯化PCR反应液。经扩增的DNA 用 pCR4-TOPO(Invitrogen公司)进行TA克隆。对获得的质粒中插入的DNA使用T7引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；序列号7)和T3引物(5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′；序列号15)测定碱基序列。克隆#26的碱基序列如序列号16所示，克隆#27的碱基序列如序列号17所示。
(4)稻3Rmyb cDNA 3′末端序列的测定为了得到包含自(1)获得的3Rmyb DNA结合区的片段序列的稻3Rmyb基因全长cDNA，进行cDNA 3’末端侧的分离。3′末端侧的DNA使用GeneRacer Kit(Invitrogen公司)通过3′RACE法分离。自前述(1)所述方法诱导的来自稻胚盘的愈伤组织130mg使用RNeasy plant mini kit(QIAGEN公司)提取总RNA。提取的总RNA取5μg用作模板，通过GeneRacer Kit(Invitrogen公司)合成cDNA。以此cDNA为模板，将参考序列号8、序列号9、序列号10设计的引物(5′-AGGAGGCATGGACACAAGAAGAGGAAAT -3′；序列号18)及GeneRacer Kit(Invitrogen公司)附带的引物GeneRacer 3′Primer(5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；序列号19)用于进行PCR反应。反应使用Ex taq(Takara公司)于50μl体积进行。使用GeneAmp PCRsystem 9700(PE Applied Biosystems公司)94℃ 2分钟后，94℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行5个循环，94℃ 30秒、70℃ 3分钟的步骤进行5个循环，94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行25个循环，最后72℃反应10分钟。取出1μl PCR反应液作为模板，使用引物78687-F2(5′-GGAAATAAATGGGCCGAGCTGACAAAAT-3′；序列号20)和GeneRacer Kit(Invitrogen公司)所附引物GeneRacer 3′Nested Primer(5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTC-3′；序列号21)进行PCR反应。反应使用Ex taq(Takara公司)于50μl体积进行。使用GeneAmp PCR system9700(PE Applied Biosystems公司)94℃ 2分钟后、94℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行5个循环，94℃ 30秒、70℃ 3分钟的步骤进行5个循环，94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 3分钟的步骤进行25个循环，最后72℃反应10分钟。反应结束后使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化PCR反应液。经扩增的DNA用pCR4-TOPO(Invitrogen公司)进行TA克隆。对获得的质粒中插入的DNA使用T7引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；序列号7)和T3引物(5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′；序列号15)测定插入的DNA片段5′侧和3′侧的碱基序列。克隆#31的5′侧碱基序列如序列号22所示，3′侧碱基序列如序列号23所示。
(5)分离包含稻3Rmyb结构基因全长的cDNA并测定其碱基序列根据上述(1)所述方法自诱导的来自稻胚盘组织130mg通过RNeasyplant mini kit(QIAGEN公司)提取总RNA。自所提取的总RNA取5μg、通过RT-PCR的Superscript第一链合成体系(Invitrogen公司)合成cDNA。
合成的cDNA 50μl中取出1μl进行PCR反应。PCR反应中所用的引物为OsA1-1F(5′-TGTCTTCAGTCATGATGACAAGCGA-3′；序列号24)及OsA1-2R(5′-CAAGCTATCTAAAACTTTTCAGAAGATGG-3′；序列号25)。反应使用PfuTurbo热启动DNA聚合酶(Stratagene公司)、PfuTurbo热启动DNA聚合酶所附的反应缓冲液、各200μM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、分别使用1μM的OsA1-1F及OsA1-2R，以50μl液量反应。使用GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems公司)95℃ 2分钟后，95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 4分钟的步骤进行40个循环的重复。最后于72℃反应10分钟。反应结束后、使用QIAquick PCR PurificationKit(QIAGEN公司)纯化PCR反应液。使用琼脂糖凝胶分析PCR反应液并分析，经证实约3kbp的单一DNA扩增，将该DNA片段用pCR4-TOPO(Invitrogen公司)进行TA克隆。对该DNA所插入的质粒pCR4-Os3RmybA1使用T7引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；序列号7)、T3引物(5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′；序列号15)、引物78687-F1(5′-AGGAGGCATGGACACAAGAAGAGGAAAT-3′；序列号18)、引物OsA1-4F(5′-GATCAACACTTGCAAGAGGA-3′；序列号26)、引物OsA1-3F(5′-ACAGGGCCTTCTTTTCTGGAC-3′；序列号27)、引物OsA1-5F(5′-AGCATACCTGAATGTGGGGA-3′；序列号28)、引物OsA1-6F(5′-TACTCATGATGAAAGCACGG-3′；序列号29)、引物OsA1-7F(5′-ATCTCCTTCACATGGAAGTC-3′；序列号30)、测定碱基序列。获得的碱基序列如序列号31所示。
实施例2序列号31的DNA编码的氨基酸序列如序列号32所示。序列号32的氨基酸序列包含3个重复的myb DNA结合区，编码所述序列的基因称为Os3RmybA1。Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列与自DDBJ的登录号BAB78687的已登录基因组预测的推定氨基酸序列(序列号49)进行最佳比对，结果Os3RmybA1 cDNA编码的氨基酸序列与BAB78687的氨基酸序列在N端区存在高相似性、而C端区不同。BAB78687的第783位氨基酸以后与Os3RmybA1不同，BAB78687为由787个氨基酸组成的蛋白质，而Os3RmybA1为由993个氨基酸组成。认为这是因为对来自基因组序列的BAB78687结构基因预测时，剪接部位的预测不同(
图1、图2、图3)。
实施例3Os3RmybA1的转录活化功能所分离Os3RmybA1的功能通过对在启动子区包含MSA调控序列的CYM基因的转录活化功能证实。即烟草培养细胞BY2原生质体中由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子表达Os3RmybA1的质粒与包含融合有CYM启动子和萤光素酶基因的报告基因的质粒共导入，自瞬时表达的萤光素酶活性定量Os3RmybA1的转录活化功能。
(1)质粒的构建表达质粒的构建pEXP-Os3RmybA1的构建pCR4-Os3RmybA1用EcoRI切割，所切出的包含Os3RmybA1的DNA片段以有义方向插入用EcoRI切割pEXP35S所产生的位点处，从而构建pEXP-Os3RmybA1。pEXP-Os3RmybA1为通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子而表达Os3RmybA1的ORF全长的质粒。
另外，与pEXP-Os3RmybA1功能基本等同的质粒可如下构建。用EcoRI和SacI切割pBI221(Clontech公司生产)，所切出DNA的突出末端用克列诺片段钝端化，然后插入pBluescript(SK-)用XhoI切割、使用克列诺片段钝端化后的位点处，从而构建质粒pTN。用PstI切割pBI221、用克列诺片段对产生的突出末端钝端化，接下来用XbaI切割，将切出的DNA片段插入用NotI切割pTN、用克列诺片段将突出末端钝端化、接下来用XbaI切割而产生的位点处，从而构建了pP35S质粒。即pP35S质粒为在CaMV 35S启动子与胭脂碱合成酶终止子之间具有多个限制酶切割部位的质粒。将pCR4-Os3RmybA1用EcoRI切割，切出的含有Os3RmybA1的DNA片段以有义方向插入用EcoRI切割pP35S而产生的位点处，从而构建pP35S-Os3RmybA1。pP35S-Os3RmybA1为通过CaMV 35S启动子表达Os3RmybA1的ORF全长的质粒。
pEXP-GUS质粒的构建用SacI切割pBI-121(Clontech公司生产)后，用克列诺片段将突出末端钝端化，接下来用HindIII切割，将所产生的DNA片段插入pEXP35S用EcoRI切割后用克列诺片段将突出末端钝端化并用HindIII切割而生成的部位处，由此构建pEXP-GUS。pEXP-GUS为通过CaMV 35S启动子表达GUS的质粒。可利用与pEXP-GUS基本上具有同等功能的质粒pBI221(Clontech公司生产)。
R-LUC质粒的构建将用BamHI和NheI切割pRL-null Vector质粒(Promega公司生产)所产生的片段插入用XbaI和BamHI切割pBI-221(Clontech公司生产)后所产生的部位。该质粒用XbaI和SacI切割后，用克列诺片段将突出末端钝端化，去除所切下的DNA片段后，进行自我连接，从而构建R-LUC质粒。R-LUC质粒为通过CaMV 35S启动子表达来自Renilla的萤光素酶(R-LUC)的质粒。
CYM启动子-LUC质粒的构建将用HindIII和SacI切割pDO432质粒(Nishiuchi等，Plant Mol.Biol.，29599(1995))产生的DNA片段插入用HindIII和SacI切割pBI221(Clontech公司生产)并除去包含CaMV 35S启动子区DNA片段的部位，从而构建pUC-LUC。CYM启动子区以通过常规方法自长春花(Catharanthus roseus)制备的基因组DNA为模板，通过PCR制备。PCR反应所用的引物为CYM3(5′-CCGGATCCTTCAATAGAATTTCTTCCA-3′；序列号56)及CYM5-1(5′-CCAAGCTTACCCATAAATTGTTGGTAAA-3′；序列号57)。将所扩增的CYM启动子区用BamHI和HindIII切割后，插入用BamHI和HindIII切割pUC-LUC而产生的部位，从而构建CYM启动子-LUC质粒。即CYM启动子-LUC质粒为通过CYM启动子表达萤光素酶(LUC)的质粒，其中所述CYM启动子在3个位置包含作为调控序列的MSA序列。
(2)BY-2原生质体的制备、质粒的导入、LUC活性的测定自在新鲜的100ml LSD液体培养基(Nagata等(1981)Mol.Gen.Genet.184161)中接种培养3日的烟草培养细胞BY2，根据Evans等的方法制备原生质体(Evans等(1983)Int.Rev.Cytol.3353)。即BY2细胞以2000转/分钟、室温离心LSD液体培养基而回收细胞，加入100ml N2培养基(1％纤维素酶″ONOZUKA″RS(ヤクルト公司生产)、0.5％半纤维素酶(SIGMA公司生产)、0.1％溶果胶酶(Pectolyase)Y-23(キツコ一マン公司生产)、7.4g/l CaCl2·2H2O、1.6g/l乙酸钠、45g/l甘露糖醇、pH5.7)。于暗处27℃轻轻摇动培养，从而消化细胞壁。3小时后500转/分钟、室温离心操作回收细胞。向回收的细胞加入50ml N3培养基(7.4g/l CaCl2·2H2O、1.6g/l乙酸钠、45g/l甘露糖醇、pH5.7)洗。通过500转/分钟、室温离心回收细胞，重悬于40ml N4培养基(4.6g/l ムラシゲ·スク一グ培养基用混合盐类(和光纯药公司生产)、100mg/l酪蛋白氨基酸、100mg/l肌醇、2.8g/l L-脯氨酸、97.6mg/l MES、1mg/l盐酸硫胺素、357mg/l KH2PO4、102.6g/l蔗糖、pH5.7)。进行700转/分钟、室温10分钟的离心操作，回收培养基上层存在的原生质体。
使用PEG法向获得的原生质体导入质粒DNA(Bilang等(1994)，PlantMolecular Biology Manual，pp.A1，1-16.)。即，获得的原生质体用40mlW5(154mM NaCl、124mM CaCl2、5mM KCl、5mM葡萄糖、pH5.8)洗净后，通过室温500转/分钟离心3分钟的回收原生质体。重复该洗净操作3次。洗净后的原生质体使用MMM(15mM MgCl2、0.1％MES、0.5M甘露糖醇、pH5.8)将浓度调节至2×105个/ml。MMM中悬浮的原生质体分别加至250μl试管，加入20μl质粒DNA溶液。温和搅拌后，加入250μl PEG溶液(向0.4M甘露糖醇、0.1M Ca(NO3)2溶液中加入PEG4000，使成为40％w/v，调节pH8后、灭菌)，温和搅拌。最后加入5ml添加了0.4M甘露糖醇的LSD液体培养基，于暗处培养20小时。培养后，于室温500转/分钟离心3分钟回收细胞，测定LUC及R-LUC活性。使用Dual-LuciferaseReporter assay system(Promega公司生产)作为它们的基质，用发光计LB955(berthold公司生产)测定。
(3)通过Os3RmybA1活化CYM启动子所导入样本间的导入效率的标准化通过同时导入在CaMV 35S启动子下表达Renilla萤光素酶的R-LUC质粒，以Renilla萤光素酶的活性校正LUC活性而进行。使用了通过CaMV 35S启动子表达全长Os3RmybA1的质粒pEXP-Os3RmybA1、通过CaMV 35S启动子表达GUS的质粒pEXP-GUS、前述的CYM启动子-LUC质粒、R-LUC质粒。导入重复进行5次。质粒的组合如下(i)不含效应子质粒的组合(CYM启动子-LUC质粒(10μg/1样本)+pEXP-GUS质粒(10μg/1样本)+R-LUC质粒(1μg/1样本)，(ii)与效应子质粒pEXP-Os3RmybA1的组合(CYM启动子-LUC质粒(10μg/1样本)+pEXP-Os3RmybA1质粒(10μg/1样本)+R-LUC质粒(1μg/1样本))，(iii)与效应子质粒pEXP-NtmybA2的组合(CYM启动子-LUC质粒(10μg/1样本)+pEXP-NtmybA2质粒(10μg/1样本)+R-LUC质粒(1μg/1样本))。当导入(i)的组合时LUC比活性(由Renilla萤光素酶的活性标准化的萤光素酶活性)定为1的情形下，(ii)的LUC比活性提高约2.5倍。同样地(iii)的LUC比活性也提高约2.5倍(图4)。显示了Os3RmybA1可活化CYM启动子的转录。令人吃惊的是，与Os3RmybA1为自稻克隆的cDNA无关，在烟草细胞内其也显示与烟草NtmybA2同等程度的转录活化功能。自稻分离的Os3RmybA1在烟草细胞内显示与烟草NtmybA2等同的功能表明在单子叶植物和双子叶植物中G2/M期的基因表达调节机制是高度保守的。
实施例4分离编码NtmybA1、NtmybA2、NtmybB的DNA。
编码本发明所用NtmybA1的DNA的碱基序列显示为序列号50，氨基酸序列显示为序列号51。编码NtmybA2的DNA的碱基序列显示为序列号52，氨基酸序列显示为序列号53。编码NtmybB的DNA的碱基序列显示为序列号54，氨基酸序列显示为序列号55。
编码NtmybA1、NtmybA2、NtmybB的DNA使用酵母单杂交系统(Yeast One-hybrid system)(Clontech公司生产)分离(Ito等，Plant Cell，131891(2001))。自培养2天的BY2细胞制备cDNA，并插入pGAD10质粒构建cDNA文库。用包含MSA序列的启动子-NACK1启动子与组氨酸合成酶(HIS3)功能性融合产生的报告基因插入染色体，制备出组氨酸合成酶(HIS)缺陷酵母株，并转化前述的cDNA文库。所转化的酵母使用未添加组氨酸的培养基选择，自生长和发育的菌落回收3种质粒(OH53、OH60、OH88)，确定所插入cDNA的碱基序列，获得编码NtmybA1、NtmybA2、NtmybB的DNA。OH53质粒中插入了编码NtmybA1的DNA片段、OH60质粒中插入了编码全长NtmybA2的DNA、OH88质粒中插入了编码全长NtmybB的DNA。由于OH53不包含全长，使用3′RACE法确定3′末端序列，获得了插入NtmybA1全长cDNA的pGEMe-OH53i6质粒。
这些DNA使用PCR或杂交可较简便地分离。使用杂交时，可筛选制备自对数增殖期BY2细胞的cDNA于质粒或噬菌体构建的文库。使用的探针NtmybA1可参考序列号50所述的DNA、NtmybA2可参考序列号52所述的DNA、NtmybB可参考序列号54所述的DNA而制备。
另外，使用PCR分离时，使用自对数增殖期的BY2细胞制备的cDNA为模板。对NtmybA1引物可参考序列号50所述的DNA、对NtmybA2引物可参考序列号52所述的DNA、对NtmybB引物可参考序列号54所述的DNA而设计。在显示质粒构建的下述实施例中，可通过在PCR引物中添加合适的限制酶识别序列而自OH60或OH88等使用限制酶切出NtmybA2或NtmybB的DNA片段。
实施例5pEXP-NtmybA2、pEXP-NtmybB质粒的构建构建了通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子表达NtmybA2及NtmybB的pEXP-NtmybA2及pEXP-NtmybB质粒。向pEXP35S用SalI切割所生成的位点处以有义方向插入将OH60及OH88用SalI切割而切出的DNA片段，构建通过CaMV 35S启动子表达NtmybA2或NtmybB的pEXP-NtmybA2及pEXP-NtmybB质粒。另外，与这些质粒基本上功能同等的质粒可如下构建。向pP35S质粒用SalI切割所产生的位点处插入将OH60或OH88用SalI切割而切出的DNA片段，由此构建pP35S-NtmybA2、pP35S-NtmybB。即pP35S-NtmybA2、pP35S-NtmybB为通过CaMV 35S启动子表达NtmybA2或NtmybB的质粒。
实施例6NtmybA2的调节转录活化功能的功能结构域NtmybA2为NACK1基因或CYM基因的转录活化因子。但是还不知道NtmybA2蛋白中与转录活化功能有关的功能结构域。因此为了探索其功能结构域，删除了NtmybA2蛋白的C端侧而制备变体，由这些变体测定NACK1基因的转录活化功能，从而确定NtmybA2的调节转录活化功能的功能结构域。
(1)质粒的构建构建编码NtmybA2蛋白C末端截短变体的多种质粒为了研究NtmybA2中发挥转录活化功能的功能结构域，制备了自C末端侧删除NtmybA2氨基酸序列的以下NtmybA2变体。
(i)pEXP-NtmybA2T1(第705位氨基酸至C末端删除)(ii)pEXP-NtmybA2T2(第631位氨基酸至C末端删除)(iii)pEXP-NtmybA2T3(第569位氨基酸至C末端删除)(iv)pEXP-NtmybA2ΔEcoRI(第413位氨基酸至C末端删除)(v)pEXP-NtmybA2T4(第243位氨基酸至C末端删除)(vi)pEXP-NtmybA2T5(第188位氨基酸至C末端删除)(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)的质粒为使用pEXP-NtmybA2为模板通过PCR制备的截短DNA片段。PCR所用的引物为引物35S0(5′-TATCCTTCGCAAGACCCTTC-3′；序列号48)和(i)的引物A2-T1-TAG(5′-CCGTCGACTATGCAGCCTCGTCAAACATAA-3′；序列号43)、(ii)的引物A2-T2-TAG(5′-CCGTCGACTACCACAGCCTAAATGGAGTA-3′；序列号44)、(iii)的引物A2-T3-TAG(5′-CCGTCGACTATATGCTCGAATTTTCGTTCAC-3′；序列号45)、(v)的引物A2-T4-TAG(5′-CCGTCGACTAGCATTCTGAAGCTTCCTCC-3′；序列号46)、(vi)的引物A2-T5-TAG(5′-CCGTCGACTACTTTTTGACGGAACTATTCC-3′；序列号47)。通过PCR扩增的编码多种NtmybA2 C端截短突变体的DNA片段经SalI切割后，以有义方向插入pEXP35S经SalI切割所产生的位点处，从而构建(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)。
(iv)为pEXP-NtmybA2经EcoRI切割、去除切出的DNA后、进行自我连接而构建的。另外，与(i)～(vi)的质粒基本上功能同等的质粒可如下构建。
(vii)pP35S-NtmybA2T1(第705位氨基酸至C末端删除)(viii)pP35S-NtmybA2T2(第631位氨基酸至C末端删除)(ix)pP35S-NtmybA2T3(第569位氨基酸至C末端删除)(x)pP35S-NtmybA2ΔEcoRI(第413位の氨基酸至C末端删除)(xi)pP35S-NtmybA2T4(第243位氨基酸至C末端删除)
(xii)pP35S-NtmybA2T5(第188位氨基酸至C末端删除)(vii)、(viii)、(ix)、(xi)、(xii)的质粒为以pP35S-NtmybA2为模板，通过PCR制备经截短的DNA片段。
PCR所用的引物为引物35S0(5′-TATCCTTCGCAAGACCCTTC-3′；序列号48)和(vii)的引物A2-T1-TAG(5′-CCGTCGACTATGCAGCCTCGTCAAACATAA-3′；序列号43)、(viii)的引物A2-T2-TAG(5′-CCGTCGACTACCACAGCCTAAATGGAGTA-3′；序列号44)、(ix)的引物A2-T3-TAG(5′-CCGTCGACTATATGCTCGAATTTTCGTTCAC-3′；序列号45)、(xi)的引物A2-T4-TAG(5′-CCGTCGACTAGCATTCTGAAGCTTCCTCC-3′；序列号46)、(xii)的引物A2-T5-TAG(5′-CCGTCGACTACTTTTTGACGGAACTATTCC-3′；序列号47)。通过PCR扩增的编码多种NtmybA2C端截短突变体的DNA片段经SalI切割后，以有义方向插入pP35S经SalI切割而产生的位点处，从而构建(vii)、(viii)、(ix)、(xi)、(xii)。(x)为pP35S-NtmybA2经EcoRI部分切割后，使用克列诺片段将突出末端钝端化，然后进行自我连接而构建的。
NACK1启动子-LUC质粒的构建将pDO432质粒(Nishiuchi等，Plant Mol.Biol.，29599(1995))经HindIII和SacI切割所产生的DNA片段插入pBI221(Clontech公司生产)经HindIII和SacI切割而除去含有CaMV 35S启动子区的DNA片段后的位点处，从而构建pUC-LUC。NACK1启动子区通过使用常规方法自烟草培养细胞BY-2制备基因组DNA，以此为模板，使用PCR制备。PCR反应所用引物为NAK1P-3(5′-CCGGATCCTCTAGATTTGCGCCTGAGATCTGAG-3′；序列号58)及NAK1P-5(5′-CCAAGCTTCATAAGCCGATAGAATTCACC-3′；序列号59)。所扩增的NACK1启动子区用BamHI和HindIII切割后插入pUC-LUC经BamHI和HindIII切割所产生的位点处，从而构建NACK1启动子-LUC质粒。即NACK1启动子-LUC质粒为通过在两个位置处含有作为调控序列的MSA序列的NACK1启动子表达LUC的质粒。
(2)C端区截短的NtmybA2蛋白在转录活化功能方面的变化通过实施例3(2)所述的方法向BY-2原生质体导入质粒。使用的效应子质粒为上述(1)的(i)至(vi)的表达NtmybA2截短突变体的质粒、以及表达全长NtmybA2的质粒pEXP-NtmybA2、表达GUS的质粒pEXP-GUS。使用NACK1启动子-LUC质粒作为报告质粒。报告基因的转录活化测定为LUC活性。LUC及R-LUC活性的测定方法如实施例3所述进行。使用R-LUC活性对LUC活性标准化所产生的值称为LUC比活性。
将pEXP-GUS为效应子质粒的LUC比活性设定为1时，观察到pEXP-NtmybA2为约4倍的LUC比活性。观察到使用(i)～(iii)的质粒，pEXP-NtmybA2的LUC比活性提高，特别是观察到使用(ii)的质粒，提高了约45倍的LUC比活性。导入(iv)的质粒时，与(iii)比较，LUC比活性下降至与pEXP-NtmybA2相同的程度。(v)、(vi)的情况下，自pEXP-NtmybA2的LUC活性也下降。由以上结果可见，NtmybA2蛋白第631位氨基酸至C末端侧的结构域为NtmybA2的转录活化功能负调控结构域，第413至630位氨基酸序列具有促进转录活化功能的结构域的功能。另外，显示第569位氨基酸至C末端侧，特别是第631位至C末端序列的删除使得NtmybA2的转录活化功能显著提高，另外显示第188位至C末端的氨基酸删除以及第243位至C末端的氨基酸删除使得NtmybA2的转录活化功能下降(图5)。
实施例7NtmybA2T5对于NtmybA2或NtmybB的显性失活效果在实施例6中使用NtmybA2蛋白第1～242位氨基酸的NtmybA2T4、使用NtmybA2蛋白第1～187位氨基酸的NtmybA2T5与使用全长NtmybA2相比转录活化功能下降。这显示转录活化功能力下降或消失的NtmybA2T4或NtmybA2T5与靶启动子MSA序列的结合阻碍了内源NtmybA1、NtmybA2或NtmybB与MSA序列的结合，导致显性失活功能。为了更明确表明NtmybA2T5的显性失活功能，将NtmybA2与NtmybA2T5及NtmybB与NtmybA2T5共表达，定量CYM启动子的转录活化。
向根据实施例3(2)所述方法制备的BY-2原生质体除了导入NACK1启动子LUC质粒(10μg/样本)、R-LUC质粒(1μg/样本)外，还导入pEXP-NtmybA2(10μg/样本)+pEXP-NtmybA2T5(10μg/样本)或pEXP-NtmybA2(10μg/样本)+pEXP-GUS(10μg/样本)，如实施例3(4)所述方法测定LUC活性、R-LUC活性。质粒的导入重复5次进行。使用R-LUC活性标准化LUC活性所得的LUC比活性在pEXP-NtmybA2+pEXP-NtmybA2T5的组合中较pEXP-NtmybA2+pEXP-GUS的组合下降。该结果表明NtmybA2T5对于NtmybA2具有显性失活功能。
另外，除了导入NACK1启动子LUC质粒(10μg/样本)、R-LUC质粒(1μg/样本)外，还导入pEXP-NtmybB(10μg/样本)+pEXP-NtmybA2T5(10μg/样本)或pEXP-NtmybB(10μg/样本)+pEXP-GUS(10μg/样本)，按照实施例3(4)所述方法测定LUC活性、R-LUC活性。使用R-LUC活性标准化LUC活性所得的LUC比活性在pEXP-NtmybB+pEXP-NtmybA2T5的组合较pEXP-NtmybB+pEXP-GUS的组合提高。该结果表明NtmybA2T5对于NtmybB具有显性失活功能(图6)。
实施例8NtmybA2、NtmybA2T2及NtmybB转化拟南芥后生长和发育的改变制备了稳定表达在CaMV 35S启动子控制下的转录活化型NtmybA2、使NtmybA2的转录活化功能显著上升的变体NtmybA2T2、转录抑制型NtmybB的经转化拟南芥，比较了其生长和发育。
(1)转化用质粒的构建将pEXP-NtmybA2T2经KpnI切割后，用克列诺片段将突出末端钝端化，然后使用XhoI切割，所产生的DNA片段插入国际申请号PCT/JP02/12268所述的pBI-RHL经SalI和SmaI切割所产生的位点处，从而构建pBIHm-NtmybA2T2。pBIHm-NtmybA2T2经SalI切割，切出的含有NtmybA2T2的DNA片段除去后产生的位点处插入pEXP-NtmybB或pEXP-NtmybA2经SalI切割产生的DNA片段，从而构建pBIHm-NtmybB、pBIHm-NtmybA2。质粒pTH2(Chiu等，Curr Biol 1996年3月1日；6(3)325-30)经NotI切割，使用克列诺片段将突出末端钝端化后，经SalI切割，所产生的含有sGFP的DNA片段插入pBIHm-NtmybA2T2经SalI和SmaI切割并除去含有NtmybA2T2的DNA片段后所产生的位点处，从而构建pBIHm-GFP。
即上述(i)pBIHm-NtmybA2T2、(ii)pBIHm-NtmybB、(iii)pBIHm-NtmybA2及(iv)pBIHm-GFP为通过CaMV 35S启动子分别表达NtmybA2T2、NtmybB、NtmybA2、sGFP的质粒载体，为可通过农杆菌法进行植物转化的双元载体。使用这些质粒转化的植物可通过潮霉素选择转化体。
与前述(i)至(iv)基本上功能同等的质粒可如下所述构建。将pP35S-NtmybA2T2经SacI和ApaI切割后用克列诺片段使突出末端钝端化所产生的DNA片段插入国际申请号PCT/JP02/12268所述的pBI-RHL经SalI切割并用克列诺片段使突出末端钝端化而产生的位点处，从而构建pBIHm35S-NtmybA2T2。pBIHm35S-NtmybA2T2经SalI切割，在除去切出的含有NtmybA2T2的DNA片段后所产生的位点处插入pP35S-NtmybB或pP35S-NtmybA2经SalI切割后产生的DNA片段，从而构建pBIHm35S-NtmybB、pBIHm35S-NtmybA2。将质粒pTH2(Chiu等，CurrBiol 1996年3月1日；6(3)325-30)经NotI和SalI切割并用克列诺片段使突出末端钝端化所产生的含有sGFP的DNA片段插入pBIHm35S-NtmybA2T2经SalI切割后用克列诺片段使突出末端钝端化并除去含有NtmybA2T2的DNA片段所产生的位点处，从而构建pBIHm35S-GFP。
即上述(v)pBIHm35S-NtmybA2T2、(vi)pBIHm35S-NtmybB、(vii)pBIHm35S-NtmybA2及(viii)pBIHm35S-GFP为通过CaMV 35S启动子分别表达NtmybA2T2、NtmybB、NtmybA2、sGFP的质粒载体，为可通过农杆菌法转化植物的双元载体。使用这些质粒转化的植物可通过潮霉素选择转化体。
(2)拟南芥的转化使用上述(1)所构建的(i)～(iv)双元载体转化根癌农杆菌EHA101株，将维持有这些质粒的农杆菌使用花器浸蘸法(Floral dip)(Clough等(1998)Plant J.16735)转化拟南芥生态型Col-0。自农杆菌感染的花芽获得的种子用次氯酸和无菌水灭菌，然后播种于含潮霉素25μg/ml、羧苄青霉素100μg/ml的MS培养基上。选择可在添加有潮霉素的培养基上生长和发育的经转化植物。
(3)NtmybA2、NtmybA2T2及NtmybB转化的拟南芥中生长和发育的改变所选择的经转化植物移入矩形2号シヤ一レ(栄研化学公司生产)中的固化MS培养基(MS无机盐、30％蔗糖、0.4％吉兰糖胶)，垂直静置，并于16小时照明、8小时黑暗，21℃的条件下培养。播种后第25天测定主根的长度。使用pBIHm-GFP转化的对照组，主根长度为31mm～35mm的经转化株最多，而使用pBIHm-NtmybA2、pBIHm-NtmybA2T2、pBIHm-NtmybB转化的经转化植物，主根长度为21mm～25mm的经转化株分布最多，从而制备出生长和发育受到抑制的植物。以上结果表明稳定表达NtmybA2、NtmybB、NtmybA2T2的经转化拟南芥的生长和发育受到改变。
实施例9NtmybA2T2及NtmybA2T5的经转化拟南芥生长和发育的改变制备了显性失活型NtmybA2T5在CaMV 35S启动子控制下稳定表达的经转化拟南芥，并比较其生长和发育。
制备了NtmybA2的转录活化功能显著提高的变体NtmybA2T2在细胞周期蛋白B(CYM)启动子控制下表达的经转化拟南芥，并比较其生长和发育。
(1)转化用质粒的构建
pDBIHm-NtmybA2T5质粒的构建pUC19(Takara公司生产)经SmaI切割的位点处插入Invitrogen公司市售的Reading Frame A的DNA片段，产生pUC-RFA。国际申请号PCT/JP02/12268所述的质粒pBI-RHL经BamHI和SpeI切割的位点处插入pUC-RFA经BamHI和SpeI切割所切出的Reading Frame A，从而构建pDESTBI-1。
质粒pENTR2B(Invitrogen公司生产)经KpnI和XhoI切割所产生的位点处插入pEXP-NtmybA2T5经KpnI和XhoI所切出的DNA片段，从而构建pENTR-NtmybA2T5。pDESTBI-1和pENTR-NtmybA2T5混合，使用Gateway LR Clonase mix(Invitrogen公司生产)通过位点特异的重组反应构建pDBIHm-NtmybA2T5。使用Gateway LR Clonase mix的反应按照该试剂所提供的方法实施。pDBIHm-NtmybA2T5为通过CaMV 35S启动子表达NtmybA2T5的质粒载体，为可通过农杆菌法转化植物的双元载体。使用这些质粒转化的植物可通过潮霉素选择转化体。
与pDBIHm-NtmybA2T5基本上功能同等的质粒可如下构建。质粒pP35S-NtmybA2T5经SacII和ApaI切割后用克列诺片段将突出末端钝端化。切出的DNA片段插入pENTR2B(Invitrogen公司生产)经KpnI和XhoI切割后用克列诺片段将突出末端钝端化而产生的位点处，从而构建pENTR35S-NtmybA2T5。pDESTBI-1和pENTR35S-NtmybA2T5混合，使用Gateway LR Clonase mix(Invitrogen公司生产)通过位点特异的重组反应构建pDBIHm35S-NtmybA2T5。使用Gateway LR Clonase mix的反应按照该试剂所提供的方法实施。pDBIHm35S-NtmybA2T5为通过CaMV35S启动子表达NtmybA2T5的质粒载体，为可通过农杆菌法转化植物的双元载体。使用这些质粒转化的植物可通过潮霉素选择转化体。
pPCYM-NtmybA2T2质粒的构建使用根据常规方法自长春花制备的基因组DNA为模板，通过PCR制备CYM启动子区。PCR反应所用引物为CYM3Pst(5′-AACTGCAGTCTTCAATAGAATTTCTTCCAG-3′；序列号60)及CYM5-1(5′-CCAAGCTTACCCATAAATTGTTGGTAAA-3′；序列号57)。经扩增的CYM启动子区用PstI和HindIII切割后，插入pPZP211(Hajdukiewicz等，Plant Mol.Biol.25989(1994))经PstI和HindIII切割后所产生的位点处，从而构建pPZP211-CYM质粒。将pEXP-NtmybA2T2经SalI切割所切出的片段插入pPZP211-CYM经SalI切割所产生的位点处，从而构建pPCYM-NtmybA2T2。pPCYM-NtmybA2T2为通过CYM启动子表达NtmybA2T2的质粒载体，为可通过农杆菌法转化植物的双元载体。使用这些质粒转化的植物可通过潮霉素选择转化体。pPCYM-NtmybA2T2质粒可如下构建。pP35SNtmybA2T2经SalI切割所切出的DNA片段插入pPZP211-CYM经SalI切割所产生的位点处而构建。
(2)拟南芥的转化使用上述(1)所构建的pDBIHm-NtmybA2T5、pPCYM-NtmybA2T2及对照pBIHm-GFP，根据实施例5所示的方法转化拟南芥生态型Col-0，选择经转化植物。对经pDBIHm-NtmybA2T5及pBIHm-GFP所转化植物的选择在含有潮霉素25μg/ml、羧苄青霉素100μg/ml的MS培养基上进行，对经pPCYM-NtmybA2T2所转化植物的选择在含有卡那霉素50μg/ml、羧苄青霉素100μg/ml的MS培养基上进行，选择可生长和发育的经转化植物。将经转化品系移植至蛭石和泥炭藓1∶1混合的土中，适应后，于16小时照明、8小时黑暗、21℃的条件下栽培。这些品系分别自交以提供第一子代的种子进行分析。
(3)NtmybA2变体对拟南芥生长和发育速度的改变经转化获得的植物自交所产生的第一子代的种子使用次氯酸和无菌水灭菌，播种于矩形2号シヤ一レ(栄研化学公司生产)中的固化MS培养基(MS无机盐、30％蔗糖、0.4％吉兰糖胶)，4℃暗处4天进行春化处理。春化处理后垂直静置，并于16小时照明、8小时黑暗，21℃的条件下培养。春化处理后第3天测定主根的长度。
pDBIHm-NtmybA2T5或pPCYM-NtmybA2T2所转化的品系使用复数品系，与使用对照pBIHm-GFP转化的品系相比较，观察生长和发育受到抑制的表现型。
实施例10通过抑制NtmybA1和NtmybA2的表达而抑制植物体的生长和发育使用病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene silencing；VIGS)作为抑制内源基因表达的方法，观察了NtmybA1和NtmybA2的表达受到抑制的植物的表现型。VIGS所用的LgJ、LGFPJ质粒由东京大学大学院综合文化研究科广域科学专业生命环境科学系渡边雄一郎助教授惠赠。LgJ为插入了编码源自植物RNA病毒-番茄花叶病毒(ToMV)的经改变病毒的DNA的质粒。ToMV的改变包括在编码复制酶的结构域中导入了氨基酸替换，使病毒的增殖量下降从而减轻病征；导入新的启动子序列使得可表达外源DNA；在外源DNA表达用启动子的下游插入Gateway system的识别序列，以允许使用Invitrogen公司市售的LR进行反应可插入外源DNA。通过LgJ质粒的体外RNA转录获得对植物具有感染性的重组病毒RNA。该重组病毒一旦感染植物，源自外源DNA的双链RNA以复制中间体在植物内表达。当使用的外源DNA为来自受感染植物的DNA时，对应植物的内源基因表达受到抑制。LGFPJ为在LgJ中插入编码GFP的DNA，可通过GFP的表达确认病毒的感染。
(1)质粒的构建LA1A2J的构建以pGEMe-OH53i6为模板，使用引物VA1-F(5′-ATAGTTCTGTTAAAAAGAAACTG-3′；序列号37)和引物VA1-R(5′-TAACATTGAACAAGAAACATCTTG-3′；序列号38)进行PCR，扩增含有部分NtmybA1 cDNA的DNA片段。以OH60为模板，使用引物VA2-F(5′-ACAAAGTCTTCTCTAACTACG-3′；序列号39)和引物VA2-R(5′-AGCTTCGAGTCGTCTAGCG-3′；序列号40)进行PCR，扩增含有部分NtmybA2cDNA的DNA片段。这些PCR反应使用Pyrobest(Takara公司生产)进行。将这些DNA片段插入pBluescript(Stratagene公司生产)经EcoRV切割所产生的位点处，从而构建pBS-VA1及pBS-VA2。PBS-VA2经SmaI和SalI切割，所切出的DNA片段插入pBS-VA1经HindIII切割、使用克列诺片段钝端化并用SalI切割所产生的位点处，从而构建pBS-VA1A2。以pBS-VA1A2为模板，使用引物B1T3(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATTAACCCTCACTAAAGGG-3′；序列号41)和引物B2T7(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；序列号42)进行PCR，获得了在串联连接的含有部分NtmybA1的DNA片段及部分NtmybA2的DNA片段两末端添加有Gateway system(Invitrogen公司)的attB1、attB2序列的DNA片段。所述DNA片段与质粒pDONR201(Invitrogen公司)混合，使用BPClonase(Invitrogen公司)进行BP反应，获得pDONOR-VA1A2。pDONR-VA1A2与LgJ混合，进行LR Clonase(Invitrogen公司)反应，获得LA1A2J。使用BP Clonase及LR Clonase的反应根据试剂提供的说明书进行。
LA1A2J 5μg用MluI切割，使质粒直链化。酚/氯仿处理后、乙醇沉淀、并再溶解于10μl的无菌水。以经直链化的LA1A2J为模板进行体外转录。即将5μl 10xT7缓冲液(Roche公司生产，随T7 RNA聚合酶提供)、2.5μl0.1M DTT、1μl Rnase抑制剂(Roche公司生产、40单位/μl)、5μl A/C/U/G混合物(ATP、CTP、UTP分别为20mM，GTP为2mM)、2.5μl 5mMm7G[5′]ppp[5′]G(CAP，Roche公司生产)、14μl无菌水、10μl直链化LA1A2J混合，于37℃孵育5分钟。加入10μl T7RNA聚合酶(20单位/μl，Roche公司生产)后，37℃再孵育25分钟。此后加入5μl 20mM GTP，于37℃孵育35分钟。反应结束后取2μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认RNA已被转录。
将LA1A2J RNA接种本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)。本塞姆氏烟草25℃栽培，4～5叶期的上端2叶薄薄地喷洒金刚砂，并且每片叶接种5μl LA1A2J RNA。接种后5分钟内用无菌水洗净接种叶。进行5个个体的接种，接种后于23℃栽培。作为对照的LGFPJ也与LA1A2J同样进行体外转录和LGFPJ RNA的接种。
(2)NtmybA1和NtmybA2的表达受到抑制的植物的生长和发育抑制NtmybA1及NtmybA2 mRNA表达量通过RT-PCR确证LA1A2J和LGFPJ所感染植物的NtmybA1及NtmybA2的mRNA表达量通过RT-PCR确认。自植株高度受到抑制的LA1A2J RNA接种植物以及自LGFPJ RNA接种植物的茎顶部分使用RNeasy plant mini kit(QIAGEN公司)提取总RNA。以总RNA为模板，使用RT-PCR的Superscript第一链合成体系(Invitrogen 公司)合成cDNA。所得到的cDNA为模板，对于NtmybA1及NtmybA2的检测，使用引物A2-583F(5′-GTACAATGCTTGCACCGGTGG-3′；序列号33)和引物A2-1089R(5′-TGTAGACTGGGAACAGCCAGC-3′；序列号34)。对于cDNA量的标准化，使用EF1αmRNA的表达量，使用引物EFF(5′-AGACCACCAAGTACTACTGC-3′；序列号35)和引物EF R(5′-GTCAAGAGCCTCAAGGAGAG-3′；序列号36)。自合成的cDNA 50μl中取出1μl进行PCR反应，可分析所用cDNA量的标准化和NtmybA1、NtmybA2的表达量。
当接种LA1A2J RNA，从而内源NtmybA1及NtmybA2的mRNA表达量受到抑制的本塞姆氏烟草植物体，与接种LGFPJ RNA的对照比较时，生长和发育受到极大抑制。
通过以上描述可见使内源NtmybA1及NtmybA2的表达量降低可抑制植物体的生长和发育。
(3)NtmybA1和NtmybA2的表达受到抑制的植物中对细胞质分裂的抑制、M期进行的抑制观察上述(2)的内源NtmybA1及NtmybA2表达受到抑制的烟草植物个体的叶中表皮细胞、气孔孔道细胞。
使用镊子自叶的下表面剥取表皮细胞，用含有1％地衣红的乳酸和丙酸的等量混合物进行核染色。使用微分干涉相差显微镜观察细胞时，观察到了具有多个核的多核化细胞。另外，观察到多核化细胞中存在的核有大核或小核。多核化细胞表明核分裂进行而细胞质分裂受阻，而存在大小不同的核表明由于发生了异常的核分裂及M期越过(skipping)而使核内染色体倍数化。即显示了NtmybA1及NtmybA2的表达受到抑制的细胞中，M期的进入、进行、终止的步骤受到影响。通过以上表明NtmybA1及NtmybA2为M期正常进行所必须的基因。
(4)NtmybA1和NtmybA2的表达受到抑制的植物中细胞周期的变化测定了上述(2)的内源NtmybA1及NtmybA2的表达受到抑制的烟草植物个体的叶中核内DNA的含量。自经接种叶取3片上位叶，シヤ一レ中加入Cystain UV Precise P(高分辨DNA染色试剂盒，Pratec公司生产)中的1ml核提取缓冲液，用剃刀刃细碎1分钟。室温放置10分钟后，使用Partec Cell Trics一次性滤器(50μm筛孔，Pratec公司生产)过滤，向滤液中加入Cystain UV Precise P(高分辨DNA染色试剂盒，Pratec公司生产)中的2ml染色缓冲液。使用Ploidy Analyser PA(Pratec公司生产)进行测定。
自内源NtmybA1及NtmybA2的表达受到抑制的烟草植物个体的叶制备的核与对照比较，代表S期、G2期的4C峰增大，并且也观察到了在对照中未观察到的代表倍数化核的8C峰。4C峰增大表明S期、G2期的进行延长或向M期进入的延迟。另外，倍数化8C峰的存在表明向M期的进入受阻或M期的越过。由此可见NtmybA1及NtmybA2为M期正常进行所必须的基因，抑制这些基因表达可改变细胞周期。
实施例11Ntmyb的表达受到抑制的经转化烟草培养细胞BY2的增殖速率的改变(1)NtmybA1、NtmybA2、NtmybB RNAi用质粒的构建pEXP35S经KpnI切割，使用T4 DNA聚合酶将突出末端钝端化后，将EcoRV切割所切出的DNA片段插入pPZP211经EcoRI和HindIII切割并经克列诺片段将突出末端钝端化所产生的位点处，从而构建pPZP211-35S。
以pBI121(Clontech公司生产)为模板，使用序列号61(5′-GGAATTCGTGTGATATCTACCCGCTTCG-3′；序列号61)和序列号62(5′-CGGGATCCGTTTTTCACCGAAGTTCATGC-3′；序列号62)所示引物进行PCR，扩增含有GUS ORF的DNA片段。该DNA片段经EcoRI和BamHI切割后插入pBluescriptII(SK+，Stratagene公司生产)经EcoRI和BamHI切割后所产生的位点处，从而构建pGUS1.0。
以OH60为模板，使用引物A2ia3(5′-TTGAATTCCAAGTCTTGGGCTTGACAGAAGAG-3′；序列号63)和引物 A2ia5(5′-TTCTCGAGAAGCTTCGTCAAGAATCATTCTCTGATCTG-3′；序列号64)进行PCR反应，将所获得的编码部分NtmybA2的DNA片段经EcoRI和XhoI切割。该DNA片段插入pGUS1.0经EcoRI和XhoI切割所产生的位点处，从而构建pGUS-A2.RNAi-a。
以OH60为模板，使用引物A2ib3(5′-TTGGATCCAAGTCTTGGGCTTGACAGAAGAG-3′；序列号65)和引物A2ib5(5′-CCTCTAGACTAGTGTCGACCGTCAAGAATCATTCTCTGATCTG-3′；序列号66)进行PCR反应，将所获得的编码部分NtmybA2的DNA片段经BamHI和XbaI切割。该DNA片段插入pGUS-A2.RNAi-a经BamHI和XbaI切割所产生的位点处，从而构建pGUS-A2.RNAi。
以OH88为模板，使用引物Bia3(5′-TTGAATTCTTGTTGCCTGATAAGGTCGTCTC-3′；序列号67)和引物Bia5(5′-TTCTCGAGAAGCTTGAATTTGCCTAGTAGGTTAGTGC-3′；序列号68)进行PCR反应，将所获得的编码部分NtmybB的DNA片段经EcoRI和XhoI切割。该DNA片段插入pGUS1.0经EcoRI和XhoI切割所产生的位点处，从而构建pGUS-B.RNAi-a。
以OH88为模板，使用引物Bib3(5′-TTGGATCCTTGTTGCCTGATAAGGTCGTCTC-3′；序列号69)和引物Bib5(5′-CCTCTAGACTAGTGTCGACGAATTTGCCTAGTAGGTTAGTGC-3′；序列号70)进行PCR反应，将所获得的编码部分NtmybB的DNA片段经BamHI和XbaI切割。该DNA片段插入pGUS-B.RNAi-a经BamHI和XbaI切割所产生的位点处，从而构建pGUS-B.RNAi。
将pGUS-A2.RNAi经HindIII切割所切出的DNA片段插入pPZP211-35S经HindIII切割所产生的位点处，从而构建pPZP211-35S:A2RNAi。
将pGUS-B.RNAi经HindIII和SalI切割所切出的DNA片段插入pPZP211-35S经HindIII和SalI切割所产生的位点处，从而构建pPZP211-35S:B:RNAi。
pPZ P211-35S:A2RNAi及pPZP211-35S:B:RNAi为通过CaMV 35S启动子反向重复表达NtmybA2的部分序列或NtmybB的部分序列并在植物体内NtmybA2的部分序列或NtmybB的部分序列为双链RNA形式的质粒载体，为可通过农杆菌法进行植物转化的双元载体。这些质粒所转化的植物可使用卡那霉素进行转化体的选择。
这些质粒所转化的烟草植物体或烟草培养细胞中，表达的双链RNA对NtmybA2或NtmybB可产生RNAi作用。
与pPZP211-35S:A2RNAi及pPZP211-35S:B:RNAi基本上功能同等的质粒可如下构建。pP35S经SacII和KpnI切割并用T4 DNA聚合酶将突出末端钝端化后，将切出的DNA片段插入pPZP211经EcoRI和HindIII切割并用克列诺片段使突出末端钝端化后所产生的位点处，从而构建pPZP211-P35S。pGUS-A2.RNAi经HindIII切割所切出的DNA片段插入pPZP211-P35S经HindIII切割所产生的位点处，从而构建pPZP211-P35S:A2RNAi。pGUS-B.RNAi经HindIII和SalI切割所切出的DNA片段插入pPZP211-P35S经HindIII和SalI切割所产生的位点处，从而构建pPZP211-P35S:B:RNAi。pPZP211-P35S:A2RNAi及pPZP211-P35S:B:RNAi为通过CaMV 35S启动子反向重复表达NtmybA2的部分序列或NtmybB的部分序列并在植物体内NtmybA2的部分序列或NtmybB的部分序列为双链RNA形式的质粒载体，为可通过农杆菌法进行植物转化的双元载体。这些质粒所转化的植物可使用卡那霉素进行转化体的选择。
(2)烟草培养细胞BY2的转化为了确定抑制NtmybA2及NtmybB表达对细胞增殖的影响，通过具有pPZP211-35S:A2RNAi、pPZP211-35S:B:RNAi或载体对照pPZP211的根癌农杆菌LBA4404株实施烟草培养细胞BY2的转化。移入新鲜的LSD液体培养基并将培养3天的烟草培养细胞BY-2与在YEB培养基中培养2天的具有pPZP211-35S:A2RNAi、pPZP211-35S:B:RNAi或载体对照pPZP211的根癌农杆菌LBA4404株的培养物混合，25℃、黑暗下共培养。二日后烟草培养细胞BY2使用LSD液体培养基洗，然后将细胞播种于含有卡那霉素200μg/ml和羧苄青霉素300μg/mL的LSD-0.2％脱乙酰吉兰糖胶培养基，25℃黑暗下进行培养。22日后通过RT-PCR鉴定所得到的卡那霉素耐性愈伤组织中NtmybA2及NtmybB的表达量。自这些愈伤组织中使用Invitrogen Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA。以总RNA为模板，使用RT-PCR的Superscript第一链合成体系(Invitrogen公司)合成cDNA。以所获得的cDNA为模板，对于检测NtmybA2 cDNA的扩增，使用引物OH60DB1(5′-CCGGATCCTTCCAGTTCAGCACCATGCTCTG-3′；序列号73)和引物OH60DS6(5′-CCGTCGACCTAAGAGATCTGATAGTTCGATG-3′；序列号74)。对于检测NtmybB cDNA的扩增，使用引物OH88Bam5(5′-CCGGATCCTTCCTCAGTAAAGAAAAGATTGAACTTG-3′；序列号71)和引物OH88DS2(5′-CCGTCGACTTAACAGTTAGGATCATTAACAG-3′；序列号72)。所合成的cDNA 50μl中取1μl进行PCR反应。反应使用Ex taq(Takara公司)、随Ex taq提供的反应缓冲液、各200μM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、每种引物各1μM，以总体积为50μl的液量进行反应。对NtmybB的检测进行了27个93℃ 30秒、56℃ 1分钟、73℃ 2分钟步骤的循环，对NtmybA2的检测进行了26个93℃ 30秒、56℃ 1分钟、73℃ 2分钟步骤的循环重复。这些PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明经pPZP211-35S:A2RNAi转化得到的愈伤组织中，与载体对照pPZP211转化的愈伤组织相比较，NtmybA2的表达量下降；经pPZP211-35S:B.RNAi转化得到的愈伤组织与载体对照，NtmybB的表达量下降。
(3)NtmybA2的表达量受到抑制的经转化BY2细胞中细胞增殖速率的变化前述的经pPZP211-35S:A2RNAi转化且NtmybA2mRNA的表达量受到抑制的愈伤组织的大小与载体对照比较，显示愈伤组织的大小变小(图7)。
为了研究构成这些愈伤组织的细胞的细胞周期，测定了核内DNA含量。方法为向每一冻结保存的愈伤组织加入Cystain UV Precise P(高分辨DNA染色试剂盒，Pratec公司生产)中的1ml核酸提取缓冲液，溶解后混合。室温10分钟后，使用Partec Cell Trics一次性滤器(50μm筛孔，Pratec公司生产)过滤，向滤液中加入Cystain UV Precise P(高分辨DNA染色试剂盒，Pratec公司生产)中的染色缓冲液2ml。使用Ploidy Analyser PA(Pratec公司生产)进行测定。
与载体对照比较，发现NtmybA2 mRNA的表达受到抑制的经pPZP211-35S:A2RNAi转化的愈伤组织中S期、G2期的染色体显示出4C峰增大，而且观察到了在载体对照中未观察到的显示染色体倍数化核的8C峰(图8)。4C增大表明在抑制NtmybA2表达的细胞中由于向M期的进入难以发生，导致S期、G2期的期间延长。另外，8C的存在表明由于存在向M期进入的阻碍且M期越过而引起染色体倍数化。这些结果表明细胞周期延长，且细胞增殖受到抑制，从而形成了小的愈伤组织。
(4)NtmybB的表达量受到抑制的经转化BY2细胞中细胞增殖速率的变化前述的经pPZP211-35S:BRNAi转化，使NtmybB mRNA的表达量受到抑制的愈伤组织的大小与载体对照比较，表明愈伤组织的大小变大(图9)。
为了研究构成这些愈伤组织的细胞的细胞周期，测定了核内DNA含量。实施与前述(4)同样的方法。
与载体对照比较时，在抑制NtmybB表达的经pPZP211-35S:BRNAi转化的愈伤组织中显示S期、G2期染色体的4C峰降低(
图10)。4C的降低表明S期、G2期缩短，即向M期的进入加快。这表明由于抑制NtmybB表达使得向M期进入所必需的基因的表达加快或表达量提高，从而促进向M期的进入，结果导致细胞周期的缩短、细胞增殖的促进以及形成大的愈伤组织。
实施例12稳定表达NtmybA2及NtmybA2T2的经转化烟草培养细胞BY2中细胞增殖速率的改变(1)稳定表达NtmybA2及NtmybA2T2的质粒的构建将OH60经SalI切割所得到的DNA片段插入pPZP211-35S经SalI切割而产生的位点处，从而构建pPZP211-35S:A2。
将pEXP-NtmybA2T2经SalI切割所得到的DNA片段插入pPZP211-35S经SalI切割而产生的位点处，从而构建pPZP211-35S:A2T2。
即pPZP211-35S:A2及pPZP211-35S:A2T2为通过CaMV 35S启动子分别表达NtmybA2和NtmybA2T2的质粒载体，为可通过农杆菌法进行植物转化的双元载体。经这些质粒转化的植物可使用卡那霉素选择转化体。
与pPZP211-35S:A2T2基本上具有相同功能的质粒可如下构建。pP35S-NtmybA2T2或OH60经SalI切割所得到的DNA片段插入pPZP211-P35S经SalI切割而产生的位点处，从而构建pPZP211-P35S:A2T2及pPZP211-P35S:A2。
(2)烟草培养细胞BY2的转化为了确定NtmybA2及NtmybA2T2的稳定表达对细胞增殖的影响，通过使用具有pPZP211-35S:A2、pPZP211-35S:A2T2或载体对照pZP211的根癌农杆菌LBA4404株进行烟草培养细胞BY2的转化。BY2细胞的转化如实施例11(2)所述方法实施。22天后获得的卡那霉素耐性愈伤组织中NtmybA2及NtmybA2T2的mRNA表达量通过RT-PCR确定。自这些愈伤组织中，使用Invitrogen Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA。以总RNA为模板，使用RT-PCR的Superscript第一链合成体系(Invitrogen公司)合成cDNA。以获得的cDNA为模板，对于NtmybA2及NtmybA2T2的检测，使用引物OH60DB1(5′-CCGGATCCTTCCAGTTCAGCACCATGCTCTG-3′；序列号73)和引物OH60DS6(5′-CCGTCGACCTAAGAGATCTGATAGTTCGATG-3′；序列号74)。所合成cDNA 50μl中取1μl进行PCR反应。反应使用Extaq(Takara公司)、随Ex taq提供的反应缓冲液、各200μM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、每一引物各1μM，以50μl的液量进行。93℃ 30秒、56℃ 1分钟、73℃ 1分钟的步骤进行24个循环的重复。使用琼脂糖凝胶电泳分析这些PCR产物，结果表明与载体对照相比较，在pPZP211-35S:A2转化获得的愈伤组织中NtmybA2的表达量提高，在pPZP211-35S:A2T2转化获得的愈伤组织中确认了NtmybA2T2的表达。
(3)稳定表达NtmybA2及NtmybA2变体的经转化BY-2细胞中细胞增殖速率的变化前述的经pPZP211-35S:A2或pPZP211-35S:A2T2转化并确认了NtmybA2或NtmybA2T2 mRNA表达的愈伤组织的大小与载体对照相比较时，显示出愈伤组织的大小变小(
图11)。
为了研究构成这些愈伤组织的细胞的细胞周期，测定了核内DNA含量。实施前述实施例11(3)同样的方法。
与载体对照相比较时，稳定表达NtmybA2的愈伤组织中代表S期、G2期染色体的4C峰降低。这个倾向也在稳定表达使NtmybA2的转录活化功能提高的变体NtmybA2T2的愈伤组织中观察到(
图13)。
另外，这些经转化细胞的显微镜观察结果表明由于没有观察到多核化细胞，所检测出的核的数目代表细胞数。对载体对照、NtmybA2转化的愈伤组织和NtmybA2T2转化的愈伤组织比较所获得的细胞数，结果表明与愈伤组织的大小相关，NtmybA2转化的愈伤组织中细胞数降低，并进一步表明NtmybA2T2转化的愈伤组织中细胞数显著降低(
图12)。
这些表明在稳定表达NtmybA2及NtmybA2变体的愈伤组织中由于加速的向M期进入、抑制的细胞增殖、降低的细胞数使得产生小的愈伤组织。
实施例13NtmybB的表达量改变的经转化烟草中生长和发育的变化(1)质粒的构建将OH88经SalI切割所产生的片段插入pPZP211经SalI切割所产生的位点处，从而构建pPZP211-35S:B。
(2)经转化烟草的制备为了制备出通过RNAi作用抑制内源NtmybB表达的经转化烟草，使用了实施例11(3)所述的pPZP211-35S:B.RNAi质粒。为了制备出稳定表达NtmybB的经转化烟草，使用了pPZP211-35S:B质粒。将分别具有pPZP211-35S:B.RNAi、pPZP211-35S:B或载体对照pPZP211的根癌农杆菌LBA4404株通过叶圆片(リ一フデイスク)法转化烟草品种SR1。
(3)经转化烟草的生长和发育变化栽培所获得的卡那霉素耐性个体，得到自殖种子。将所获得的种子经乙醇和次氯酸灭菌后，播种至含有卡那霉素50μg/mL的MS-0.2％脱乙酰吉兰糖胶培养基，于28℃连续照明的条件下进行植物的生长和发育。将栽培12天后所获得的卡那霉素耐性个体移植至土中，于28℃连续照明的条件下进行25天的植物生长和发育。
通过RT-PCR证实所获得的卡那霉素耐性个体NtmybB mRNA表达量的改变。自播种后22天的植物体(生重量0.5至0.8g)使用InvitrogenTrizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA。以总RNA为模板，使用RT-PCR的Superscript第一链合成体系(Invitrogen公司)合成cDNA。将所获得的cDNA为模板，对于NtmybB cDNA的检测，使用引物OH88Bam5(5′-CCGGATCCTTCCTCAGTAAAGAAAAGATTGAACTTG-3′；序列号71)和引物OH88DS2(5′-CCGTCGACTTAACAGTTAGGATCATTAACAG-3′；序列号72)。使用EF1α mRNA表达量对cDNA 标准化，使用了引物EFF(5′-AGACCACCAAGTACTACTGC-3′；序列号35)和引物EFR(5′-GTCAAGAGCCTCAAGGAGAG-3′；序列号36)。合成的cDNA 50μl中取出1μl进行PCR反应。反应使用Ex taq(Takara公司)、随Ex taq提供的反应缓冲液、各200μM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、每一引物各1μM，于50μl的液量进行反应。93℃ 30秒、56℃ 1分钟、73℃ 1分钟的步骤循环重复27次。EF1α的检测使用相同的步骤循环重复18次。这些PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明EF1α在所有的样本中均被等量检出，而经pPZP211-35S:B转化的#6品系与载体对照比较，证实NtmybB cDNA的扩增量变多且表达量提高。另外，经pPZP211-35S:B.RNAi转化的#2品系与载体对照比较，NtmybB cDNA的扩增基本没观察到，证实表达量下降。
稳定表达NtmybB的经转化烟草(#6)品系与载体对照比较，生长和发育受到抑制；内源NtmybB通过RNAi而受到抑制的经转化烟草(#2)与载体对照比较，生长和发育受到促进(
图14)。由于NtmybB抑制M期进行所必需基因的表达，所以认为过量表达NtmybB的经转化植物中进入M期延迟或M期的进行延长，细胞分裂的抑制和细胞周期所需的时间延长，结果产生生长和发育受到抑制的表现型。另外，与之相反，认为抑制内源NtmybB的表达使M期进行所必需基因的表达时期提前或表达量增大，从而使向M期的进入和进行被加速，细胞周期所需的时间缩短，结果产生生长和发育受到促进的表现型。
实施例14NtmybA1蛋白、NtmybA2蛋白、Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列相似性
图15～18显示了NtmybA1蛋白、NtmybA2蛋白、Os3RmybA1蛋白的氨基酸序列以最佳方式比对的比较结果。除了由3个重复组成的mybDNA结合区具有高相似性以外，在实施例6所示的负调控NtmybA2蛋白转录活化功能的结构域(631～1042位氨基酸)及促进转录活化功能的结构域(413～630位氨基酸)也显示氨基酸序列高的相似性。作为转录活化因子发挥作用的NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1在调节转录活化功能的结构域中氨基酸的相似性高，显示出具有相似的调控机制。实施例6所示的NtmybA2多种删除区的位置和与之相应的NtmybA1及Os3RmybA1蛋白的结构域如
图15～18的箭头所示。另外，作为NtmybA2的变体并显示高转录活化功能的NtmybA2T1、NtmybA2T2、NtmybA2T3的删除区与NtmybA1、Os3RmybA1观察到了特别高的氨基酸相似性，发现在这3种蛋白质中具有保守的氨基酸。即对于NtmybA2T1，显示为在删除区附近的TPSILKKRHR(序列号89)序列，对于NtmybA2T2，显示为NXXTPXRLWX(序列号90)序列，对于NtmybA2T3，显示为PPRFPSXDXPF(序列号91)的序列(X表示任一氨基酸)。对于NtmybA1或Os3RmybA1，自这些保守序列的C末端侧删除，可制备出与NtmybA2T1、NtmybA2T2、NtmybA2T3显示相似功能的变体。
实施例15拟南芥3Rmyb和NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1的氨基酸序列相似性已知在拟南芥全基因组中有100种或以上的具有myb样DNA结合区的蛋白质，已报道其myb结构域显示为不完全的3个重复序列构成的3Rmyb只有5种(Stracke等，Curr.Opin.Plant Biol.4447.(2001))。然而至今还没有明了这些3Rmyb的功能。
(1)转录活化型植物3Rmyb中氨基酸序列的相似性所报道的拟南芥3Rmyb即AtMYB3R1(GenBank登录号AAD46772、序列号75)、AtMYB3R4(GenBank登录号AAK54739、序列号76)的氨基酸序列与NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1的氨基酸序列以最佳方式比对，氨基酸序列相似性的比较结果如
图19～25所示。认为除了显示出AtMYB3R1及AtMYB3R4的氨基酸序列与NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1的氨基酸序列在myb样DNA结合区高的相似性外，在NtmybA2中对于调控转录活化功能而言重要的结构域中也具有高的相似性。特别地，观察到在相似性高的结构域中存在SILX1KRXRXLUOPJXX5X1RXX5KK(序列号94、本序列中X为任一种氨基酸、J为I、V、L中的任一种氨基酸、O为S、T中的任一种氨基酸、X1为K、R中的任一种氨基酸、U为V、L中的任一种氨基酸、X5为D、E中的任一种氨基酸)这一22个氨基酸的特征性保守序列。该保守序列显示出AtMYB3R1及AtMYB3R4与NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1相似地作为细胞周期蛋白B基因或NACK1基因的转录活化因子发挥作用。
(2)转录抑制型植物3Rmyb氨基酸序列的相似性作为拟南芥3Rmyb的AtMYB3R3(GenBank登录号AAF25950、序列号77)、AtMYB3R5(GenBank登录号AAK54740、序列号78)的氨基酸序列在myb DNA结合区以外，未观察到与所述转录活化型植物3Rmyb的氨基酸序列相似性，由此预计没有转录活性型功能。将AtMYB3R3与AtMYB3R5的氨基酸序列与NtmybB的氨基酸序列进行最佳比对，结果观察到AtMYB3R3、AtMYB3R5和NtmybB的氨基酸相似性。比较结果如图26～28所示。AtMYB3R3及AtMYB3R5的氨基酸序列与NtmybB的氨基酸序列除了显示出在myb样DNA结合区的高相似性之外，在这之外的结构域中也存在多个相似的氨基酸，进一步地观察到以myb DNA结合区的N末端侧第4个Ser为中心的SCSSXSX6(序列号95、本序列中X为任一种氨基酸、X6为K、R、D、E、H中的任一种氨基酸)由这7个氨基酸构成的特征性保守序列。在AtMYB3R1、AtMYB3R4、NtmybA1、NtmybA2、Os3RmybA1的氨基酸序列中未观察到该保守序列，表明该保守序列显示AtMYB3R3及AtMYB3R5与NtmybB同样为细胞周期蛋白B基因和NACK1基因的转录抑制因子。
(3)在植物3Rmyb家族内分类活化型、抑制型的亚家族自上述(1)、(2)明确了3Rmyb在植物myb超家族中具有结构和功能的特殊位置，为细胞周期蛋白B基因或NACK1基因转录的调节因子。另外，在3Rmyb家族内根据序列的相似性，发现可将转录活化型亚家族和转录抑制型亚家族分开。
为了最佳比对氨基酸序列，使用了CLUSTALW程序(http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-i.html)。条件设定均为缺损设置。显示CLUSTALW程序的输出结果的图中，代表氨基酸相似性、同一性的记号中“*”为完全保守的位点，“:”为高度保守的位点，“.″为中等程度保守的位点。
实施例16多种植物3Rmyb间构成myb DNA结合区的氨基酸序列的高保守性至今已报道了自植物种分离多种显示myb结构域为3个重复构造的3Rmyb的cDNA片段(Kranz等，Plant J.21231.(2000))。将这些不同的植物3Rmyb的myb DNA结合区氨基酸序列与人c-myb全长氨基酸序列进行了比较。
比较了这些不同的植物3Rmyb的myb DNA结合区氨基酸序列。氨基酸序列比较所用的3Rmyb为自展叶剑叶藓分离的MYB3R-1(GenBank登录号AAF78888、序列号79、图29～31中描述为PhpMYB3R-1)、自Adiantum raddianum分离的MYB3R-1(GenBank登录号AAF67053、序列号80、图29～31中描述为AdrMYB3R-1)、自大麦分离的MYB3R-1(GenBank登录号AAF78890、序列号81、图29～31中描述为HvMYB3R-1)、自黑麦分离的MYB3R-1(GenBank登录号AAF67050、序列号82、图29～31中描述为ScMYB3R-1)、自虞美人分离的推定的Myb相关结构域(GenBank登录号AAF43043、序列号83、图29～31中描述为ParMYB3R-1)、AtMYB3R1(图29～31中描述为AtMYB3R-1)、AtMYB3R3(图29～31中描述为AtMYB3R-3)、AtMYB3R4(图29～31中描述为AtMYB3R-4)、AtMYB3R5(图29～31中描述为AtMYB3R-5)、NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、Os3RmybA1、人c-myb(swissprot登录号P10242、序列号88)。由于自Adiantum raddianum、大麦、黑麦分离的cDNA为片段，构成myb DNA结合区的最初重复不显示为完全的长度。
编码人c-myb蛋白质(swissprot登录号P10242、序列号88)第43位至第192位氨基酸序列的myb DNA结合区与前述的自植物分离的3Rmyb氨基酸序列进行最佳比对。除去不含有全长myb DNA结合区的Adiantumraddianum、大麦、黑麦后，对其他报道的全长序列比较了植物3Rmyb。与c-myb比较表示氨基酸序列相似性的比对分值如下所示。显示了NtmybA1的比对分值为62、NtmybA2的比对分值为65、NtmybB的比对分值为60、AtMYB3R1的比对分值为64、AtMYB3R3的比对分值为64、AtMYB3R4的比对分值为63、AtMYB3R5的比对分值为66、PhpMYB3R-1的比对分值为66、ParMYB3R-1的比对分值为66、Os3RmybA1的比对分值为60。由以上可见，植物3Rmyb的myb DNA结合区与c-myb之间具有高保守性。另外，表明植物3Rmyb的myb DNA结合区与c-myb比较显示60或以上的比对分值。
接下来，对NtmybA1、NtmybA2、NtmybB、AtMYB3R1、AtMYB3R3、AtMYB3R4、AtMYB3R5、PhpMYB3R-1、ParMYB3R-1、Os3RmybA1、HvMYB3R-1、AdrMYB3R-1、ScMYB3R-1的c-myb样DNA结合区的氨基酸序列进行最佳比对，成功表明这13种的植物3Rmyb结构域的氨基酸序列间存在共有的保守序列(图29～31)。
即，多种植物3Rmyb间myb DNA结合区中保守的共有氨基酸序列为(i)W[S，T]XXE[D，E]XX[L，I，V](与序列号92对应。本序列中X为任一种氨基酸、[]表明选在其中的任一种氨基酸。)这一9个氨基酸所示的c-myb的myb基序(使用MOTIF程序(http//motif.genome.ad.jp/)的检索结果中以MYB#1(Myb DNA-结合结构域重复标记1)表示的构成c myb的3个重复myb DNA结合区的共有序列、图中为用黑粗线表示的序列)，其以3个重复且其间夹杂着任意42个氨基酸而存在(图中为箭头之间的氨基酸数)。
进一步详述为在13种氨基酸序列中，以同一的氨基酸或化学性状类似的氨基酸构成的位点表示保守序列时，可表示为以下150个氨基酸的序列(图中以保守序列表示的序列)。
(ii)WTXEEDXXLXXXVXXUXGX7XWKXIAXXXXXROX5JQCLHRWQKVLXPXLJKGXWOXEEDXXJXXXJXX7XGXXKWSXJOXXXXGRIGKQCRERWUNHLXPXIXX7XXWTXXEX5XXLXXXHXXXGNX7WAEJXX7XLXGX7ODNOIKNXWXSOXKKX7(与序列号93对应。本序列中X为任一种氨基酸、J为I、V、L中的任一种氨基酸、O为G、S、T、C、A中的任一种氨基酸、X7为K、R、H中的任一种氨基酸、U为H、W、Y、F中的任一种氨基酸、X5为D、E中的任一种氨基酸)。
使用CLUSTALW程序(http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-j.html)进行氨基酸序列的最佳比对，条件均设定为缺省参数。
实施例17植物3Rmyb的分离为了分离编码包含实施例16所示的(i)、进一步详述为(ii)的氨基酸序列的蛋白质的DNA，可使用实施例1的方法进行。
即以自目的植物细胞增殖旺盛的组织或细胞中制备的cDNA为模板，使用简并引物进行PCR和巢式PCR的组合。第一次PCR反应使用的简并引物为序列号1和序列号2所示的引物对。第一次PCR反应的反应液用作第二次PCR反应的模板。进行第二次PCR的巢式PCR反应中使用序列号3和序列号4所示引物对进行。第二次的PCR反应液用作第三次PCR反应的模板。进行第三次PCR的巢式PCR反应中使用序列号5和序列号6所示的引物对，可获得编码部分myb DNA结合区的DNA。以获得的DNA片段的碱基序列为参考，进行5’RACE法、3’RACE法从而可确定全长cDNA的5’末端及3’末端的碱基序列。以RACE法获得的末端序列为参考设计引物进行PCR反应，可获得全长cDNA。细胞增殖旺盛的组织及细胞包括自目的植物诱导的愈伤组织、培养细胞、或芽生植物体、植物体的茎顶部分、根端部分等。
实施例18植物3Rmyb的功能鉴定为了鉴定自实施例17的方法所获得的植物3Rmyb的功能，构建了可通过CaMV 35S启动子表达目的cDNA的植物3Rmyb质粒。将(i)植物3Rmyb质粒(10μg/样本)、NACK1启动子-LUC质粒(10μg/样本)、R-LUC质粒(1μg/样本)(ii)pBI221质粒(10μg/样本)、NACK1启动子-LUC质粒(10μg/样本)、R-LUC质粒(1μg/样本)所示的(i)或(ii)的组合质粒导入自烟草培养细胞BY2制备的原生质体中，测定LUC活性、R-LUC活性。比较用R-LUC活性标准化的LUC活性(LUC比活性)，与(ii)相比较，(i)的组合LUC比活性提高时可确定所用的植物3Rmyb为转录活化型。另外与(ii)相比较，(i)的组合LUC比活性降低时可确定所用的植物3Rmyb为转录抑制型。原生质体的制备方法、质粒的导入方法、LUC活性及R-LUC活性的测定方法可如实施例3所述方法实施。
实施例19通过NtmybB在雄性生殖器官特异表达而制备雄性不育植物通过使用雄性生殖器官中特异表达的启动子表达抑制G 2/M期特异表达基因转录的NtmybB基因的质粒转化植物，可在雄性生殖器官中改变细胞增殖，制备出抑制正常花粉形成且使种子育性降低的植物。
(1)质粒的构建给出了一个构建在雄性生殖器官中特异表达NtmybB的转化用质粒的方法。国际申请号PCT/JP02/12268所述的质粒pENTRAVP1及pENTR0.6分别为插入了拟南芥AtNACK2基因启动子或拟南芥AVP1基因启动子的质粒，以这些质粒为模板，在使用pENTRAVP1时，进行PCR的引物为HindIII-AVP1-298S(5′-CCCAAGCTTAAATTCGGACAAATAGAGCGTAGTCAAC-3′；序列号84)及引物AVP1+5A(5′-GCCATCTTCTCTCCTCCGTATAAGAG-3′；序列号85)；在使用pENTR0.6时，进行PCR的引物为HindIII-NACK2-575S(5′-CCCAAGCTTCTCGTTAAGAACCCTTGATC-3′；序列号86)及引物NACK2+3A+2(5′-GCCATCTTCTACACACAAAATCGAAACC-3′；序列号87)。所扩增的DNA片段经HindIII切割后与pEXP-NtmybB经SalI和EcoRV切割所切出的NtmybB DNA片段同时插入pUC18(Takara公司生产)经SalI和HindIII切割所产生的位点处，从而构建pUC-AVP1-NtmybB及pUC-0.6-NtmybB。pUC-AVP1-NtmybB及pUC-0.6-NtmybB经SalI切割后使用T4DNA聚合酶将突出末端钝端化，接下来使用HindIII切割所切出的DNA片段，并插入pBI121(Clontech公司生产)经SacI切割后并使用T4DNA聚合酶将突出末端钝端化并经HindIII切割后所产生的位点处，从而构建pBI-PAVP1-NtmybB及pBI-N0.6-NtmybB。pBI-PAVP1-NtmybB即为通过AVP1启动子驱动而表达NtmybB的可通过农杆菌法转化植物的双元载体。pBI-N0.6-NtmybB即为通过AtNACK2启动子驱动而表达NtmybB的可通过农杆菌法转化植物的质粒载体。使用这些质粒转化的植物可使用卡那霉素选择。
(2)拟南芥的转化使用上述(1)构建的2种双元载体转化根癌农杆菌，将含有这些质粒的农杆菌使用花器浸蘸法(与上述实施例8同样)转化拟南芥生态型Col-0。自农杆菌感染的花芽获得的种子使用次氯酸和无菌水灭菌，然后播种于含有卡那霉素50μg/ml、羧苄青霉素100μg/ml的MS培养基上。选择可在添加了卡那霉素的培养基上生长和发育的转化植物。
(3)经转化植物的育性降低在使用上述(1)的双元载体并通过上述(2)所获得的转化植物的鞘中观察所形成的种子，获得了与野生型相比种子数降低且育性下降的植物。
实施例20通过NtmybB在雄性生殖器官的特异表达而制备雄性不育植物通过NtmybB在雄性生殖器官特异表达而制备雄性不育植物通过使用雄性生殖器官中特异表达的启动子表达抑制G 2/M期特异表达基因转录的NtmybB基因的质粒转化植物，可在雄性生殖器官中改变细胞增殖，制备出抑制正常花粉形成且使种子育性降低的植物。
(1)质粒的构建使用在雄性生殖器官中观察到特异表达的基因拟南芥AVP1基因或拟南芥AtNACK2基因，这些基因的启动子区用于质粒的构建。可使用编码这些基因启动子区的插入在国际申请号PCT/JP02/12268所述的pENTRAVP1(AVP1)及pENTR0.6(AtNACK2)质粒中的启动子区DNA。编码NtmybB的DNA可自OH88制备。将这些DNA片段插入pBI121(Clontech公司生产)除去CaMV 35S启动子和GUS基因的位点处，从而构建AVP1启动子、NtmybB和Nos终止子功能性融合的质粒或AtNACK2启动子、NtmybB和Nos终止子功能性融合的质粒。这些质粒为由AVP1启动子或AtNACK1启动子驱动表达NtmybB的、可经农杆菌介导转化植物的双元载体，所获得的经转化植物可用卡那霉素选择。
(2)拟南芥的转化使用通过上述(1)获得的质粒转化根癌农杆菌，将维持有这些质粒的农杆菌使用花器浸蘸法(与上述实施例8同样的)转化拟南芥生态型Col-0。自农杆菌感染的花芽获得的种子用次氯酸和无菌水灭菌，然后播种于含卡那霉素50μg/ml、羧苄青霉素100μg/ml的MS培养基上。选择可在添加有卡那霉素的培养基上生长和发育的经转化植物。
(3)经转化植物的育性下降观察使用上述(1)的双元载体通过上述(2)得到的经转化植物鞘中形成的种子，获得了与野生型相比较，种子数目减少、育性下降的植物。
实施例21NtmybA1、NtmybA2的表达受到抑制的经转化烟草生长和发育的改变对于使用RNAi抑制内源NtmybA1及NtmybA2表达的经转化烟草，其生长和发育受到抑制。
(1)质粒的构建构建了将NtmybA1或NtmybA2或NtmybA1和NtmybA2两者的一部分DNA序列反向重复连接的DNA。反向重复连接时，在重复之间插入了编码GUS的间隔DNA。该反向重复排列的DNA用作RNAi DNA。将功能性融合有CaMV 35S启动子、RNAi DNA和Nos终止子的DNA插入pBI-RHL质粒。这些质粒为可转化农杆菌的质粒，其由CaMV 35S启动子驱动，使编码NtmybA1或NtmybA2或NtmybA1和NtmybA2两者的RNA以双链形态表达，对经转化植物可使用潮霉素选择。在所获得的经转化植物中表达的双链RNA使得植物体中内源的NtmybA1或NtmybA2或NtmybA1和NtmybA2两者的表达下降，即可获得RNAi的作用效果。
(2)烟草的转化使用上述(1)构建的质粒转化根癌农杆菌，将分别具有质粒的根癌农杆菌通过叶圆片法转化烟草品种SR1。自具有潮霉素耐性的愈伤组织分化、再生的经转化植物个体获得了自殖种子。
(3)经转化植物中生长和发育的改变播种使用上述(1)的双元载体转化并通过上述(2)获得的经转化植物自殖种子，观察生长和发育，获得了与野生型比较生长和发育受到抑制的烟草植物。
实施例22经Ntmyb转化的烟草中生长和发育的改变表达NtmybA2、NtmybA2T5、NtmybA2T2和NtmybB的经转化烟草中，生长和发育受到抑制。
使用RNAi抑制转录活性型内源NtmybA1、内源NtmybA2及内源NtmybA1和NtmybA2两者的表达的经转化烟草中生长和发育受到抑制。
(1)质粒的构建国际申请号PCT/JP02/12268所述的质粒pRHL经ApaI切割，使用T4DNA聚合酶将突出末端钝端化后进行自我连接，从而构建pRHL2。pRHL2经XhoI切割，使用克列诺片段将突出末端钝端化后进行自我连接，从而构建pRHL3。pRHL3经SpeI切割，使用克列诺片段将突出末端钝端化后进行自我连接，从而构建pRHL4。
pENTR2B(Invitrogen公司生产)经EcoRI切割所切出的含有ccdB盒的DNA片段使用克列诺片段将突出末端钝端化，插入pDONR201(Invitrogen公司生产)经XmnI和BsaAI切割所产生的位点处，从而构建pDONR201ΔCm1。所插入的DNA片段与pDONR201ΔCm1反向的质粒称为pDONR201ΔCm3。
pDONR201ΔCm1用ApaI和SmaI切割，将切出的DNA片段插入pBluescriptII(Stratagene公司生产)经ApaI和SmaI切割所产生的位点处，从而构建pBS-attP。
pDHu1-1(名古屋大学理学研究科上野宜久助手惠赠)经EcoRI切割，所切出DNA的突出末端用克列诺片段钝端化后，插入pRHL4经SmaI切割所产生的位点处，从而构建pRHGUSRiL。
pDONR201ΔCm3经ApaI和NruI切割，所切出的DNA片段插入pRHGUSRiL经ApaI和SmaI切割所产生的位点处，从而构建pRHGUSRiP1。
经pBS-attP经ApaI切割后，将突出末端用T4 DNA聚合酶钝端化并经SpeI切割切出的DNA片段插入pRHGUSRiP1经XhoI切割后并将突出末端用克列诺片段钝端化且经SpeI切割而产生的位点处，从而构建pRHGUSRiP2。
pRHGUSRiP2经BglII切割切出的DNA片段插入pBI121经BglII切割并除去切出的DNA片段后所产生的位点处，从而构建pBI-GUSRiP1。
以实施例10(1)所述的pBS-VA1A2为模板，使用引物B1T3(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATTAACCCTCACTAAAGGG-3′；序列号41)和引物B2T7(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；序列号42)进行PCR，获得了串联连接的含有部分NtmybA1 DNA片段及含有部分NtmybA2 DNA片段且两末端添加有Gateway system(Invitrogen公司)的attB1、attB2序列的DNA片段。所述DNA片段与质粒pBI-GUSRiP1(Invitrogen公司)混合，使用BPClonase(Invitrogen公司)进行BP反应，将串联连接的含有部分NtmybA1DNA片段及含有部分NtmybA2 DNA片段的DNA以反向重复构象插入pBI-GUSRiP1，从而构建pBIHm-A1A2RNAi。
以实施例10(1)所述的pBS-VA1为模板，使用引物B1T3(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG CTCAATTAACCCTCACTAAAGGG-3′；序列号41)和引物B2T7(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；序列号42)进行PCR，获得了在含有部分NtmybA1 DNA片段的两末端添加有Gateway system(Invitrogen公司)的attB1、attB2序列的DNA片段。所述DNA片段与质粒pBI-GUSRiP1(Invitrogen公司)混合，使用BP Clonase(Invitrogen公司)进行BP反应，将含有部分NtmybA1的DNA以反向重复构象插入pBI-GUSRiP1，从而构建pBIHm-A1RNAi。
以实施例10(1)所述的pBS-VA2为模板，使用引物B1T3(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATTAACCCTCACTAAAGGG-3′；序列号41)和引物B2T7(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；序列号42)进行PCR，获得了在含有部分NtmybA2 DNA片段的两末端添加有Gateway system(Invitrogen公司)的attB1、attB2序列的DNA片段。所述DNA片段与质粒pBI-GUSRiP1(Invitrogen公司)混合，使用BP Clonase(Invitrogen公司)进行BP反应，将含有部分NtmybA2的DNA以反向重复构象插入pBI-GUSRiP1，从而构建pBIHm-A2RNAi。
即(i)pBIHm-A1A2RNAi为通过CaMV 35S启动子驱动以双链形态表达编码NtmybA1和NtmybA2这两者的RNA的、可通过农杆菌法转化的双元载体；(ii)pBIHm-A1RNAi通过CaMV 35S启动子驱动以双链形态表达编码NtmybA1的RNA的、可通过农杆菌法转化的双元载体；(iii)pBIHm-A2RNAi为通过CaMV 35S启动子驱动以双链形态表达编码NtmybA2的RNA的、可通过农杆菌法转化的双元载体；所述载体转化的植物可使用潮霉素选择。在使用(i)至(iii)的双元载体获得的经转化植物中表达的双链RNA作用下，使用(i)时可下降植物体中内源NtmybA1和NtmybA2两者的表达量、使用(ii)时可下降植物体中内源NtmybA1的表达量、使用(iii)时可下降植物体中内源NtmybA2的表达量，即可获得RNAi效果。
(2)烟草的转化使用下述质粒进行烟草的转化(i)pBIHm-A1A2RNAi质粒(上述(1)所述)(ii)pBIHm-A1RNAi质粒(上述(1)所述)(iii)pBIHm-A2RNAi质粒(上述(1)所述)(iv)pBIHm-NtmybA2质粒(实施例8(1)所述)(v)pBIHm-NtmybA2T2质粒(实施例8(1)所述)(vi)pBIHm-NtmybB质粒(实施例8(1)所述)(vii)pDBIHm-NtmybA2T5质粒(实施例9(1)所述)(viii)pBIHm-GFP质粒(实施例8(1)所述)(ix)pPZP211质粒(实施例9(1)所述)(x)pPCYM-NtmybA2T2质粒(实施例9(1)所述)(xi)pPZP211-35S:A2RNAi质粒(实施例11(1)所述)(xii)pPZP-35S:A2质粒(实施例12(1)所述)(xiii)pPZP-35S:A2T2质粒(实施例12(1)所述)使用(i)至(xiii)的质粒转化根癌农杆菌，将具有质粒的各种根癌农杆菌通过叶圆片法转化烟草品种SR1。自使用(i)至(viii)的质粒时具有潮霉素耐性、自使用(ix)至(xiii)的质粒时具有卡那霉素耐性的愈伤组织分化、再生的经转化植物个体获得自殖种子。
(3)在经转化植物中生长和发育的改变播种上述(2)获得的经转化植物自殖种子，观察其生长和发育。使用上述(2)(viii)获得的经转化植物或野生型对照比较，观察到使用上述(2)(i)至(vii)获得的经转化植物的生长和发育受到抑制。使用上述(2)(ix)获得的经转化植物与野生型对照比较，观察到使用上述(2)(x)至(xiii)获得的经转化植物的生长和发育受到抑制。
实施例23制备转录活化功能改变的NtmybA1、Os3RmybA1、AtMYB3R1、AtMYB3R4变体将转录活化型的植物3RmybNtmybA1、Os3RmybA1、AtMYB3R1、AtMYB3R4的C末端侧截短，可制备出转录活化功能提高的分子或转录活化功能下降的分子。结构域的删除可参考实施例14、
图15～18、实施例15和
图19～25确定。
即，在为NtmybA1的情况下，第579至1003位氨基酸序列的删除、第641至1003位氨基酸序列的删除、第715至1003位氨基酸序列的删除可制备出转录活性提高的变体。在为Os3RmybA1的情况下，第575至993位氨基酸序列的删除、第635至993位氨基酸序列的删除、第709至993位氨基酸序列的删除可制备出转录活性提高的变体。在为AtMYB3R1的情况下，第583至776位氨基酸序列的删除、第621至776位氨基酸序列的删除、第691至776位氨基酸序列的删除可制备出转录活性提高的变体。在为AtMYB3R4的情况下，第570至961位氨基酸序列的删除、第608至961位氨基酸序列的删除、第667至961位氨基酸序列的删除可制备出转录活性提高的变体。
另外，在为NtmybA1的情况下，第186至1003位氨基酸序列的删除、第299至1003位氨基酸序列的删除可制备出转录活化功能下降的变体。在为Os3RmybA1的情况下，第203至993位氨基酸序列的删除、第257至993位氨基酸序列的删除可制备出转录活化功能下降的变体。在为AtMYB3R1的情况下，第187至776位氨基酸序列的删除、第241至776位氨基酸序列的删除可制备出转录活性下降的变体。在为AtMYB3R4的情况下，第181至961位氨基酸序列的删除、第235至961位氨基酸序列的删除可制备出转录活性下降的变体。
通过实施例3及实施例18所述的方法，采用在BY2原生质体瞬时表达而测定对NACK1启动子的转录可确定上述变体的转录活化功能。这些截短的突变体与野生型相比较，其转录活化功能或者提高或者下降。
实施例24过量表达NtmybA2的经转化烟草的矮化(1)烟草的转化使用前述质粒pBIHm-NtmybA2、pBIHm-GFP转化根癌农杆菌EHA101株，将具有这些质粒的根癌农杆菌通过叶圆片法转化烟草品种SR1。
(2)在经转化烟草中所导入基因的表达量栽培所获得的潮霉素耐性个体而得到自殖种子。自NtmybA2的转化品系AW#3、AW#23及GFP的转化品系G#3获得的自殖种子播种在填充有クレハ园林培土(吴羽化学公司生产)的13cm塑料盆中，于27℃进行栽培。照明条件为18小时照明、6小时黑暗。在这些品系中所导入基因的表达通过RT-PCR法确定。每一品系自5个个体取样未展开的顶叶，通过前述实施例10(2)的方法扩增NtmybA2。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，发现AW#3、AW#23品系与G#3品系相比较，NtmybA2的表达量提高，从而证实所导入基因的过量表达。
(3)经NtmybA2转化的烟草的矮化对在上述(2)中证实了NtmybA2过量表达的各个体继续栽培，连续测定植株高度、真叶数。结果发现NtmybA2的表达量提高的AW#3、AW#23各个体与G#3相比较，植株高度(图32)和叶大小变小。观察到真叶数略有降低的倾向(图33)。另外，节间明显变短。由此可见，在由CaMV 35S启动子驱动的表达NtmybA2的经转化烟草中，表现为植物矮化。
(4)经NtmybA2转化的烟草中细胞数的降低及细胞的小型化使用上述(3)栽培的AW#23转化品系与野生型烟草进行营养叶大小和表皮细胞的比较。观察所用的营养叶为野生型与AW#23的相同叶位的完全展开叶。比较这些叶的大小发现AW#23较野生型小约80％。为了观察叶的表皮细胞，制备了叶圆片，在乙醇∶乙酸9∶1的混合液中脱色、固定。使用微分干涉相差显微镜对这些叶圆片进行照相，分别测定50个表皮细胞面积。结果与野生型比较，AW#23细胞面积减小约45％，表明AW#23的细胞变小。由以上结果可见，对AW#23而言构成叶的细胞变小45％，叶的小型化率更高，变小了80％，由此认为叶小型化的原因为细胞变小且细胞数减少。还认为细胞数的降低来自细胞周期的延迟。
实施例25拟南芥AtHB8启动子驱动NtmybA2表达的经转化烟草的矮化制备了NtmybA2在拟南芥AtHB8基因的启动子作用下表达的经转化烟草，比较了生长和发育。
(1)转化用质粒的构建pDBIHm-PAtHB8-NtmybA2质粒的构建以根据常规方法提取的拟南芥基因组DNA为模板，使用引物PAtHB8-1F(5′-AACTGCAGCGGATAAACCAATTTTCAAATGATA-3′；序列号96)和引物PAtHB8-1700R(5′-CGGGATCCCTTTGATCCTCTCCGATCTCTCTAT-3′；序列号97)进行PCR反应，获得了含有拟南芥AtHB8基因的启动子区的DNA片段(序列号98，AtHB8启动子GenBank登录号#AL161582(所用区域为89580-91279))。以OH60为模板，使用引物A2-ATG-Bam(5′-CGGGATCCATGGAAAGTGATAGAATAAGCAC-3′；序列号99)和引物A2T2-TAA-Not(5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTAACAGCCTAAATGGAGTAAGACAG-3′；序列号100)进行PCR反应，获得含有部分NtmybA2的DNA片段。
自PCR反应获得的AtHB8启动子DNA经PstI和BamHI切割。另外含有部分NtmybA2的DNA片段经BamHI和NotI切割。将这2种DNA片段插入pBluescript(Stratagene公司生产)经PstI和NotI切割所产生的位点处，从而构建质粒pBS-PAtHB8-NtmybA2T2。
质粒pTH2(Chiu等，Curr Biol 1996 Mar 1；6(3)325-30)经EcoRI切割，使用克列诺片段将突出末端钝端化后，进一步使用NotI切割切出含有NOS终止子的DNA片段。将该DNA片段插入质粒pENTR2B(Invitrogen公司生产)经NotI和EcoRV切割所产生的位点处，从而构建质粒pENTR-NOST1。
将pBS-PAtHB8-NtmybA2T2经SalI和NotI切割所切出的DNA片段插入pENTR-NOST1经SalI和NotI切割所产生的位点处，从而构建质粒pENTR-PAtHB8-NtmybA2T2。
OH60经SalI切割并使用克列诺片段将突出末端钝端化后，使用SpeI切割，切出含有NtmybA2C端区的DNA片段。将该DNA片段插入pENTR-PAtHB8-NtmybA2T2经SpeI和SmaI切割所产生的位点处，从而构建质粒pENTR-PAtHB8-NtmybA2。
上述实施例9所构建的质粒pDESTBI-1和pENTR-PAtHB8-NtmybA2混合，通过Gateway LR Clonase mix(Invitrogen公司生产)的部位特异重组反应构建pDBIHm-HB8-NtmybA2。使用Gateway LR Clonase mix的反应按照试剂所提供的方法实施。pDBIHm-HB8-NtmybA2为通过AtHB8启动子表达全长NtmybA2的质粒载体，为可通过农杆菌法转化植物的双元载体。使用这些质粒转化的植物可通过潮霉素选择转化体。
(2)烟草的转化使用前述质粒pDBIHm-HB8-NtmybA2转化根癌农杆菌EHA101株，使用携带有这些质粒的农杆菌通过叶圆片法转化烟草品种SR1(Nicotianatabacum ver.SR1)及本塞姆氏烟草(Nicotiana bentamiana)。
(3)通过AtHB8启动子表达NtmybA2的经转化烟草的矮化获得了上述(2)转化的各品系的自殖种子。将这些种子播种在填充有クレハ园林培土(吴羽化学公司生产)的13cm塑料盆中，于27℃进行栽培。照明条件为18小时照明、6小时黑暗。这些植物体与野生型烟草和仅转化载体的转化体相比较，存在矮化现象。
实施例26Atmyb3R1和Atmyb3R4的表达受到抑制的经转化拟南芥中多倍性的改变
(1)Atmyb3R1，Atmyb3R4 RNAi用质粒的构建为了制备出诱导Atmyb3R1和Atmyb3R4的RNAi的经转化拟南芥，如下构建质粒。自序列号75所示的Atmyb3R1和序列号76所示的Atmyb3R4的cDNA通过PCR扩增含有250个碱基对或以上的DNA序列。将这2种DNA构建为串联连接的DNA。将该DNA序列通过与实施例11所示的质粒构建同样的方法，构建其间插入GUS的反向重复连接的质粒。该质粒为双元载体，其通过CaMV 35S启动子调控所插入DNA的表达并可通过农杆菌法转化拟南芥，其中所获得的转化体可使用卡那霉素选择。由该质粒转化的拟南芥获得了自所导入基因表达的RNA产生的RNAi作用，从而Atmyb3R1和Atmyb3R4的表达量降低。
(2)拟南芥的转化使用携带有前述(1)构建的质粒的农杆菌通过花器浸蘸法(与上述实施例8同样)转化拟南芥生态型Col-0。自农杆菌感染的植物体获得的自殖种子用乙醇和次氯酸灭菌，用灭菌蒸馏水充分洗净。将这些种子播种并栽培于添加了卡那霉素50μg/ml的MS琼脂培养基。对经转化植物选择卡那霉素耐性个体。
(3)经转化拟南芥中多倍性的变化前述(2)所选择的转化体置于盆中栽培。自这些经转化植物获得的自殖种子用乙醇和次氯酸灭菌，用灭菌蒸馏水充分洗净。将这些种子播种并栽培于添加了卡那霉素50μg/ml的MS琼脂培养基。使用作为卡那霉素耐性而生长和发育的个体的莲座叶，通过如实施例11所示的同样方法测定核DNA含量。因为拟南芥为2倍体，在测定野生型拟南芥的DNA含量时，观察到显示2C、4C的峰，并且由于核内再复制，观察到显示核内DNA含量增加的8C和16C的峰。通过测定Atmyb3R1和Atmyb3R4的表达量由于RNAi作用而降低的经转化拟南芥的核内DNA含量确定了多倍性增加的个体。没有野生型2C峰的个体为4倍体的个体。2C、4C峰消失而显示为8C、16C峰的个体为8倍体的个体。
工业实用性提供了在植物育种中重要的细胞周期调控并改变植物细胞的增殖的技术，还提供了改变植物个体的发育分化的技术。另外还提供了对植物细胞增殖的调控以及植物个体发育分化的调控而言有用的植物基因及使用其的技术。可利用该技术开发新植物以及开发植物育种技术。特别是提供了改变并调控植物3Rmyb基因功能的技术以及功能受到改变的新3Rmyb基因及该基因产物和相关分子。也提供了转录活化功能显著提高的植物3Rmyb蛋白变体、针对植物3Rmyb基因的转录物显性失活发挥作用的分子，也可开发其利用技术。提供了以该基因为靶标改变植物细胞的增殖的技术及改变植物个体的发育分化的技术，获得了具有改变的细胞增殖、发育分化的植物细胞及植物体，从而可开发具有特定的器官肥大、雄性不育或逆境耐性改善等所需特性的植物体。
可以理解本发明除了可以采用前述的说明及实施例中具体的描述实施外，还可采用其他形式实施。借鉴于上述教导可对本发明进行多种改变及变化，因此它们也在本申请权利要求的范围内。
<序列表单独文本>
SEQ ID NO1，用作PCR引物的寡核苷酸，在位置3、6和15处的n代表肌苷，在位置21处的n代表任一碱基SEQ ID NO2，用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷SEQ ID NO3，用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷SEQ ID NO4，用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷SEQ ID NO5，用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷SEQ ID NO6，用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷SEQ ID NO7，用作PCR引物的寡核苷酸，T7引物SEQ ID NO11，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO12，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO13，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO14，用作PCR引物的寡核苷酸
SEQ ID NO15，用作PCR引物的寡核苷酸，T3引物SEQ ID NO16，n代表任意碱基SEQ ID NO18，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO19，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO20，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO21，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO24，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO25，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO26，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO27，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO28，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO29，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO30，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO31，Os3RmybA1 ORFSEQ ID NO33，用于NtmybA1/A2的RT-PCR引物SEQ ID NO34，用于NtmybA1/A2的RT-PCR引物SEQ ID NO35，用于EF1α的RT-PCR引物SEQ ID NO36，用于EF1α的RT-PCR引物SEQ ID NO37，用于VIGS A1 DNA的PCR引物SEQ ID NO38，用于VIGS A1 DNA的PCR引物SEQ ID NO39，用于VIGS A2 DNA的PCR引物SEQ ID NO40，用于VIGS A2 DNA的PCR引物SEQ ID NO41，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO42，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO43，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO44，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO45，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO46，用作PCR引物的寡核苷酸
SEQ ID NO47，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO48，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO50，DDBJ登录号#AB056122，NtmybA1(DDBJ登录号#BAB70510)SEQ ID NO52，DDBJ登录号#AB056123，NtmybA2(DDBJ登录号#BAB70511)SEQ ID NO54，DDBJ登录号#AB056124，NtmybB(DDBJ登录号#BAB70512)SEQ ID NO56，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO57，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO58，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO59，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO60，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO61，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO62，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO63，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO64，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO65，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO66，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO67，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO68，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO69，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO70，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO71，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO72，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO73，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO74，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO84，用作PCR引物的寡核苷酸
SEQ ID NO85，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO86，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO87，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO89，设计的氨基酸序列SEQ ID NO90，设计的氨基酸序列，X代表任一氨基酸残基SEQ ID NO91，设计的氨基酸序列，X代表任一氨基酸残基SEQ ID NO92，设计的氨基酸序列，在位置3、4、7和8处X代表任一氨基酸残基，在位置2处X代表S或T，在位置6处X代表D或E，在位置9处X代表L或I或VSEQ ID NO93，设计的氨基酸序列，在位置16和93处X代表H，W，Y或F，在位置19，67，102，123，129，134 & 150处X代表K，H或R，在位置32，54，77，135，138 & 146处X代表S，T，G，C或A，在位置33 & 110处X代表D或E，在位置34，49，61，65，76 & 127处X代表L，I或V，在其它位置处的X代表任一残基SEQ ID NO94，设计的氨基酸序列，在位置4处的X代表K或R，在位置11处的X代表L或V，在位置12处的X代表S或T，在位置14处的X代表L、I或V，在位置16 & 20处的X代表D或E，在其它位置的X代表任一氨基酸残基SEQ ID NO95，设计的氨基酸序列，在位置7处的X代表K或R或D或E或H，在位置5处的X代表任一氨基酸残基SEQ ID NO96，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO97，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO99，用作PCR引物的寡核苷酸SEQ ID NO100，用作PCR引物的寡核苷酸序列表<110>石原产业株式会社<120>细胞增殖、发育分化受到改变的植物细胞和植物<130>IS-09PCT<150>JP 2003-66064<151>2003-03-12<160>100<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸，在位置3、6和15处的n代表肌苷，在位置21处的n代表任一碱基<220>
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<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>I<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>I<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n代表任一碱基<400>1gangtncart gyywncaymg ntgg24<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>I<220>
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<223>用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷<220>
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<223>I<220>
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<223>用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷<220>
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<223>用作PCR引物的寡核苷酸，n代表肌苷
<220>
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<223>用作PCR引物的寡核苷酸，T7引物<400>7taatacgact cactataggg20
<210>8<211>228<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>8cacaggtggc aaaaggttct aaaccctgaa ttagtcaaag ggccatggtc caaagaagaa 60gatgaaatca ttgttcagat ggtaaacaaa cttggaccaa agaaatggtc aaccattgct120caagctttgc ctggacgtat aggaaagcaa tgtcgagaac ggtggtacaa ccatcttaac180cctggcataa acaaggaggc atggacacaa gaagaggaaa ttaccctc 228<210>9<211>305<212>DNA<213>稻<400>9caccggtggc agaaagtgct ggatcctgaa ttggtcaaag ggccatggtc caaagaagaa 60gatgacatca ttgttcagat ggtaaacaaa cttgggccaa agaaatggtc aaccattgct120caagctttgc ctggacgtat aggaaagcaa tgtcgggaac ggtggcacaa ccatcttaac180cctggcataa acaaggaggc atggacacaa gaagaggaaa ttaccctcat acatgctcat240cgaatgtatg gaaataaatg ggctgagttg acagaatttt tccacggccg ctccgacaac300gccga305<210>10<211>305<212>DNA<213>稻<400>10cataggtggc agaaggtgct ggaccctgaa ttggtcaaag ggccatggtc caaagaagaa 60gatgacatca ttgttcagat ggtaaacaaa cttggaccaa agaaatggtc aaccattgct120
caagctttgc ctggacgtat aggaaagcaa tgtcggggac ggtggcacaa ccatcttaac180cctggcgtaa acaaggaggc atggacacaa gaagaggaaa ttaccctcat acatgctcat240cgaatgtatg gaaataaatg ggctgagctg acaaaatttt tccacggccg taccgacaac300gccta305<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>11cagctcggcc catttatttc catacatt28<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>12cgactggagc acgaggacac tga 23<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>13cttcttgtgt ccatgcctcc ttgtttat28
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<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>14ggacactgac atggactgaa ggagta 26<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸，T3 primer<400>15aattaaccct cactaaaggg 20<210>16<211>726<212>DNA<213>稻<220>
<221>misc_feature<222>(542)..(542)<223>n代表任一碱基<400>16acgctctgaa atttgaaatc gcagacgagg cgagacgaag acgaagagga agagcaagag 60ctagggttag gaggaggcga tttgctccgc ccgcagatcg gatcccccac ctcgtctcgc120ccccgatctc gctgtattcc ttgaagcaac tccctgaagg ccttactcag gcttgaccgt180
ataatgattt ttatatccct tagaggtttc tattgcaaag tgaggattga atgtcttcag240tcatgatgac aagcgacaac ggaaaggctc cagagaaggg tggagaagct tctggacctt300catcagctcc ccaagaaggt gaaatcagca atgaaccaca aaggcgccgg ccgctcagtg360ggaggaccac tggtccaaca cggcgttcca cgaaaggaaa ttggacccct gaagaggatt420ccatattgtc cagagctgtt cagacatata aagggaggaa ttggaaaaaa atagcggaat480gttttccgga tagaaccgat gtacaatgct tgcacaggtg gcaaaaggtt ctaaaccctg540anttggtcaa agggccatgg tccaaagaag aagatgacat cattgttcag atggtaaaca600aacttggacc aaagaaatgg tcaaccattg ctcaagcttt gcctggacgt ataggaaagc660aatgtcggga acggtggcac aaccatctta accctggcat aaacaaggag gcatggacac720aagaag 726<210>17<211>574<212>DNA<213>稻<400>17cctgaaggcc tcactgaggc ttgacagtat aatgattttt atatcccttg gaggtttcta 60ctgcaaagtg aggattgatt gtcttcactc atgatgacaa gcgataacgg aaaggctcca120gataaggatg gagagccttc tggacctccg tcggctcctc aagaaggaga aatcagcaat180gaaccaaaaa ggcgacgacc tctcaatggg aggaccaccg gtccgacacg gcgttccacc240aaaggaaatt ggacccctga agaggatgcc atattgtcca gagctgttca gacatacaac300gggaagaact ggaaaaaaat agcggaatgc tttccggata gaaccgatgt acaatgcttg360cacaggtggc aaaaggttct aaaccctgaa ttagtcaaag ggccatggtc caaagaagaa420gatgaaatca ttgttcagat ggtaaacaaa cttggaccaa agaaatggtc aaccattgct480caagctttgc ctggacgtat aggaaagcaa tgtcgagaac ggtggtacaa ccatcttaac540
cctggcataa acaaggaggc atggacacaa gaag574<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>21cgctacgtaa cggcatgaca gtc 23<210>22<211>757<212>DNA<213>稻<400>22ggaaataaat gggccgagct gacaaaattt ttaccaggaa ggacggacaa ttcaattaaa 60aatcactgga acagttcagt aaagaagaaa gtcaattcat acatgtcatc aggtttactt120acccaagttt cgtgtctccc tctaaatgaa tattctgcaa attgtaattc ctcaccagcg180atgacccgac aaaacagtga agatagtggt tgttttgctg tccgagaggt tgaaaattca240tcagggtgta gtcaatcatc acttgccaag gtttcttgct cccaagtgca tgatactact300gtgccattgg gctgtgattt gcaagtaaac gcgaattttg acaagaatga agcacatgat360tctcaatctt ccatgggtcc ccaagcatgc tatacttctg cggaggctgt tgcatctgct420ttgcctgctg tgcattgcca tgtttcttcc tctaacttgg atccagatca acacttgcaa480gaggactttg ctcaaggact gaatttggac atgactatag atgaaatgcc aactgttcct540agttttgcag acaaccagac tgtttgtagt atagaaaatc atgaaagatc tctggagcca600tatgatgtag caatggaggt gcctctctct atgttatcaa gtgattctgg agctgagcaa660aaactacatt tcatgtctga ggctgacttc aacagtccta actgtctgaa atctgaactc720tggcaggata tttccttaca gggccttctt tctggac 757<210>23<211>209<212>DNA
<213>稻<400>23ggcagagggt agagtcctgg atttcgagtg taccacacct gaaagatcat cagacaaaaa 60tgctggcagc aatctgggaa gatatctgag ctcacctatt ccttcgtccc atcttctgaa120aagttttaga tagcttgata taccatgtga ggaatacacc tcagacttgc tgtaacaatc180attatgcgaa cgatcttgtt cattaccgt 209<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>24tgtcttcagt catgatgaca agcga 25<210>25<21t>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>25caagctatct aaaacttttc agaagatgg 29<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸
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<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>27acagggcctt cttttctgga c 21<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>30atctccttca catggaagtc 20<210>31<211>2996<212>DNA<213>稻<220>
<221>CDS<222>(11)..(2992)<223>Os3RmybA1 ORF<400>31tgtcttcgtc atg atg aca agc gat aac gga aag gct cca gat aag gat49Met Met Thr Ser Asp Asn Gly Lys Ala Pro Asp Lys Asp1 5 10gga gag cct tct gga cct ccg tcg gct cct caa gaa gga gaa atc agc 97Gly Glu Pro Ser Gly Pro Pro Ser Ala Pro Gln Glu Gly Glu Ile Ser15 20 25aat gaa cca aaa agg cga cga cct ctc aat ggg agg acc acc ggt ccg 145Asn Glu Pro Lys Arg Arg Arg Pro Leu Asn Gly Arg Thr Thr Gly Pro30 35 40 45aca cgg cgt tcc acc aaa gga aat tgg acc cct gaa gag gat gcc ata 193Thr Arg Arg Ser Thr Lys Gly Asn Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ala Ile50 55 60ttg tcc aga gct gtt cag aca tac aac ggg aag aac tgg aaa aaa ata 241Leu Ser Arg Ala Val Gln Thr Tyr Asn Gly Lys Asn Trp Lys Lys Ile65 70 75gcg gaa tgc ttt ccg gat aga acc gat gta caa tgc ttg cac agg tgg 289Ala Glu Cys Phe Pro Asp Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu His Arg Trp80 85 90
caa aag gtt cta aac cct gaa tta gtc aaa ggg cca tgg tcc aaa gaa 337Gln Lys Val Leu Asn Pro Glu Leu Val Lys Gly Pro Trp Ser Lys Glu95 100 105gaa gat gaa atc att gtt cag atg gta aac aaa ctt gga cca aag aaa 385Glu Asp Glu Ile Ile Val Gln Met Val Asn Lys Leu Gly Pro Lys Lys110 115 120 125tgg tca acc att gct caa gct ttg cct gga cgt ata gga aag caa tgt 433Trp Ser Thr Ile Ala Gln Ala Leu Pro Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys130 135 140cga gaa cgg tgg tac aac cat ctt aac cct ggc ata aac aag gag gca 481Arg Glu Arg Trp Tyr Asn His Leu Asn Pro Gly Ile Asn Lys Glu Ala145 150 155tgg aca caa gaa gag gaa att acc ctc ata cat gct cat cga acg tat 529Trp Thr Gln Glu Glu Glu Ile Thr Leu Ile His Ala His Arg Thr Tyr160 165 170gga aat aaa tgg gcc gag ctg aca aaa ttt tta cca gga agg acg gac 577Gly Asn Lys Trp Ala Glu Leu Thr Lys Phe Leu Pro Gly Arg Thr Asp175 180 185aat tca att aaa aat cac tgg aac agt tca gta aag aag aaa gtc aat 625Asn Ser Ile Lys Asn His Trp Asn Ser Ser Val Lys Lys Lys Val Asn190 195 200 205tca tac atg tca tca ggt tta ctt acc caa gtt tcg tgt ctc cct cta 673Ser Tyr Met Ser Ser Gly Leu Leu Thr Gln Val Ser Cys Leu Pro Leu210 215 220aat gaa tat tct gca aat tgt aat tcc tca cca gcg atg acc caa caa 721Asn Glu Tyr Ser Ala Asn Cys Asn Ser Ser Pro Ala Met Thr Gln Gln225 230 235aac agt gaa gat agt ggt tgt ttt gct gtc cga gag gtt gaa aat tca 769Asn Ser Glu Asp Ser Gly Cys Phe Ala Val Arg Glu Val Glu Asn Ser240 245 250tca ggg tgt agt caa tca tca ctt gcc aag gtt tct tgc tcc caa gtg 817Ser Gly Cys Ser Gln Ser Ser Leu Ala Lys Val Ser Cys Ser Gln Val255 260 265
cat gat act act gtg cca ttg ggc tgt gat ttg caa gta aac gcg aat 865His Asp Thr Thr Val Pro Leu Gly Cys Asp Leu Gln Val Asn Ala Asn270 275 280 285ttt gac aag aat gaa gca cat gat tct caa tct tcc atg ggt ccc caa 913Phe Asp Lys Asn Glu Ala His Asp Ser Gln Ser Ser Met Gly Pro Gln290 295 300gca tgc tat act tct gcg gag gct gtt gca tct gct ttg cct gct gtg 961Ala Cys Tyr Thr Ser Ala Glu Ala Val Ala Ser Ala Leu Pro Ala Val305 310 315cat tgc cat gtt tct tcc tct aac ttg gat cca gat caa cac ttg caa 1009His Cys His Val Ser Ser Ser Asn Leu Asp Pro Asp Gln His Leu Gln320 325 330gag gac ttt gct caa gga ctg aat ttg gac atg act ata gat gaa atg 1057Glu Asp Phe Ala Gln Gly Leu Asn Leu Asp Met Thr Ile Asp Glu Met335 340 345cca act gtt cct agt ttt gca gac aac cag act gtt tgt agt ata gaa 1105Pro Thr Val Pro Ser Phe Ala Asp Asn Gln Thr Val Cys Ser Ile Glu350 355 360 365aat cat gaa aga tct ctg gag cca tat gat gta gca atg gag gtg cct 1153Asn His Glu Arg Ser Leu Glu Pro Tyr Asp Val Ala Met Glu Val Pro370 375 380ctc tct atg tta tca agt gat tct gga gct gag caa aaa cta cat ttc 1201Leu Ser Met Leu Ser Ser Asp Ser Gly Ala Glu Gln Lys Leu His Phe385 390 395atg tct gag gct gac ttc aac agt cct aac tgt ctg aaa tct gaa ctc 1249Met Ser Glu Ala Asp Phe Asn Ser Pro Asn Cys Leu Lys Ser Glu Leu400 405 410tgg cag gat att tcc tta cag ggc ctt ctt tct gga cct gat gca gtt 1297Trp Gln Asp Ile Ser Leu Gln Gly Leu Leu Ser Gly Pro Asp Ala Val415 420 425gaa gct gat tca att tca aga tca aat cac caa tcg gat gta tat tcc 1345Glu Ala Asp Ser Ile Ser Arg Ser Asn His Gln Ser Asp Val Tyr Ser430 435 440 445
tct gaa gca gat acc cat ttt tta gca cca ccc tac atg cca cag aca 1393Ser Glu Ala Asp Thr His Phe Leu Ala Pro Pro Tyr Met Pro Gln Thr450 455 460tca aat tct tca agt gtg atg ggg ctt gct gat gac cag agt cca cag 1441Ser Asn Ser Ser Ser Val Met Gly Leu Ala Asp Asp Gln Ser Pro Gln465 470 475atg tca gta cct cca tct ctt att tgt tca aat gct atg act gat gat 1489Met Ser Val Pro Pro Ser Leu Ile Cys Ser Asn Ala Met Thr Asp Asp480 485 490gca cct ttc gat aat aga cca ggg cgg aag gaa atg cca ctt tct cag 1537Ala Pro Phe Asp Asn Arg Pro Gly Arg Lys Glu Met Pro Leu Ser Gln495 500 505gca gaa gtg gtt acc caa tct tcc agt tct tct ggt gat gct gaa atg 1585Ala Glu Val Val Thr Gln Ser Ser Ser Ser Ser Gly Asp Ala Glu Met510 515 520 525ttt gct aac cct ggt tgt agc aat gac aga cat gtt cct tct tca acg 1633Phe Ala Asn Pro Gly Cys Ser Asn Asp Arg His Val Pro Ser Ser Thr530 535 540atg gaa agc ata cct gaa tgt ggg gac caa cag gtt act aat gcg gaa 1681Met Glu Ser Ile Pro Glu Cys Gly Asp Gln Gln Val Thr Asn Ala Glu545 550 555gaa cct gaa gcc agt cta gag aaa gaa cca tcg ctt aca cag agt gtg 1729Glu Pro Glu Ala Ser Leu Glu Lys Glu Pro Ser Leu Thr Gln Ser Val560 565 570act gca cca gat gaa cag gac aag gga gcc ctc ttc tac gaa cct cct 1777Thr Ala Pro Asp Glu Gln Asp Lys Gly Ala Leu Phe Tyr Glu Pro Pro575 580 585cgt ttt cca agc ctg gat gtt cca ttt gtc agt tgc gat ctt gta acc 1825Arg Phe Pro Ser Leu Asp Val Pro Phe Val Ser Cys Asp Leu Val Thr590 595 600 605tct ggt gat ctc caa gag ttt agt ccc ctt ggc att cgg cag tta atg 1873Ser Gly Asp Leu Gln Glu Phe Ser Pro Leu Gly Ile Arg Gln Leu Met610 615 620
cat tca acc atg aat gtc tgc acg cca atg aga ttg tgg ggc tcc cct 1921His Ser Thr Met Asn Val Cys Thr Pro Met Arg Leu Trp Gly Ser Pro625 630 635act cat gat gaa agc acg ggc gtt ttg ctg aag agt gct gcc aaa agc 1969Thr His Asp Glu Ser Thr Gly Val Leu Leu Lys Ser Ala Ala Lys Ser640 645 650ttc ata tgc acg cca tca ata ctg aag aaa cgt cac aga gat ctc ttg 2017Phe Ile Cys Thr Pro Ser Ile Leu Lys Lys Arg His Arg Asp Leu Leu655 660 665tct cct att cca gat aaa aga atc gag aag aaa tat ggg act gaa aag 2065Ser Pro Ile Pro Asp Lys Arg Ile Glu Lys Lys Tyr Gly Thr Glu Lys670 675 680 685gat cgt ggg gta tca gac aca tcc tcc acc ggc att caa aca agt tgt 2113Asp Arg Gly Val Ser Asp Thr Ser Ser Thr Gly Ile Gln Thr Ser Cys690 695 700atc aat gcc act aaa gat gat gca ctt ata act aca gtt ttg cgt att 2161Ile Asn Ala Thr Lys Asp Asp Ala Leu Ile Thr Thr Val Leu Arg Ile705 710 715gag cga tct gct tct tct aaa tct ctg gaa aag aaa ctt gtt ttc tct 2209Glu Arg Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Glu Lys Lys Leu Val Phe Ser720 725 730gat gaa aac aag gaa aat ttg ggc tac aca act gaa cag aca aaa gat 2257Asp Glu Asn Lys Glu Asn Leu Gly Tyr Thr Thr Glu Gln Thr Lys Asp735 740 745gga cag agt gct gga aat gac gaa cac atg gac gag cag aca aca ggg 2305Gly Gln Ser Ala Gly Asn Asp Glu His Met Asp Glu Gln Thr Thr Gly750 755 760 765gaa cgc agt tct gca aca aat gta gct act aat gat gac ctg tca ggc 2353Glu Arg Ser Ser Ala Thr Asn Val Ala Thr Asn Asp Asp Leu Ser Gly770 775 780aat tta caa cct gca ggt att ctt att gaa cac agc ggc gat gat ccc 2401Asn Leu Gln Pro Ala Gly Ile Leu Ile Glu His Ser Gly Asp Asp Pro785 790 795
att tcc cca gat tat ggc aaa aat acc atg aat cag aag ctg aac aca 2449Ile Ser Pro Asp Tyr Gly Lys Asn Thr Met Asn Gln Lys Leu Asn Thr800 805 810aat gtg aaa tct tta tca gtc tgt aag gag gga gtg tgt gct aaa tca 2497Asn Val Lys Ser Leu Ser Val Cys Lys Glu Gly Val Cys Ala Lys Ser815 820 825aag ccc act gaa ctc atc gtg gag aaa tct tca cca tgt ata aat gtg 2545Lys Pro Thr Glu Leu Ile Val Glu Lys Ser Ser Pro Cys Ile Asn Val830 835 840 845gat tat gaa tat gtg aac ata ttg gct gat acc cca ggt atc aaa aga 2593Asp Tyr Glu Tyr Val Asn Ile Leu Ala Asp Thr Pro Gly Ile Lys Arg850 855 860gga cta gaa tct cct tca gca tgg aag tcc cct tgg ttc gtc gat atg 2641Gly Leu Glu Ser Pro Ser Ala Trp Lys Ser Pro Trp Phe Val Asp Met865 870 875cat ttt cag ggt tca tac ttc acc agc cca gct gat agt tac gac gca 2689His Phe Gln Gly Ser Tyr Phe Thr Ser Pro Ala Asp Ser Tyr Asp Ala880 885 890cta gga ttg atg aag cag ata aat gtg cag act gct gct gct ttg gtg 2737Leu Gly Leu Met Lys Gln Ile Asn Val Gln Thr Ala Ala Ala Leu Val895 900 905gaa gcc cgt gag gta ctg gca agc ggc ggc caa tgt gac aac ata agc 2785Glu Ala Arg Glu Val Leu Ala Ser Gly Gly Gln Cys Asp Asn Ile Ser910 915 920 925tct gat aag gaa aac acg ggg aat cca gat gcc aag aag gaa cca ggg 2833Ser Asp Lys Glu Asn Thr Gly Asn Pro Asp Ala Lys Lys Glu Pro Gly930 935 940aca acc aaa ttg caa aca aaa atc atg gca gag ggt aga gtc ctg gat 2881Thr Thr Lys Leu Gln Thr Lys Ile Met Ala Glu Gly Arg Val Leu Asp945 950 955ttc gag tgt acc aca cct gaa aga tca tca gac aaa aat gct ggc agc 2929Phe Glu Cys Thr Thr Pro Glu Arg Ser Ser Asp Lys Asn Ala Gly Ser960 965 970
aat ctg gga aga tat ctg agc tca cct att cct tcg tcc cat ctt ctg 2977Asn Leu Gly Arg Tyr Leu Ser Ser Pro Ile Pro Ser Ser His Leu Leu975 980 985aaa agt ttt aga tag cttg2996Lys Ser Phe Arg990<210>32<211>993<212>PRT<213>稻<400>32Met Met Thr Ser Asp Asn Gly Lys Ala Pro Asp Lys Asp Gly Glu Pro1 5 10 15Ser Gly Pro Pro Ser Ala Pro Gln Glu Gly Glu Ile Ser Asn Glu Pro20 25 30Lys Arg Arg Arg Pro Leu Asn Gly Arg Thr Thr Gly Pro Thr Arg Arg35 40 45Ser Thr Lys Gly Asn Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ala Ile Leu Ser Arg50 55 60Ala Val Gln Thr Tyr Asn Gly Lys Asn Trp Lys Lys Ile Ala Glu Cys65 70 75 80Phe Pro Asp Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu His Arg Trp Gln Lys Val85 90 95Leu Asn Pro Glu Leu Val Lys Gly Pro Trp Ser Lys Glu Glu Asp Glu100 105 110
Ile Ile Val Gln Met Val Asn Lys Leu Gly Pro Lys Lys Trp Ser Thr115 120 125Ile Ala Gln Ala Leu Pro Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys Arg Glu Arg130 135 140Trp Tyr Asn His Leu Asn Pro Gly Ile Asn Lys Glu Ala Trp Thr Gln145 150 155 160Glu Glu Glu Ile Thr Leu Ile His Ala His Arg Thr Tyr Gly Asn Lys165 170 175Trp Ala Glu Leu Thr Lys Phe Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Ser Ile180 185 190Lys Asn His Trp Asn Ser Ser Val Lys Lys Lys Val Asn Ser Tyr Met195 200 205Ser Ser Gly Leu Leu Thr Gln Val Ser Cys Leu Pro Leu Asn Glu Tyr210 215 220Ser Ala Asn Cys Asn Ser Ser Pro Ala Met Thr Gln Gln Asn Ser Glu225 230 235 240Asp Ser Gly Cys Phe Ala Val Arg Glu Val Glu Asn Ser Ser Gly Cys245 250 255Ser Gln Ser Ser Leu Ala Lys Val Ser Cys Ser Gln Val His Asp Thr260 265 270Thr Val Pro Leu Gly Cys Asp Leu Gln Val Asn Ala Asn Phe Asp Lys275 280 285
Asn Glu Ala His Asp Ser Gln Ser Ser Met Gly Pro Gln Ala Cys Tyr290 295 300Thr Ser Ala Glu Ala Val Ala Ser Ala Leu Pro Ala Val His Cys His305 310 315 320Val Ser Ser Ser Asn Leu Asp Pro Asp Gln His Leu Gln Glu Asp Phe325 330 335Ala Gln Gly Leu Asn Leu Asp Met Thr Ile Asp Glu Met Pro Thr Val340 345 350Pro Ser Phe Ala Asp Asn Gln Thr Val Cys Ser Ile Glu Asn His Glu355 360 365Arg Ser Leu Glu Pro Tyr Asp Val Ala Met Glu Val Pro Leu Ser Met370 375 380Leu Ser Ser Asp Ser Gly Ala Glu Gln Lys Leu His Phe Met Ser Glu385 390 395 400Ala Asp Phe Asn Ser Pro Asn Cys Leu Lys Ser Glu Leu Trp Gln Asp405 410 415Ile Ser Leu Gln Gly Leu Leu Ser Gly Pro Asp Ala Val Glu Ala Asp420 425 430Ser Ile Ser Arg Ser Asn His Gln Ser Asp Val Tyr Ser Ser Glu Ala435 440 445Asp Thr His Phe Leu Ala Pro Pro Tyr Met Pro Gln Thr Ser Asn Ser450 455 460
Ser Ser Val Met Gly Leu Ala Asp Asp Gln Ser Pro Gln Met Ser Val465 470 475 480Pro Pro Ser Leu Ile Cys Ser Asn Ala Met Thr Asp Asp Ala Pro Phe485 490 495Asp Asn Arg Pro Gly Arg Lys Glu Met Pro Leu Ser Gln Ala Glu Val500 505 510Val Thr Gln Ser Ser Ser Ser Ser Gly Asp Ala Glu Met Phe Ala Asn515 520 525Pro Gly Cys Ser Asn Asp Arg His Val Pro Ser Ser Thr Met Glu Ser530 535 540Ile Pro Glu Cys Gly Asp Gln Gln Val Thr Asn Ala Glu Glu Pro Glu545 550 555 560Ala Ser Leu Glu Lys Glu Pro Ser Leu Thr Gln Ser Val Thr Ala Pro565 570 575Asp Glu Gln Asp Lys Gly Ala Leu Phe Tyr Glu Pro Pro Arg Phe Pro580 585 590Ser Leu Asp Val Pro Phe Val Ser Cys Asp Leu Val Thr Ser Gly Asp595 600 605Leu Gln Glu Phe Ser Pro Leu Gly Ile Arg Gln Leu Met Hi s Ser Thr610 615 620Met Asn Val Cys Thr Pro Met Arg Leu Trp Gly Ser Pro Thr His Asp625 630 635 640
Glu Ser Thr Gly Val Leu Leu Lys Ser Ala Ala Lys Ser Phe Ile Cys645 650 655Thr Pro Ser Ile Leu Lys Lys Arg His Arg Asp Leu Leu Ser Pro Ile660 665 670Pro Asp Lys Arg Ile Glu Lys Lys Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Arg Gly675 680 685Val Ser Asp Thr Ser Ser Thr Gly Ile Gln Thr Ser Cys Ile Asn Ala690 695 700Thr Lys Asp Asp Ala Leu Ile Thr Thr Val Leu Arg Ile Glu Arg Ser705 710 715 720Ala Ser Ser Lys Ser Leu Glu Lys Lys Leu Val Phe Ser Asp Glu Asn725 730 735Lys Glu Asn Leu Gly Tyr Thr Thr Glu Gln Thr Lys Asp Gly Gln Ser740 745 750Ala Gly Asn Asp Glu His Met Asp Glu Gln Thr Thr Gly Glu Arg Ser755 760 765Ser Ala Thr Asn Val Ala Thr Asn Asp Asp Leu Ser Gly Asn Leu Gln770 775 780Pro Ala Gly Ile Leu Ile Glu His Ser Gly Asp Asp Pro Ile Ser Pro785 790 795 800Asp Tyr Gly Lys Asn Thr Met Asn Gln Lys Leu Asn Thr Asn Val Lys805 810 815
Ser Leu Ser Val Cys Lys Glu Gly Val Cys Ala Lys Ser Lys Pro Thr820 825 830Glu Leu Ile Val Glu Lys Ser Ser Pro Cys Ile Asn Val Asp Tyr Glu835 840 845Tyr Val Asn Ile Leu Ala Asp Thr Pro Gly Ile Lys Arg Gly Leu Glu850 855 860Ser Pro Ser Ala Trp Lys Ser Pro Trp Phe Val Asp Met His Phe Gln865 870 875 880Gly Ser Tyr Phe Thr Ser Pro Ala Asp Ser Tyr Asp Ala Leu Gly Leu885 890 895Met Lys Gln Ile Asn Val Gln Thr Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Arg900 905 910Glu Val Leu Ala Ser Gly Gly Gln Cys Asp Asn Ile Ser Ser Asp Lys915 920 925Glu Asn Thr Gly Asn Pro Asp Ala Lys Lys Glu Pro Gly Thr Thr Lys930 935 940Leu Gln Thr Lys Ile Met Ala Glu Gly Arg Val Leu Asp Phe Glu Cys945 950 955 960Thr Thr Pro Glu Arg Ser Ser Asp Lys Asn Ala Gly Ser Asn Leu Gly965 970 975Arg Tyr Leu Ser Ser Pro Ile Pro Ser Ser His Leu Leu Lys Ser Phe980 985 990
Arg<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NtmybA1/A2的RT-PCR引物<400>33gtacaatgct tgcaccggtg g 21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NtmybA1/A2的RT-PCR引物<400>34tgtagactgg gaacagccag c 21<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EF1α的RT-PCR引物<400>35agaccaccaa gtactactgc 20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>EF1α的RT-PCR引物<400>36gtcaagagcc tcaaggagag 20<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VIGS A1 DNA的PCR引物<400>37atagttctgt taaaaagaaa ctg 23<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VIGS A1 DNA的PCR引物<400>38taacattgaa caagaaacat cttg24<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VIGS A2 DNA的PCR引物<400>39acaaagtctt ctctaactac g 21
<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VIGS A2 DNA的PCR引物<400>40agcttcgagt cgtctagcg 19<210>41<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>41ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc aattaaccct cactaaaggg50<210>42<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>42ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gtaatacgac tcactatagg gc 52<210>43<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸
<400>43ccgtcgacta tgcagcctcg tcaaacataa 30<210>44<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>44ccgtcgacta ccacagccta aatggagta 29<210>45<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>45ccgtcgacta tatgctcgaa ttttcgttca c31<210>46<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>46ccgtcgacta gcattctgaa gcttcctcc 29<210>47<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>47ccgtcgacta ctttttgacg gaactattcc 30<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>48tatccttcgc aagacccttc20<210>49<211>788<212>PRT<213>稻<400>49Met Thr Ser Asp Asn Gly Lys Ala Pro Asp Lys Asp Gly Glu Pro Ser1 5 10 15Gly Pro Pro Ser Ala Pro Gln Glu Gly Glu Ile Ser Asn Glu Pro Lys20 25 30Arg Arg Arg Pro Leu Asn Gly Arg Thr Thr Gly Pro Thr Arg Arg Ser35 40 45Thr Lys Gly Asn Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala50 55 60Val Gln Thr Tyr Asn Gly Lys Asn Trp Lys Lys Ile Ala Glu Cys Phe
65 70 75 80Pro Asp Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu His Arg Trp Gln Lys Val Leu85 90 95Asn Pro Glu Leu Val Lys Gly Pro Trp Ser Lys Glu Glu Asp Glu Ile100 105 110Ile Val Gln Met Val Asn Lys Leu Gly Pro Lys Lys Trp Ser Thr Ile115 120 125Ala Gln Ala Leu Pro Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp130 135 140Tyr Asn His Leu Asn Pro Gly Ile Asn Lys Glu Ala Trp Thr Gln Glu145 150 155 160Glu Glu Ile Thr Leu Ile His Ala His Arg Met Tyr Gly Asn Lys Trp165 170 175Ala Glu Leu Thr Lys Phe Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Ser Ile Lys180 185 190Asn His Trp Asn Ser Ser Val Lys Lys Lys Val Asn Ser Tyr Met Ser195 200 205Ser Gly Leu Leu Thr Gln Val Ser Cys Leu Pro Leu Asn Glu Tyr Ser210 215 220Ala Asn Cys Asn Ser Ser Pro Ala Met Thr Gln Gln Asn Ser Glu Asp225 230 235 240Ser Gly Cys Phe Ala Val Arg Glu Val Glu Asn Ser Ser Gly Cys Ser
245 250 255Gln Ser Ser Leu Ala Lys Val Ser Cys Ser Gln Val His Asp Thr Thr260 265 270Val Pro Leu Gly Cys Asp Leu Gln Val Asn Ala Asn Phe Asp Lys Asn275 280 285Glu Ala His Asp Ser Gln Ser Ser Met Gly Pro Gln Ala Cys Tyr Thr290 295 300Ser Ala Glu Ala Val Ala Ser Ala Leu Pro Ala Val His Cys His Val305 310 315 320Ser Ser Ser Asn Leu Asp Pro Asp Gln His Leu Gln Glu Asp Phe Ala325 330 335Gln Gly Leu Asn Leu Asp Met Thr Ile Asp Glu Met Pro Thr Val Pro340 345 350Ser Phe Ala Asp Asn Gln Thr Val Cys Ser Ile Glu Asn His Glu Arg355 360 365Ser Leu Glu Pro Tyr Asp Val Ala Met Glu Val Pro Leu Ser Met Leu370 375 380Ser Ser Asp Ser Gly Ala Glu Gln Lys Leu His Phe Met Ser Glu Ala385 390 395 400Asp Phe Asn Ser Pro Asn Cys Leu Lys Ser Glu Leu Trp Gln Asp Ile405 410 415Ser Leu Gln Gly Leu Leu Ser Gly Pro Asp Ala Val Glu Ala Asp Ser
420 425 430Ile Ser Arg Ser Asn His Gln Ser Asp Val Tyr Ser Ser Glu Ala Asp435 440 445Thr His Phe Leu Ala Pro Pro Tyr Met Pro Gln Thr Ser Asn Ser Ser450 455 460Ser Val Met Gly Leu Ala Asp Asp Gln Ser Pro Gln Met Ser Val Pro465 470 475 480Pro Ser Leu Ile Cys Ser Asn Ala Met Thr Asp Asp Ala Pro Phe Asp485 490 495Asn Arg Pro Gly Arg Lys Glu Met Pro Leu Ser Gln Ala Glu Val Val500 505 510Thr Gln Ser Ser Ser Ser Ser Gly Asp Ala Glu Met Phe Ala Asn Pro515 520 525Gly Cys Ser Asn Asp Arg His Val Pro Ser Ser Thr Met Glu Ser Ile530 535 540Pro Glu Cys Gly Asp Gln Gln Val Thr Asn Ala Glu Glu Pro Glu Ala545 550 555 560Ser Leu Glu Lys Glu Pro Ser Leu Thr Gln Ser Val Thr Ala Pro Asp565 570 575Glu Gln Asp Lys Gly Ala Leu Phe Tyr Glu Pro Pro Arg Phe Pro Ser580 585 590Leu Asp Val Pro Phe Val Ser Cys Asp Leu Val Thr Ser Gly Asp Leu
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Ala Val Leu Arg Ser Ala Ala Lys Thr Phe Thr Ser Thr Pro Ser Ile645 650 655tta aag aag cga cac cgt gat ttg gtg tca cct ttg tca gaa aag aga 2016Leu Lys Lys Arg His Arg Asp Leu Val Ser Pro Leu Ser Glu Lys Arg660 665 670tgt gaa aag aag ctt gga agt gat ttc cgt caa gaa tca ttc tct gat 2064Cys Glu Lys Lys Leu Gly Ser Asp Phe Arg Gln Glu Ser Phe Ser Asp675 680 685ctg tct aag gat ttt tct cga cta gat gtt atg ttt gac gag gct gca 2112Leu Ser Lys Asp Phe Ser Arg Leu Asp Val Met Phe Asp Glu Ala Ala690 695 700aat gaa aaa gca aca aag tct tct cta act acg gat caa aca ttg gaa 2160Asn Glu Lys Ala Thr Lys Ser Ser Leu Thr Thr Asp Gln Thr Leu Glu705 710 715 720ctt gaa gct tca tct gaa gat aaa gaa aac ata aat cca act gaa gat 2208Leu Glu Ala Ser Ser Glu Asp Lys Glu Asn Ile Asn Pro Thr Glu Asp725 730 735gga agt aag gag gag gac aag gta cgt aat gga ctt tcc aac gag aga 2256Gly Ser Lys Glu Glu Asp Lys Val Arg Asn Gly Leu Ser Asn Glu Arg740 745 750cag tta gat gga ggt gaa gtt cac tat aaa gag aaa gga aca agg gag 2304Gln Leu Asp Gly Gly Glu Val His Tyr Lys Glu Lys Gly Thr Arg Glu755 760 765ggc aca aag ggt gga gcc aat agt gca att gga aag ata aaa caa cct 2352Gly Thr Lys Gly Gly Ala Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Lys Gln Pro770 775 780tct gga gtt ctg gtt gaa ctg aac gca agt gac ctg ttc ttc tct cct 2400Ser Gly Val Leu Val Glu Leu Asn Ala Ser Asp Leu Phe Phe Ser Pro785 790 795 800gat cgt ttt gga gcc aag tct ggt aga gct aca tat ctc agc agt aaa 2448Asp Arg Phe Gly Ala Lys Ser Gly Arg Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Lys805 810 815gct cta gga aat cag tac gct aga cga ctc gaa gct gca tca aat caa 2496
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450 455 460Met Arg Lys Ser Leu Leu Leu Glu Thr Thr Asp Asn Cys Ser Asp Asp465 470 475 480Glu Glu Leu Gly Leu Asn Gly Asn Ala Phe Asn Leu Ser Pro Pro Tyr485 490 495Arg Leu Arg Ala Lys Arg Thr Ala Val Ile Lys Ser Arg Gln Leu Glu500 505 510Phe Thr Ser Glu Lys Glu Lys Gln Pro Asp Asn Glu Ile Glu Phe Thr515 520 525Ser Ala Lys Glu Lys Gln Pro Asp Asn Glu Ile Lys Thr Ser Glu Glu530 535 540Asp Lys Pro Val545<210>79<211>599<212>PRT<213>展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)<400>79Met Ser Asp Thr Val Glu Phe Tyr Leu Ile Thr Arg Ser Ile Ile Lys1 5 10 15Val Lys Asn Phe Arg Arg Thr Gly Gly Pro Thr Arg Arg Ser Ser Lys20 25 30Gly Gly Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Thr Leu Arg Arg Ala Val Gln35 40 45
Cys Phe Asn Gly Lys Asn Trp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Phe Thr Asp50 55 60Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu His Arg Trp Gln Lys Val Leu Asn Pro65 70 75 80Asp Leu Val Lys Gly Ala Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Arg Ile Met85 90 95Glu Leu Val Asn Lys Tyr Gly Ala Lys Lys Trp Ser Val Ile Ala Gln100 105 110Asn Leu Pro Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp His Asn115 120 125His Leu Asn Pro Ser Ile Lys Arg Glu Ala Trp Thr Gln Gln Glu Asp130 135 140Leu Ala Leu Ile Arg Ala His Gln Leu Tyr Gly Asn Lys Trp Ala Glu145 150 155 160Ile Ala Lys Phe Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Ser Ile Lys Asn His165 170 175Trp Asn Ser Thr Met Lys Lys Lys Val Asp Pro Leu Thr Ala Asn Asp180 185 190Pro Ile Ser Arg Ala Leu Ala Ala Tyr Gln Ala Gln Gln Glu Gln Ser195 200 205Met Asn Ser Gly Ser Gly Val Gly Gln Val Asp Ser Gly Ser Ile Gly210 215 220
Gly Arg Thr Gly Pro Pro Met Ser Glu Thr Thr Thr Ser Ser Asp Pro225 230 235 240Ser Arg His Asn Ser Asn Thr Arg Gly Leu Gly Arg Thr Ser His Tyr245 250 255Val Glu Gln Asp Thr Lys Ser Thr Gly Ser Ala Pro Pro Pro Pro Tyr260 265 270Pro Asp Thr Tyr Pro Asn Arg Gly Lys Asp Gln Gln Arg Asn Ala Ser275 280 285His Leu Gln Pro Lys Lys Glu Glu Ser Asp His Asp Leu Ile Gly Gln290 295 300Ser Leu Gly Phe Ser Gly Trp Ser Ser Gly Gln Leu Pro Val Tyr Ser305 310 315 320Gly Gly Phe Ser Gly Val Ser Leu Gly Thr Ser Ser Leu Ser Asn Ser325 330 335Val Thr Glu Gln Leu Val Pro Ser Val Gln His Lys Arg Ala Met Ser340 345 350Asn Ile Glu Leu Thr Arg Ile Ala Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Arg355 360 365Ile Pro Ala Pro Glu Ser Ser Ser Gln Ala Tyr Arg Ser Ser Ser Met370 375 380Ser Val Pro Leu Pro Asp Leu Gly Ser Leu Phe Ala Ser Ser His Met385 390 395 400
Pro Met Ala Ala His Asn Asp Thr Gln Pro Leu Ser Ser Phe Asn Gly405 410 415Thr Gly Val Pro Pro Gly Glu Glu Thr Leu Ala Met Met Gly Ser Lys420 425 430Gln Asn Tyr Glu Pro Leu Arg Arg Cys Asn Leu Pro Pro Ser Gln Pro435 440 445Ser Glu Gly Asp Ala Ala Phe Glu Asp Ser Gly Ala Ser Val Arg Cys450 455 460Asp Ser Gln Met Ala Glu Pro Met Asp Lys Ala Met Asp Gln Asp Val465 470 475 480Ser Glu Phe Pro Ser Asp Asn Leu Leu Arg Asp Ser Ser Glu Ala Val485 490 495Asn Glu Tyr Gln Ser Gln Ser Pro Met Leu Thr Glu Glu Asp Leu Glu500 505 510Asp Lys Gly Asp Ser Ser Arg Val Gln Asp Arg Asp Gly Leu Phe Tyr515 520 525Glu Pro Pro Arg Ile Val Asp Pro Pro Phe Met Asn Tyr Asp Leu Val530 535 540Ser Ser Leu Asn Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Val Arg Gln Met Ile Met545 550 555 560Pro Ala Gly Asn Cys Ile Thr Pro Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Pro Phe565 570 575
Gln Gly Lys Ser Pro Gln Ser Lys Leu Arg Ser Ala Ala Lys Ser Phe580 585 590Ser Gly Ser Pro Ser Ile Leu595<210>80<211>254<212>PRT<213>Adiantum raddianum<400>80Asp Leu Leu Lys Asp Arg Ser Asp Val Gln Cys Leu His Arg Trp Gln1 5 10 15Lys Val Leu Asn Pro Asn Leu Val Lys Gly Pro Trp Thr Lys Glu Glu20 25 30Asp Glu Lys Ile Ala Glu Leu Val Asn Lys Asn Gly Pro Lys Lys Trp35 40 45Ser Val Val Ala Arg Ser Leu Pro Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys Arg50 55 60Glu Arg Trp His Asn His Leu Asp Pro His Ile Lys Lys Asp Ala Trp65 70 75 80Thr Pro Glu Glu Glu Gln Ala Leu Ile Glu Ala His Gln Arg Asn Gly85 90 95Asn Lys Trp Ala Glu Ile Ala Lys Ser Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn100 105 110
Ala Ile Lys Asn His Trp Asn Ser Ser Leu Lys Lys Lys Leu Glu Phe115 120 125Thr Asn Leu His Arg Pro Val Leu Asp Arg Leu Lys Glu Leu Glu Gly130 135 140Val Ser Ser Gly Val Gly Ser Thr Ile Gly Val Ser Arg Ser Asp Cys145 150 155 160His Thr Glu Leu Ala Glu Arg Val Gly Ala Ser Ala Gly Phe Ser Lys165 170 175Pro Gly Gln Ser Glu Lys Ala Gly Glu Asn Ser Phe Asn Arg Ile Arg180 185 190Asp Thr Asn Arg Asn Arg His Leu Ala Gly Pro Gly Ala Leu Gly Gly195 200 205Ser Asn Cys Leu Ser Pro Phe Arg Thr Glu Ser Val Met Leu Ser Asn210 215 220Gln Arg Cys Ser Ser Ile Arg Asn Gly Ser Thr Leu Leu Val Ala Ala225 230 235 240Arg Leu Asn Gln Val Ala Ala Glu Asn Asp Val Ala Ser Thr245 250<210>81<211>197<212>PRT<213>大麦(Hordeum vulgare)<400>81
Glu Cys Phe Pro Gly Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu His Arg Trp Gln1 5 10 15Lys Val Leu Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gly Pro Trp Ser Lys Glu Glu20 25 30Asp Asp Ile Ile Val Glu Met Val Lys Lys Tyr Gly Pro Lys Lys Trp35 40 45Ser Thr Ile Ala Gln Ala Leu Pro Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys Arg50 55 60Glu Arg Trp His Asn His Leu Asn Pro Gly Ile Asn Lys Asp Ala Trp65 70 75 80Thr Gln Glu Glu Glu Ile Thr Leu Ile His Ala His Arg Met Tyr Gly85 90 95Asn Lys Trp Ala Glu Leu Thr Lys Phe Leu Pro Gly Lys Thr Asp Asn100 105 110Ser Ile Lys Asn His Trp Asn Ser Ser Val Lys Lys Lys Ile Gly Ser115 120 125Tyr Met Ser Ser Gly Leu Leu Ala Gln Val Ser Arg Leu Pro Leu Val130 135 140Glu His His Ala His Phe Ser Ser Ser Pro Ala Ile Thr Gln Gln Asn145 150 155 160Ser Glu Asp Ser Glu Ser Asn Ala Val Arg Glu Val Glu Asp Ser Ser165 170 175
Gly Cys Ser Gln Ser Ser Leu Gly Ile Val Ser Ser Arg Lys Cys Arg180 185 190His Ala Ser Leu Gly195<210>82<211>98<212>PRT<213>黑麦(Secale cereale)<400>82Pro Glu Leu Val Lys Gly Pro Trp Ser Lys Glu Glu Asp Asp Val Ile1 5 10 15Ile Gln Met Val Lys Lys Tyr Gly Pro Thr Lys Trp Ser Thr Ile Ala20 25 30Gln Ala Leu Pro Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp His35 40 45Asn His Leu Asn Pro Gly Ile Asn Lys Asp Ala Trp Thr Gln Glu Glu50 55 60Glu Ile Arg Leu Ile Gln Ala His Arg Ile Tyr Gly Asn Lys Trp Ala65 70 75 80Glu Leu Ser Lys Phe Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn85 90 95His Trp<210>83
<211>566<212>PRT<213>虞美人(Papaver rhoeas)<400>83Ser Ser Pro Ser Pro Ala Ile Lys Ser Ser Asp Glu Ser Glu Lys Ile1 5 10 15Val Asp Met Asp Asp Asp Ala Glu Met Met Val Asp Val Asp Val Asp20 25 30Val Asp Val Asp Val Glu Val Arg Cys Leu Glu Asn Lys Gln Glu Thr35 40 45Pro Asn Ser Ser Ser Ser Val Ser Asp Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn50 55 60Cys Ser Gly Ser Ser Leu Ser Val Arg Ser Ala Ser Ser Asn Arg Arg65 70 75 80IIe Ser Gly Pro Ile Arg Arg Ala Lys Gly Gly Trp Thr Pro Glu Glu85 90 95Asp Glu Lys Leu Arg Lys Ala Val Glu Ser Phe Lys Gly Lys Asn Trp100 105 110Lys Lys Ile Ala Ala Cys Leu Pro His Arg Thr Glu Leu Gln Cys Leu115 120 125His Arg Trp Gln Lys Val Leu His Pro Asp Leu Val Lys Gly Pro Trp130 135 140Thr Leu Glu Glu Asp Asp Lys Ile Met Glu Leu Val Ser Lys Tyr Gly145 150 155 160
Pro Ser Lys Trp Ser Leu Ile Ala Lys Glu Leu Pro Gly Arg Ile Gly165 170 175Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp His Asn His Leu Asn Pro Glu Ile Lys180 185 190Arg Asp Ala Trp Thr Val Glu Glu Glu Val Ala Leu Met Asn Ala His195 200 205Arg Leu Tyr Gly Asn Lys Trp Ala Glu Ile Ala Lys Val Leu Pro Gly210 215 220Arg Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn Leu Trp Asn Ser Ser Leu Lys Lys225 230 235 240Lys Leu Asp Phe Tyr Leu Ser Ser Gly Gln Leu Pro Pro Leu Gly Pro245 250 255Val Leu Lys Thr Glu Asp Tyr Ala Leu Ala Met Ser Arg Ser SeT Ala260 265 270Ala Gly Asn Ser Ile Ile Cys Leu Asp Glu Glu Ile Asn Thr Gly Thr275 280 285Gln Arg Ser Leu Glu Lys Asp Asp Ser Asn Lys Phe Gly Glu Gly Thr290 295 300Met Val Leu Val Gln Pro Ser Thr Pro Glu Phe Leu Asp Arg Glu Val305 310 315 320Pro Thr Gly Val Arg Ala Ile Lys Ser Ser Asn Ser Asp Asp Ile Glu325 330 335
Gly Lys Gln Leu Ala Ser Glu Asn Tyr Tyr Ser Cys Ser Lys Ser Phe340 345 350Ser Thr Pro Asn Pro Val Gln Tyr Arg Ser Ser Ala Val Ala Asp Pro355 360 365Glu Lys Asn Ile Ala Ala Thr Thr Leu Gln Met Ala Val Pro Val Ser370 375 380Ser Pro Ser Leu Phe Glu Met Ser Asp Ser Asn Ser Val Leu Ser Pro385 390 395 400Ser Ser Phe Leu Thr Pro Pro Arg Ile Arg Asn Asn Gly Leu Asp Leu405 410 415Gln Ser Ala Glu Ser Ile Leu Lys Asn Ala Ala Lys Ser Phe Gln Asn420 425 430Thr Pro Ser Ile Leu Arg Lys Arg Arg Arg Glu Ala Gly Gly Thr Pro435 440 445Asn Arg Ile Val Gln Thr Asn Gly Leu Thr Ala Glu Asp Lys Leu His450 455 460Ser Leu Glu Arg Glu Lys Ile Glu Asp Cys Lys Glu Thr Pro Gly Ser465 470 475 480Met Glu Ser Asn Ser Ser Thr Gly Arg Val Asn Ser Thr Ile Arg Leu485 490 495Phe Tyr Thr Arg Lys Lys His Arg Pro Cys Arg Ser Arg Val Glu Arg500 505 510
Pro Asp Ala Cys Lys Ser Leu Glu Lys Gln Leu Glu Ser Thr Leu Asp515 520 525Gly Val Asn Thr Gly Asn Ser Gln Tyr Glu Ser Met Lys Ser Ala Ser530 535 540Asp Gln Gln Gly Lys Ser Thr Thr Lys Glu Asp Gly His Asp Pro Leu545 550 555 560Gln Asn Ser Val Ala Ser565<210>84<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>84cccaagctta aattcggaca aatagagcgt agtcaac 37<210>85<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>85gccatcttct ctcctccgta taagag 26<210>86<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>86cccaagcttc tcgttaagaa cccttgatc 29<210>87<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>87gccatcttct acacacaaaa tcgaaacc 28<210>88<211>640<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>88Met Ala Arg Arg Pro Arg His Ser Ile Tyr Ser Ser Asp Glu Asp Asp1 5 10 15Glu Asp Phe Glu Met Cys Asp His Asp Tyr Asp Gly Leu Leu Pro Lys20 25 30Ser Gly Lys Arg His Leu Gly Lys Thr Arg Trp Thr Arg Glu Glu Asp35 40 45Glu Lys Leu Lys Lys Leu Val Glu Gln Asn Gly Thr Asp Asp Trp Lys50 55 60
Val Ile Ala Asn Tyr Leu Pro Asn Arg Thr Asp Val Gln Cys Gln His65 70 75 80Arg Trp Gln Lys Val Leu Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gly Pro Trp Thr85 90 95Lys Glu Glu Asp Gln Arg Val Ile Glu Leu Val Gln Lys Tyr Gly Pro100 105 110Lys Arg Trp Ser Val Ile Ala Lys His Leu Lys Gly Arg Ile Gly Lys115 120 125Gln Cys Arg Glu Arg Trp His Asn His Leu Asn Pro Glu Val Lys Lys130 135 140Thr Ser Trp Thr Glu Glu Glu Asp Arg Ile Ile Tyr Gln Ala His Lys145 150 155 160Arg Leu Gly Asn Arg Trp Ala Glu Ile Ala Lys Leu Leu Pro Gly Arg165 170 175Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn His Trp Asn Ser Thr Met Arg Arg Lys180 185 190Val Glu Gln Glu Gly Tyr Leu Gln Glu Ser Ser Lys Ala Ser Gln Pro195 200 205Ala Val Ala Thr Ser Phe Gln Lys Asn Ser His Leu Met Gly Phe Ala210 215 220Gln Ala Pro Pro Thr Ala Gln Leu Pro Ala Thr Gly Gln Pro Thr Val225 230 235 240
Asn Asn Asp Tyr Ser Tyr Tyr His Ile Ser Glu Ala Gln Asn Val Ser245 250 255Ser His Val Pro Tyr Pro Val Ala Leu His Val Asn Ile Val Asn Val260 265 270Pro Gln Pro Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg His Tyr Asn Asp Glu Asp275 280 285Pro Glu Lys Glu Lys Arg Ile Lys Glu Leu Glu Leu Leu Leu Met Ser290 295 300Thr Glu Asn Glu Leu Lys Gly Gln Gln Val Leu Pro Thr Gln Asn His305 310 315 320Thr Cys Ser Tyr Pro Gly Trp His Ser Thr Thr Ile Ala Asp His Thr325 330 335Arg Pro His Gly Asp Ser Ala Pro Val Ser Cys Leu Gly Glu His His340 345 350Ser Thr Pro Ser Leu Pro Ala Asp Pro Gly Ser Leu Pro Glu Glu Ser355 360 365Ala Ser Pro Ala Arg Cys Met Ile Val His Gln Gly Thr Ile Leu Asp370 375 380Asn Val Lys Asn Leu Leu Glu Phe Ala Glu Thr Leu Gln Phe Ile Asp385 390 395 400Ser Phe Leu Asn Thr Ser Ser Asn His Glu Asn Ser Asp Leu Glu Met405 410 415
Pro Ser Leu Thr Ser Thr Pro Leu Ile Gly Hi s Lys Leu Thr Val Thr420 425 430Thr Pro Phe His Arg Asp Gln Thr Val Lys Thr Gln Lys Glu Asn Thr435 440 445Val Phe Arg Thr Pro Ala Ile Lys Arg Ser Ile Leu Glu Ser Ser Pro450 455 460Arg Thr Pro Thr Pro Phe Lys His Ala Leu Ala Ala Gln Glu Ile Lys465 470 475 480Tyr Gly Pro Leu Lys Met Leu Pro Gln Thr Pro Ser His Leu Val Glu485 490 495Asp Leu Gln Asp Val Ile Lys Gln Glu Ser Asp Glu Ser Gly Ile Val500 505 510Ala Glu Phe Gln Glu Asn Gly Pro Pro Leu Leu Lys Lys Ile Lys Gln515 520 525Glu Val Glu Ser Pro Thr Asp Lys Ser Gly Asn Phe Phe Cys Ser His530 535 540His Trp Glu Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gln Leu Phe Thr Gln Thr Ser545 550 555 560Pro Val Ala Asp Ala Pro Asn Ile Leu Thr Ser Ser Val Leu Met Ala565 570 575Pro Ala Ser Glu Asp Glu Asp Asn Val Leu Lys Ala Phe Thr Val Pro580 585 590
Lys Asn Arg Ser Leu Ala Ser Pro Leu Gln Pro Cys Ser Ser Thr Trp595 600 605Glu Pro Ala Ser Cys Gly Lys Met Glu Glu Gln Met Thr Ser Ser Ser610 615 620Gln Ala Arg Lys Tyr Val Asn Ala Phe Ser Ala Arg Thr Leu Val Met625 630 635 640<210>89<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的氨基酸序列<400>89Thr Pro Ser Ile Leu Lys Lys Arg His Arg1 5 10<210>90<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的氨基酸序列，X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)
<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>X代表任一氨基酸残基<400>90Asn Xaa Xaa Thr Pro Xaa Arg Leu Trp Xaa1 5 10<210>91<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的氨基酸序列，X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>X代表任一氨基酸残基<400>91Pro Pro Arg Phe Pro Ser Xaa Asp Xaa Pro Phe
1 5 10<210>92<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的氨基酸序列，在位置3、4、7和8处X代表任一氨基酸残基，在位置2处X代表S或T，在位置6处X代表D或E，在位置9处X代表L或I或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>X代表S或T<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)<223>X代表D或E<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>X代表L或I或V<400>92Trp Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>93<211>150<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的氨基酸序列，在位置16和93处X代表H，W，Y或F，在位置19，67，102，123，129，134 & 150处X代表K，H或R，在位置32，54，77，135，138 & 146处X代表S，T，G，C或A，在位置33 & 110处X代表D或E，在位置34，49，61，65，76 & 127处X代表L，I或V，在其它位置处的X代表任一残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(8)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(12)<223>X代表任一氨基酸残基
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(15)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(23)..(23)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(26)..(30)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(45)..(45)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(47)..(47)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(52)..(52)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(55)..(55)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(59)..(60)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(62)..(64)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(66)..(66)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(68)..(68)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(70)..(71)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(75)..(75)
<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(78)..(81)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(97)..(97)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(99)..(99)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(101)..(101)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(103)..(104)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(107)..(108)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(111)..(112)<223>X代表任一氨基酸残基
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(114)..(116)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(118)..(120)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(128)..(128)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(130)..(130)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(132)..(132)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(142)..(142)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(144)..(144)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(147)..(147)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>X代表H或W或Y或F<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(93)..(93)<223>X代表H或W或Y或F<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>X代表K或H或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(123)..(123)<223>X代表K或H或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(102)..(102)<223>X代表K或H或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(67)..(67)<223>X代表K或H或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(129)..(129)
<223>X代表K或H或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(134)..(134)<223>X代表K或H或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(150)..(150)<223>X代表K或H或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>X代表S或T或G或C或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(135)..(135)<223>X代表S或T或G或C或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(138)..(138)<223>X代表S或T或G或C或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(146)..(146)<223>X代表S或T或G或C或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>X代表D或E
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(110)..(110)<223>X代表D或E<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>X代表L或I或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(49)..(49)<223>X代表L或I或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(76)..(76)<223>X代表L或I或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(127)..(127)<223>X代表L或I或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(54)..(54)<223>X代表S或T或G或C或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(77)..(77)<223>X代表S或T或G或C或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(61)..(61)<223>X代表L或I或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(65)..(65)<223>X代表L或I或V<400>93Trp Thr Xaa Glu Glu Asp Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Gly Xaa Xaa Trp Lys Xaa Ile Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa20 25 30Xaa Xaa Gln Cys Leu His Arg Trp Gln Lys Val Leu Xaa Pro Xaa Leu35 40 45Xaa Lys Gly Xaa Trp Xaa Xaa Glu Glu Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Lys Trp Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70 75 80Xaa Gly Arg Ile Gly Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp Xaa Asn His Leu85 90 95Xaa Pro Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Thr Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa100 105 110Leu Xaa Xaa Xaa Hi s Xaa Xaa Xaa Gly Asn Xaa Trp Ala Glu Xaa Xaa115 120 125
Xaa Xaa Leu Xaa Gly Xaa Xaa Asp Asn Xaa Ile Lys Asn Xaa Trp Xaa130 135 140Ser Xaa Xaa Lys Lys Xaa145 150<210>94<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的氨基酸序列，在位置4处的X代表K或R，在位置11处的X代表L或V，在位置12处的X代表S或T，在位置14处的X代表L、I或V，在位置16 & 20处的X代表D或E，在其它位置的X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>X代表K或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>X代表K或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>X代表L或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>X代表S或T<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>X代表L或I或V<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>X代表D或E<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>X代表D或E<400>94Ser Ile Leu Xaa Lys Arg Xaa Arg Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15Xaa Arg Xaa Xaa Lys Lys20<210>95<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>设计的氨基酸序列，在位置7处的X代表K或R或D或E或H，在位置5处的X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>X代表任一氨基酸残基<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X代表K或R或D或E或H<400>95Ser Cys Ser Ser Xaa Ser Xaa1 5<210>96<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>96aactgcagcg gataaaccaa ttttcaaatg ata 33
<210>97<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>97cgggatccct ttgatcctct ccgatctctc tat 33<210>98<211>1700<212>DNA<213>拟南芥菜<400>98cggataaacc aattttcaaa tgataatatt tgtatataat gtttctgtat acaggggcgg 60acccacgtta gtcttgggtg gggcatgtgc ccgatactca attctataaa tcttatataa120gtttgcatta tgtaattaaa aatgtattta gtttagtggt tttttactta atggtgcccc180acattaaccc aagtttaaac cttgctgatg tctttttatt gattttttat aactgtaccc240atataagatt atttcctgga ttagccatct gtatattaat aaatcgtttc ctgtggttgt300gcgatgcata accgtccaag aaagtcgtat atttttaata catgtgttaa aataggtttt360aagtgagaat ttttttaact tgtggagtgt ggagtgtaga gtgtagatgt acattaccta420tatatttatc caattctgtg taataaagat gttggggcgg cgcctgctgc cacatacaca480ttggattaga agggcaaaag aagttctaat aaggagcaaa ctaatagcca tgaaaattat540gaatttacca tactgaaaac aaaggaatta aggttttgaa ttcaatactt gttttgttat600atatgatgtt gatgtgacgt atttgtgcgt ttctcatagt gactttgaaa ggaaggctaa660acgaatttgc agtaaaagta acagaagaaa cacttcaaaa ttgaattaaa atgaagaaaa720
aaaagaatga gaaaaagtga gaagtggtgg ttgtctggta ttaagggtac tcacttctct780ccttttcaac acagcccgac acacatgtct cttttttttt ttttcataca cacatttcta840tttattagtt tcctaaaata aaaattataa aacaaaaagc acacccaccc ataaactaaa900gcttttctct ctcatcccac tacaaatctt atatacaagt ttcgcaaatc ttgactcttc960acgttgtgga tctatctaga gagataagta agagagagga agagtaagga agaaagtggt 1020tgaactgtag cagagtctga ggtttgaatc ttgtagttcc cattgaagca tgcttcaccg 1080ttttttccga aggaagttac tcatccactg agagagaaag agggatttgg agatagagaa 1140agaaatttct cagatgggtt tgtgagaatt cacagcaaga gcaagaaact cctatatctt 1200cctttgcttc cagagaccag cgtgatcaaa aacaaatatt tttacggtat ctataagaat 1260cctcccctct ttttcttttt ccttaaagag aatttttttg catctttctt aggttccaat 1320aaatatgcag aagaaagtta aaatttttgt accgtcgttg aaccttttaa agacctaatt 1380aagagacaag atcatactaa gctcataaat cactttctat ttacacatat ataggttatt 1440aatcttaaac aagatctata ttttatcttt gagatttttc aagatttcat caagtgtcac 1500gttcattcat tgattacatt tcaaatttca ctaagaaagt taaaacacgg atctttttga 1560gaatatcaag aaagttcttt gaaatatacc aaaagaaatc agtactttca agaatacata 1620actttttagg ttgtgttaaa taatatttgc ttttgtaata aaggaacaaa attaaataga 1680gagatcggag aggatcaaag 1700<210>99<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>99
cgggatccat ggaaagtgat agaataagca c31<210>100<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物的寡核苷酸<400>100ttttcctttt gcggccgctt aacagcctaa atggagtaag acag 4权利要求
1.与相应的野生型植物细胞相比较，植物3Rmyb蛋白的活性受到改变的植物细胞。
2.权利要求1的植物细胞，所述植物细胞为具有下述(a)～(f)中任意一项所述的DNA或(g)所述的重组DNA或载体的植物细胞或为由其转化的植物细胞(a)编码植物3Rmyb蛋白的氨基酸序列的DNA，(b)编码与植物3Rmyb蛋白具有等同功能的蛋白质的DNA，其为与编码植物3Rmyb蛋白的氨基酸序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，(c)编码具有核酶活性RNA的DNA，其中所述具有核酶活性的RNA特异断裂编码植物3Rmyb蛋白的DNA的转录物，(d)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过共抑制作用抑制编码植物3Rmyb蛋白的DNA表达，而且，其与编码植物3Rmyb蛋白的DNA具有90％或以上的同源性，(e)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过RNA干扰作用抑制编码植物3Rmyb蛋白的DNA表达，(f)编码反义RNA的DNA，所述反义RNA与编码植物3Rmyb蛋白的DNA的转录物互补，(g)包含下述(i)至(iii)的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的上述(a)～(f)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
3.权利要求1或2所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白为通过MSA序列活化G2/M期特异性转录的转录因子。
4.权利要求1或2所述的植物细胞，其中通过MSA序列活化G2/M期特异性转录的转录因子-植物3Rmyb蛋白为包含氨基酸序列SILX1KRXRXLX3X4PX2XX5X1RXX5KK(序列号94，X为任意氨基酸，X1为K或R，X2为L、I或V，X3为L或V，X4为S或T，X5为D或E)的蛋白质。
5.权利要求1至4中任意一项所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白具有的氨基酸序列为序列号32、序列号51、序列号53、序列号75或序列号76中的任意一种氨基酸序列。
6.权利要求1或2所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白为通过MSA序列抑制G2/M期特异性转录的转录因子。
7.权利要求1或2所述的植物细胞，其中通过MSA序列抑制G2/M期特异性转录的转录因子-植物3Rmyb蛋白为包含氨基酸序列SCSSXSX6(序列号95，X为任意氨基酸，X6为K、R、D、E或H)的蛋白质。
8.权利要求1、2、6或7中任意一项所述的植物细胞，其中植物3Rmyb蛋白具有选自序列号55、序列号77或序列号78的氨基酸序列。
9.权利要求1至8中任意一项所述的植物细胞，其与相应的野生型植物细胞相比较，植物3Rmyb蛋白的表达量受到改变。
10.权利要求1至8中任意一项所述的植物细胞，其与相应的野生型植物细胞相比较，细胞增殖受到改变。
11.包含权利要求1至10中任意一项所述的植物细胞的植物。
12.权利要求11所述植物的子代植物或克隆植物。
13.权利要求11或12所述的植物，其与相应的野生型植物相比较，细胞增殖和/或发育分化受到改变。
14.权利要求11或12所述的植物，其用于改变细胞增殖和/或发育分化。
15.编码与相应的野生型蛋白质相比较转录活化功能增强的植物3Rmyb蛋白的DNA。
16.权利要求15所述的DNA，其中转录活化功能增强的植物3Rmyb蛋白的特征在于调节转录活化功能的调节区功能丧失。
17.权利要求16所述的DNA，其中丧失功能的所述调节区的特征在于其位于序列号89所示氨基酸序列TPSILKKRHR的C端。
18.权利要求16所述的DNA，其中丧失功能的所述调节区的特征在于其位于序列号90所示氨基酸序列NXXTPXRLWX(X表示任意氨基酸)中氨基酸残基W的C端。
19.权利要求16所述的DNA，其中丧失功能的所述调节区的特征在于其为自序列号91所示氨基酸序列PPRFPSXDXPF(X表示任意氨基酸)起始至C末端的区域。
20.编码植物3Rmyb蛋白的权利要求15至19中任意一项所述的DNA，其中功能的丧失源自氨基酸的替换、删除和/或插入。
21.编码植物3Rmyb蛋白的权利要求15至19中任意一项所述的DNA，其中功能的丧失源自氨基酸的删除。
22.编码对内源性植物3Rmyb蛋白显示出显性失活活性的蛋白质的DNA。
23.权利要求22所述的DNA，所述DNA编码的蛋白质的特征在于包含植物3Rmyb的DNA结合结构域的氨基酸序列。
24.包含下述(i)至(iii)的重组DNA或载体(i)可在细胞内转录的启动子，(ii)与该启动子序列以有义方向或反义方向连接的权利要求(15)～(23)中任意一项所述的DNA，(iii)与RNA分子转录终止及聚腺苷酸化相关的信号。
25.具有权利要求15至24中任意一项所述的DNA或重组DNA或载体或经它们转化的植物细胞。
26.权利要求25所述的植物细胞，其与相应的野生型植物细胞相比较，细胞增殖受到改变。
27.含有权利要求25所述的植物细胞的植物。
28.权利要求27所述的植物的子代或克隆的植物。
29.权利要求27或28所述的植物，其与相应的野生型植物相比较，细胞增殖和/或发育分化受到改变。
30.下述(a)～(i)中任一项所述的DNA(a)编码包含序列号32所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；(b)包含序列号31所示碱基序列的DNA；(c)这样的DNA，其编码的蛋白质包含在序列号32所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的替换、删除或添加的氨基酸序列，并且分别与由序列号32所示氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(d)与包含序列号31所示碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，并且其所编码的蛋白质分别与由序列号32所示氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(e)这样的DNA，其编码的蛋白质与序列号32所示的氨基酸序列进行比对，具有比对分值大于或等于60的氨基酸序列，并且其编码的蛋白质分别与由序列号32所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有等同功能；(f)编码反义RNA的DNA，其中所述反义RNA与上述(a)～(e)中任一项所述DNA的转录物互补；(g)编码具有核酶活性RNA的DNA，其中所述具有核酶活性的RNA特异切割上述(a)～(e)中任一项所述DNA的转录物；(h)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过共抑制作用抑制上述(a)～(e)中任一项所述的DNA的表达，而且，其与上述(a)～(e)中任一项所述的DNA具有90％或以上的同源性，(i)这样的DNA，当其在植物细胞中表达时，所编码的RNA通过RNA干扰作用抑制上述(a)～(e)中任一项所述的DNA的表达，而且，其与上述(a)～(e)中任一项所述的DNA具有相同的20个或以上连续碱基。
全文摘要
调控细胞周期对植物育种是重要的，需要开发通过所述调控改变植物细胞增殖的技术以及改变植物个体的发育分化的技术以及为此所使用的植物基因。本发明成功阐述了植物3Rmyb基因为植物细胞增殖所必需的因子，并且提供了以该基因为靶标而改变植物细胞增殖的技术以及改变植物个体的发育分化的技术，获得了具有细胞增殖、发育分化受到改变的植物细胞及植物，从而可开发具有特定的器官肥大、雄性不育或逆境耐性改善等所需特性的植物。
文档编号A01H5/00GK1788078SQ200480012849
公开日2006年6月14日 申请日期2004年3月11日 优先权日2003年3月12日
发明者伊藤正树, 荒木智史, 儿玉浩明, 町田泰则 申请人:石原产业株式会社