Uro基因及其用途的制作方法

专利名称：Uro基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物学领域。具体而言，本发明涉及新的拟南芥UPRIGHTROSETTE(URO，叶片向上生长)基因及其用途。本发明还涉及降低植物中木质素含量或增加植物分枝数量的方法。此外，本发明还涉及一种改良植物的方法。
背景技术：
与可以移动的动物不同的是，植物的生长是原地不动的，所以植物的生长发育相对与动物来说具有一套更精细和更敏感的自我调节的发育调控机制。植物体形态结构的建成不仅受其内在调控机制的制约，还受到外界环境条件的影响，光照和温度给予植物发育自身调节的信号。植物激素在这一感应过程起到了重要的作用。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为一种模式植物，是进行植株形态结构建成研究的理想材料，研究进展也很迅速。对于拟南芥植株的地上部分而言，其生长发育可以看成是由一个个的发育单位重复生长形成，这一发育单位由茎顶端组织发育而来，含有一片叶片、一段节间以及一个侧生分生组织。这一发育单位在拟南芥植株营养生长期形成莲座叶、莲座叶侧枝以及很短的节间；进入生殖生长后先形成茎生叶、茎生叶侧枝和长的节间；然后形成退化的叶、长的节间和终止生长的花器官。对拟南芥突变体的分析使我们对这一发育过程有了初步的了解。
茎顶端分生组织是所有器官生长的来源，因此，调控茎顶端分生组织正常建立和分化的基因突变后植株都不能进行正常的生长发育，如CLV、WUS、STM等。对于拟南芥植株而言，其地上部分的形态结构建成还有赖于位于叶片叶腋处的侧生分生组织的正常建立和发育。侧枝的发育不仅在很大程度上影响了植物最终的形成结构建成，对于农作物而言还影响到其最终的产量。
研究表明，拟南芥植株茎顶端分生组织的发育与侧生分生组织的发育有一定的共同调节机制，如REV基因的缺失不仅影响到茎顶端分生组织的发育，还特异的影响到侧生器官的发育。而对las4突变体的研究表明，侧生分生组织的发育与茎顶端分生组织发育有着不同的调控机制，LAS基因缺失的拟南芥突变体其茎顶端分生组织发育正常。LAS基因与西红柿中的LS基因同源，与水稻中的MOC基因也同源，表明在植物界中普遍存在着这一侧枝发育调控系统。但目前在拟南芥中只发现了很少的起到内在调控植株形态结构建成的基因。
除了对内在调控机制有一定的了解外，人们对植物形态结构建成的外在调控信号也有了一定的认识。植物能敏感的感应外界环境的变化，植物激素如生长素在其中起到了重要的调控作用。早在1934年Thimann和Skoog就发现植物的顶端优势是由植物激素生长素介导的，后期的许多生理实验也证明生长素在植物的各个发育过程都起到了重要的作用。生长素的含量、信号传递以及极性运输都为植物的正常生长发育提供了信号。早期的顶端优势理论就认为，生长素能在植株的茎顶端合成，向下进行极性运输后抑制侧生分生组织的进一步发育。但随着研究的深入，人们发现在拟南芥植株中，生长素对植物顶端优势的调控作用不是直接的，近期的新发现表明，在植物体中存在一类新的类胡萝上素类的衍生物在顶端优势的调控中起到重要的作用。
虽然目前仍未发现植物中的生长素受体，但通过不同的方法，研究者对生长素指导生长发育的信号传递过程还是有了一定的认识。信号传递过程中的AUX/IAA与ARF基因在生长素含量较低时结合在一起，当生长素含量升高时，AUX/IAA会被体内的E3泛素降解酶系统识别，ARF基因被释放出来调节其下游基因GH3类基因的表达，从而调节植株的生长发育过程。最新的研究显示，拟南芥中许多的GH3类基因是将自由态生长素转化为结合态生长素的酶类，表明拟南芥中存在着生长素的自我调节过程。但生长素调节植物发育的下游基因研究甚少，其调节植物发育的具体作用机制更少见报道。
木质素是高等植物合成的一种次生代谢产物，生理功能主要是参与建立坚实的植物茎杆，防止植物倒伏。木质素同时又是造纸产业和牧草有效利用不利因素。造纸业需要动用强酸、碱消除木质素，这样将造成环境污染，牲畜无法利用牧草中的木质素作为有效的营养成分。造纸业和牧业需要低木质素的种质资源，但是目前尚没有有效的方法可以解决这一问题。

发明内容
一方面，本发明提供一种分离的URO蛋白，它含有具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。
在一优选的实施例中，所述URO蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。在另一优选的实施例中，所述URO蛋白具有将SEQ ID NO2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影响植物木质素含量或分枝数量的由(a)衍生的多肽。所述一个或多个氨基酸指，如1-10个、1-8个、1-5个等。
另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，该核苷酸序列编码本发明的URO蛋白。
在一实施例中，本发明的多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽和驱动该基因表达的上游启动子区序列。
在另一实施例中，本发明的多核苷酸该多核苷酸选自以下序列中的一种(a)有SEQ ID NO1所示的序列；(b)在SEQ ID NO3中第1-3519位所示的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-4836位所示序列。
另一方面，本发明涉及一种载体，该载体含有含有本发明的多核苷酸。
又一方面，本发明涉及一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的载体，或者其基因组中整合有本发明的多核苷酸。
再一方面，本发明涉及一种降低植物中木质素含量或增加植物分枝数量的方法，该方法包括增加所述植物中URO基因或其同源基因的表达。在一优选实施例中，通过插入T-DNA序列而增强该URO基因或其同源基因的表达。
又一方面，本发明涉及一种改良植物的方法，该方法包括如下步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有URO蛋白DNA编码序列，所述的影响植物木质素含量或分枝数量蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影响植物木质素含量或分枝数量的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该URO蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述URO蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。


图1显示野生型和uro突变体三星期幼苗的表型。(A)Lansberg erect；(B)uro/+；(C)uro/uro。比例尺A-C＝0.2cm。
图2显示uro突变体中木质素的含量降低。图中箭头所指红色部分为间苯三酚染色的木质素，左图是野生型，可见大量木质素存在，右图为uro突变体，原本大量存在的木质素量在突变体中明显减少。e，表皮；co，皮层；en，内皮层；ph，韧皮部；x，木质部；if，束间纤维；ip，束间纤维前体细胞；mx，后生木质部；pi，髓。比例尺A、C、E、G、I-J＝100um B、D、F、H＝50um。
图3显示uro突变体分枝数量增加。(A)野生型；(B)uro突变体。
图4显示通过TAIL-PCR实验得到的T-DNA插入旁邻序列。(A)T-DNA的结构与被插入的At3g23140基因。(B)克隆的旁邻序列与拟南芥基因组序列的比对。
图5显示At3g23140基因序列、T-DNA的左臂序列和插入位置。(A)T-DNA左臂序列。(B)At3g23140基因序列。注含尾横向箭头所示处为At3g23140基因起始编码框；不含尾坚向箭头所示为T-DNA左臂插入基因组位点。
图6显示At3g23140基因的氨基酸序列与其他同源基因的比对。
图7显示转基因构建示意图。IAAH-pURO-23145构建含有T-DNA插入的IAAH片段，At3g23140以及At3g23145基因的部分序列，该片断转化野生型拟南芥能够获得与uro突变体项类似的表型；以下转化构建均为对照，包括IAAH-p构建只含有T::URO构建中的T-DNA中的IAAH序列及URO基因起始编码区前的序列；pURO构建无35S启动子，起始序列为T-DNA插入后的序列；35S::URO为URO基因过量表达的构建；35S::At3g23145的构建为At3g23145基因过量表达的构建；35S::fURO-rURO的构建为URO基因的双链构建，起到抑制URO基因表达的作用。
图8显示转化子植株表型。(A)Ler野生型(B)uro杂合突变体(C)uro纯合突变体(D)IAAH-pURO-23145转入Ler野生型获得的转化子(E)IAAH-p转入Ler野生型获得的转化子(F)35S::23145转入Ler野生型获得的转化子(G)-(I)26天时的IAAH-p转入Ler野生型获得的转化子除(G)-(I)外所有植株生长期为三周，比例尺＝0.5cm。(J)转化子中URO基因的表达模式。
图9显示过量及反义转化子转基因植株表型。(A)野生型Ler植株(B)杂合uro/+突变体(C)纯合uro突变体(D)35S::URO转化野生型Ler所得的转化子植株(E)-(G)和(I)-(K)35S::fURO-rURO构建转化到uro纯合突变体所得的转化子植株(H)和(L)35S::fURO-rURO构建转化到野生型Ler所得的转化子植株(M)转化子植株茎中URO基因表达模式，所用引物为URO-3和URO-4(N)转化子中T-DNA插入的鉴定，引物为T-DNA-5和URO-2(图5所示)比例尺(A)-(B)，(E)-(H)＝5mm；(D)＝1mm；(I)-(L)＝1cm。
图10显示启动子表达模式。(A)花序组织(B)单个花器官(C)-(D)果荚，可见URO基因在雄蕊及细嫩的胚中表达明显。(E)35S::URO构建转化子的表型(F)35S::URO构建引入DR5::GUS植株获得的转化子GUS染色(G):(F)的放大 比例尺A＝1cm，B＝0.5cm，C-D＝1mm。
具体实施例方式
通过研究，本发明人发现了一种新的参与拟南芥侧枝发育的内在调控因子At3g23140。分析表明，不同At3g23140的表达量决定了植物生长的不同形态。在野生型状态下，At3g23140的表达量非常低；当过量表达At3g23140时，植株生长矮小，发育停止。当At3g23140表达量小幅度增加时(在uro突变体中)，植物略矮小，茎杆非常柔软。申请人将此At3g23140基因命名为URO基因。
本发明人通过研究发现，通过调控URO基因的表达量可获得木质素含量低、分枝增加的植株。这一发现在产业应用上具有重要的意义。例如，在用木材为材料的造纸工艺中为了消除木质素，要使用大量的强酸、强碱处理，造成对环境的严重污染，低木质素的木材可以减轻造纸工业对环境带来的污染。可通过调控URO基因的表达而降低造纸用木材中的木质素含量。从而克服上述不足。此外，牧草中木质素是不能被牲畜所利用的部分。也可采用本发明的方法降低牧草中木质素含量，从而提高饲料的利用率。此外，还可通过调控URO基因来改良某些蔬菜的品质使之口感柔软、通过增加植物的分枝数量和柔软程度来改造观赏花卉和树种。
以下将对本发明进行详细的描述。
I.定义如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的URO蛋白或多肽”是指URO蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化URO蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括URO蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然URO蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“URO蛋白”指具有URO蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与URO蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括URO蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与URO蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗URO蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含URO蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了URO蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有URO蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供URO蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然URO蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“URO蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码URO蛋白的多聚核苷酸。
应理解，虽然本发明的URO基因优选得自拟南芥，但是得自其它植物的与拟南芥URO基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的URO蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或URO蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的URO蛋白。一般来说有以下步骤
(1).用本发明的编码URO蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，URO蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含URO蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得快速生长性/抗衰老性改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的URO蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗URO蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组URO蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激URO蛋白功能的多肽分子。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用URO蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测URO蛋白的转录产物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物学-实验手册(Plant MolecularBiology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark编，Springer-verlag BerlinHeidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
II.实施例(A)材料与方法本发具体实施方式
中使用到以下的材料和方法。但应理解，可采用这些方法的其它合适替换形式来实施本发明。本发明范围并不受到这些具体实施例的限制。
一.植物材料的培养试剂PNS营养液每升含2.5ml 1M磷酸缓冲液(pH5.5)，5ml 1M KNO3，2ml 1MMgSO4·7H2O，2ml 1M Ca(NO3)2·4H2O，2.5ml 20mM Fe.EDTA，1ml MS微量元素。
人工土3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合。
步骤将拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，当年收获的种子种植后40C春化72h，隔年种子种植后春化24h.然后转入人工培养室中在相对湿度80％，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗、16h光照培养。
二.扫描电镜样品制作方法1.材料固定FAA固定液固定样品，2小时以上。
2.材料脱水70％，80％，95％，100％乙醇梯度脱水，每级2小时，脱水剂体积高于材料的3倍。
3.临界点干燥4.上铜台将样品用导电胶固定于铜台上，并将样品调整至适于观察的位置。样品喷金。
5.扫描电镜观察。
三.拟南芥转化试剂渗透培养基(1L)1/2xMurashige-Skoog；5％蔗糖；0.5克MES；用KOH调至pH5.7再加10微升1mg/ml的6-BA母液；200微升Silwet L-77；Topagar(0.1％琼脂PNS或水溶液)筛选培养基平板1xMS salt，或1XPNS(pH5.8)；0.8％琼脂；卡那霉素30mg/l(Columbia，Landsberg)，潮霉素20mg/ml；活性氯5.2％原液，用无菌水临时稀释7％使用。
步骤1.植物生长
1)建议在直径7厘米的培养杯里种5处，每处种几棵，萌发一周后，每处只留下一棵最好的苗。
2)将萌发的植物培养至茎高约3厘米时，去除其顶生花序。注意要避免伤及叶生花序。去除顶生花序将刺激叶生花序的生长。转化必须在去除顶生花序4天后进行。
3)转化前，将已授粉花以及果荚去除掉。并使土壤吸足水。
4)转化操作5)制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。室温5000rpm离心15分钟。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使O.D600在0.8左右。
6)用喷雾器将菌液均匀喷洒在待转化植株上，移入恒温室竖直培养。
7)培养3到4周后，收种子。放在干燥环境存放2周。
2.转化子的筛选1)筛选前一般都要消毒先用70％乙醇浸泡2分钟，再用次氯酸钠溶液处理15分钟，在上述处理时要不停地悬浮种子，最后用无菌水洗四次。处理后的种子用Top agar均匀涂布在固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。低温4度春化2到3天，移入恒温室培养。
2)正常情况下最多4天种子就会萌发，萌发后5到7天，转化子将很容易鉴别出来深绿色的子叶，根较长。非转化子叶发黄，根短，不能长期存活。若已确定转化子，而生长不佳时，可将其转入不加抗生素的平板，使其茁壮。但若已长霉菌，则应立即转入土壤。
四.植物组织提取DNA试剂Lysis BufferTris-Hcl，pH8.0(0.2M)；尿素(7M)；十二烷基肌氨酸钠(2％)；EDTA(0.05M)步骤1.植株的绿叶或花等组织适量，置于1.5ml的离心管中，加200ul裂解液，用小棒研磨成浆，再用400ul裂解液冲洗小棒2.加600ul的酚-氯仿，剧烈震荡20sec，使蛋白质变性3.12000rpm离心5min后取上清。
4.加50ul醋酸钠，600ul异丙醇，混匀，12000rpm离心5min5.去上清，沉淀溶于400ul TE(Tris-EDTA)中6.再加40ul 3mol/L NaAC(PH5.2)，1ml无水乙醇，混匀，12000rpm离心5min。
7.去上清，用70％乙醇洗沉淀一次，离心；去清液，8.室温干燥，沉淀溶于50ul无菌水中。
五.植物组织提取RNA试剂DEPC水RNA Extraction BufferTris Cl Ph 8.0(0.2M)；LiCl(0.4M)；EDTA(25Mm)；SDS(1％)；(DEPC水配制)3M NaAc pH5.2(DEPC水配制)(DEPC水配制)RNase free的水饱和酚，和酚氯仿。
步骤1.液氮中将材料研磨充分，2.研好的材料用烘过的药勺拨适量到EP管中，管中已预先加好400ulRNA Extraction Buffer和400ul水饱和酚。
3.vortex多次。
4.13200rpm离心5分钟，取上清(建议用酚抽两次)5.加入0.5ml酚氯仿，震荡，离心5分钟。
6.取上清，加入40ul3MNaAc和1ml乙醇，混匀，-20℃放置一段时间。
7.13200rpm离心10分钟，弃上清。
8.加入0.4ml 2M LiCl，尽量将DNA溶解。
9.离心，10分钟，弃上清，加入100ul DEPC H2O，10ul3M NaAc，250ul预冷的无水乙醇，混合均匀，-20℃放置一段时间。
10.离心，10分钟，弃上清。
11.70％乙醇洗一次，离心，弃上清.超净台吹干。
12.DEPC水溶解，-20℃短期保存，-70℃长期存放。
六.RT-PCR试剂PROMEGA反转录试剂盒，一般PCR试剂。
DNase(RNase free)步骤1.取RNA模板，用DNase(RNase free)处理30分钟，之后酚氯仿抽提，沉淀，吹千，DEPC水溶解。
2.反转录体系(20ul)MgCl(4ul)；10XBuffer(2ul)；10XdNTP(2ul)；Oligle(1u1)；total RNA(1ul)；RNase Inhibitor(1ul)；RTase(1ul)；ddH2O(DEPC)(8ul)；模板在加入体系前需在68℃加热10分钟。
3.用反转录产物为模板进行一般PCR。
七.随机引物法标记探针探针标记采用TAKARA公司的随机引物标记试剂盒Ver.2，1.于1.5ml离心管中加入5ml H2O；2ml引物(N6)；5mlDNA(0.1mg-1mg)2.充分混匀，98℃ 3分钟。
3.离心1秒钟，将离心管盖上的汽化水甩下。
4.加入2.5ml dCTG(各2.SmM)；3ml缓冲液；6ml H2O；1mlKlenow酶；充分混匀，置于冰上，拿到同位素室。
5.加入1ml 32P-dATP37℃10分钟。
6.加入100ml TE，混匀上到已在大管中加好4ml 6N NaOH的Sepherdex-G50柱，室温下3000rpm离心3分钟。
7.再加入100mlTE。室温下3000rpm离心3分钟。
8.将大管中标好的探针加到杂交管中杂交即可。
八.Southern杂交试剂0.25N HCl；0.4N NaOH；预杂交液(20XSSC)；洗膜液(0.2XSSC、0.2％SDS)步骤1.将拟南芥的基因组DNA完全酶切。
2.1％琼脂糖凝胶电泳。当目的片段较大时，将胶置于0.25N HCl，使片段断裂，转膜更充分。
3.0.4N NaOH，浸泡30分钟，
4.在0.4N NaOH中转膜，过夜。
5.将膜在紫外交联仪上交联，或80℃烤2小时.膜存放于4℃，备用。
6.65℃预杂交1小时，7.65℃杂交过夜。
8.室温洗膜1分钟。
9.65℃洗膜15分钟。
10.将杂交膜用保鲜膜封好后于-70℃放射自显影，或压磷屏。
九.Northern试剂10XMOPS；甲酰胺；甲醛；上样指示剂0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青；20XSSC；杂交液(7％SDS，1％BSA，1mM EDTA，0.25M NaHPO4(pH 7.2))步骤1.倒胶，将胶在水中加热融化后，冷却到60℃后，加入10xMOPS，和3％甲酰胺。混匀倒胶。
2.将200ml10xMOPS，350甲酰胺，1ml甲醛，和100ml上样指示剂以及15-20ml(约5mgRNA)混匀后65℃加热15分钟。
3.上样，电压尽量小。
4.将胶在水中洗2次.将需要染色的泳道切下，EB(0.5mg/ml)染色，拍照。
5.不染色部分直接在10XSSC中转膜，过夜。
6.以后操作同SOUTHERN杂交。
十.TAIL-PCRTAIL-PCR依照Liu等叙述的方法[178]。T-DNA左端嵌套引物序列是T-DNA-1，TCGAGGCGATCGTGAAGTTTCT；T-DNA-3，CGCCTATAAATACGACGGATCGTAA；和T-DNA-5，TAATAACGCTGCGGACATCTA。
这三个引物分别与八个随机的简并引物AD1-AD8当中的一个配对组合进行PCR[178]，扩增T-DNA左端的旁临序列。TAIL-PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳进行分析。TAIL-PCR产物的回收方法如下在出现特异条带的泳道的前面挖个洞，洞中注满0.7％低熔点胶，冷却后继续电泳直到DNA条带进入低熔点胶，回收此低熔点胶并于液氮中快速冷冻，然后于Eppendorf小型离心机上13200rpm下离心5分钟，上清液用酒精沉淀。回收后连接到T载体上进行测序。
十一.GUS染色试剂90％丙酮水溶液GUS染液750mg/ml X-Gluc，100mM NaHPO4(pH 7)，3mM K3F3(CN)6，10mM EDTA，0.1％Nonidet-P40。
100ml GUS染液5.77ml 1M Na2HPO4，4.23ml 1M NaH2PO4，加水80ml，0.1gK3F3(CN)6，0.3g EDTA，0.1ml N-P40，定溶100ml，加入0.075g X-Gluc步骤1.取新鲜组织，于90％丙酮水溶液中15min，冰上。
2.转入GUS染液中，500mmHg真空抽气。
3.37℃染色过夜。
(B)具体实施例实施例1uro突变体植株的获得采用前述材料和方法，在Lansberg erect遗传背景下T-DNA插入的突变体库中筛得到uro(up-rightrossette)突变体，因其莲座叶生长不同于野生型叶片的生长模式，表现出上举生长而得名(见图1)。
实施例2uro突变体植株的形态学观察(1)幼苗的生长在相同的光照培养条件下(22℃)，野生型196粒种子全都能萌发成苗，而纯合uro突变体的萌发率仅为89.5％(162/181)。比较野生型与uro纯合突变体的种子表明，部分uro突变体的种子较野生型种子小。能正常生长的纯合uro突变体其下胚轴生长较野生型快，但后期生长减慢，在第6-8天左右表现出与野生型相同的下胚轴长度。突变体与野生型在发育早期的差异暗示着URO基因从胚胎发育期开始就起到调控作用。
与野生型Ler相比，杂合的uro突变体植株株型矮小，没有明显的顶端优势。成熟的野生型植株具有明显的一根长的主茎，在主茎上长一些短的侧枝。而uro杂合的突变体没有明显的主枝生长优势，而且分枝靠近茎的基部。纯合的uro突变体表现出与杂合的uro突变体相似的植株表型，而且更加严重，长成矮小的一丛。对ColXuro的F2代进行观察表明，uro突变体的生长模式与在Ler遗传背景下相似，表明URO基因调控的发育过程与生态型背景无关。这一表型暗示着URO基因参与了拟南芥植株顶端优势建立的调控过程。
(2)叶的生长不论是纯合还是杂合的uro突变体，营养生长时期除子叶外叶片的生长均表现出向上生长的特点。与野生型相比，突变体的莲座叶数目没有变化，但叶片更加宽而且略有革质化。突变体的茎生叶数目多于野生型，而且突变体的叶片宽而且略扭曲。对叶脉的分析表明，无论是杂合(结果未显示)还是纯合的突变体其叶脉的发育与野生型相比没有发生改变。另外，野生型的每个茎生分枝的基部常常伴随一片茎生叶，而在纯合的uro突变体中，经常可以观察到在本应长茎生分枝的部位生长出荷叶状叶的结构，这种叶的叶柄生长在叶片的腹部。这些表型表明URO基因不参与拟南芥植株叶片发育的调控过程。但纯合突变体中出现了荷叶状叶，已有报道表明，当生长素的极性运输受抑制时植株可能出现荷叶状叶，uro纯合突变体主茎的生长受到严重的抑制，因此在uro纯合突变体中生长素的极性运输可能也受到了抑制。
(3)茎的生长与野生型相比，uro突变体的茎在生长早期就表现出明显的增粗。莲座叶与莲座叶间的节间距较野生型大。杂合uro突变体的第一茎生分枝点较野生型明显低。并且抽苔后杂合的uro突变体的枝生长无明显的主从枝关系。纯合的uro突变体的主枝生长往往会提前终止，侧枝长于主枝。uro突变体茎生长的另一个明显特征是茎软，在培养土中水份含量低时整个植株就会萎焉(结果未显示)。
对野生型及uro杂合突变体的叶片数目及分枝数进行统计。结果表明与野生型相比，uro杂合突变体的莲座叶及莲座叶分枝没有增长，而茎生叶及茎生分枝均多于野生型。对次级分枝的统计也表明，Col生态型背景下，uro突变体的次级分枝明显增多。可见URO基因参与调控了拟南芥次级分枝发育的调控过程。可参见图3。
在野生型中，束间纤维的产生与植株生长发育的时期成正相关，它的发育也正是植株茎迅速伸长需要机械支持力的时期。茎中的纤维组织可以通过特异的染料甲苯胺蓝进行染色观察。因为观察到uro突变体茎软而且变粗，我们通过徒手切片的方法在细胞学水平上观察突变体的茎与野生型有什么不同。对5周生长期的野生型及uro突变体观察的结果表明野生型不论是在茎的基部还是顶部都能在束间纤维组织及维管组织中观察到明显的蓝色。而在uro杂合突变体的茎中没有观察到如野生型中的拱形生长的束间纤维组织。虽然在突变体茎基部的横切面中能看到少许束间纤维组织的染色，但纤维组织的次生化生长较野生型明显要差。另外，uro突变体茎的皮层组织发生了增大和增生。对野生型和突变体的茎进行木质素特异性染色分析(Wiesner反应)分析也表明，uro突变体的木质素比野生型少。
主茎的生长异常表明URO基因也参与了拟南芥植株茎的发育，但因为在uro纯合突变体主茎生长受到严重的抑制，这可能与突变体的顶端分生组织的异常发育有关。而对侧枝发育的统计表明，URO基因的确参与了拟南芥植株顶端优势建立的调控过程，调节了拟南芥植株的侧枝生长。另外，对突变体茎的细胞学分析表明，URO基因参与调控了拟南芥植株的束间纤维组织的建立，并参与了茎中皮层和内皮层细胞发育的调控。
实施例3URO基因的克隆uro突变体是从T-DNA插入的突变体库中筛得的。对T-DNA在uro突变体的插入情况进行了分析，T-DNA的结构可见图4A(其序列见SEQ ID NO3的第1-3000位)，含有GUS、NPTII和IAAH基因，具体构建可见http//genetrap.cshl.org/。遗传学分析表明，T-DNA插入与uro突变体的表型紧密连锁。
用TAIL-PCR的方法从纯合的uro突变体中只克隆到一个片段，在NCBI中BLAST比对表明uro突变体中T-DNA的旁邻序列为At3g23140(见图4C)。图5A显示的是T-DNA的左臂，图B的绿色显示的是At3g23140基因的编码起始位置，可见T-DNA插入在At3g23140基因起始编码框前164bp处(见图5B黑色横向箭头)。
实施例4URO基因的序列分析将TAIL-PCR克隆得到的序列“At3g23140”进行网上序列分析(见图5)。At3g23140基因是一个未知功能的含有一个锌指结构的转录因子。图6B中的蓝色横线标示的区域中含有“YDCDICKPGFUNPQALGGHNNIHRRERER”的典型的C2H2锌指结构(图6A)。植物界中含有许多具有一个C2H2锌指结构的转录因子(图6)。大部分是功能未知的基因。与At3g23140基因的氨基酸序列同源性很高的豌豆中的LIF(lateral shoot inducer)基因功能刚被报道。过量表达LIF基因表明LIF基因正向调控了植物侧枝的发育。这与uro突变体的表型有相似之处。暗示着At3g23140就是URO基因。我们将At3g23140基因命名为URO。
实施例5URO蛋白纯化和分析在该实施例中，以实施例2中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得拟南芥URO DNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′端寡核苷酸引物序列为5′-gaattgagagagatgaaccacc-3′(SEQ ID NO4)该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；3′端引物序列为5′-gtcgacccgctgcaagcttaatg-3′(SEQ ID NO5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是翻译终止子和拟南芥URO的部分编码序列。
拟南芥URO蛋白cDNA PCR产物纯化后经与质粒pUC 18按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。将正确序列的拟南芥URO蛋白cDNA EcoR I和SalI酶切片段克隆至表达载体pGEX-28a(Novagen公司)，形成载体pGEX-28a-URO，然后转化人DH5a。阳性克隆用BamH I酶切鉴定，酶切产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实，已插入了完整的URO编码序列。
挑表达URO的阳性DH5a克隆接种于100ml 2′YTA培养基中，37℃ 300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2′YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30oC诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1′PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8mm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1′PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH 8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到拟南芥URO蛋白。测得蛋白分子量为18783Da。
实施例6URO基因的过量表达是引起uro突变体表型的原因为了进一步确定所克隆的At3g23140基因是引起uro突变体表型的基因，我们根据T-DNA插入基因组中的情况进行了一系列的构建，具体构建示意图如图7。
首先，将IAAH-pURO-23145构建引入到野生型植株中，共得到116棵转化子，其表型如图8D和G-I所示，转化子的表型与uro杂、纯合突变体表型一致(图8B和C)。另外，我们分别将IAAH-p和35S::23145构建也引入到野生型植株中，以观察是否会引起植株生长发育的异常，图8E和F分别是这两个构建的转化子表型，其表型与野生型相似，可见正是由于T-DNA插入引起URO基因表达量的上升引起了拟南芥植株的异常生长(图8J)。
另外，对URO基因的表达情况分析表明，URO基因的过量表达与uro突变体的表型有着密切的关系。因此，我们用35S启动子过量表达URO基因于野生型中，以期能得到与uro突变体表型类似的转化子。所得到的转化子如图9D所示，35S::URO转化子在生长早期子叶向上生长，而且顶端生长受抑制，这些转化子在生长到7-10天时死亡。结合对IAAH-pURO-23145转化子的分析，表明URO基因对拟南芥的生长起到了重要的调控作用，是一种表达量上的精确调控，而且，T-DNA的插入起到的是一个精细上调URO基因的作用。
因为过量表达URO基因到野生型中所得的转化子是致死的，所以我们构建了双链反义抑制URO基因的构建(35S::fURO-rURO，如图7所示)。将这一构建分别引入uro纯合突变体和野生型中。如图9中(E)-(K)所示，反义URO基因的构建能回复uro纯合突变体的顶端优势丧失的表型。共筛得uro纯合突变体背景下51棵转化子，其中有30棵转化子表型回复得很好，表型与野生型相似(见图9P和G)；有13棵转化子表型得到了中等的回复，表型与杂合的uro植株相似(见图9E、I和J)；另外，还得到8棵表型未回复的表型与纯合uro突变体表型相似的转化子(见图9K)。将反义URO基因的构建转化到野生型植株中共获得12棵转化子，所得的转化子表型与野生型相似(见图9H和L)。
由此可见反义URO基因能回复uro突变体的表型，为了进一步验证转化子的表型回复是URO基因表达下降所起的作用，我们用RT的方法检测不同的转化子单株中URO基因的表达量。如图9中M所示，1为表型回复最好的转化子，2为表型中等回复的转化子，3为表型未回复的转化子，4为35S::fURO-rURO构建引入到野生型植株中获得的转化子，可见URO基因的表达在表型得到回复的转化子中表达量下降了，而且下降值与表型回复程度关系密切。T-DNA插入的鉴定进一步验证了表型回复的转化子是从uro纯合突变体背景下筛得的(图9N)。因此，我们可以定论，所克隆的At3g23140基因即为URO基因，URO基因的过量表达引起了uro突变体的异常表型。
根据已有的结果，即过量表达At3g23140基因使植株致死，而反义抑制该基因可以回复uro突变体的表型，我们推测URO基因的表达量与拟南芥植物的生长发育有关密切的关系，而T-DNA的插入是一种非常特异的方式，适量的使At3g23140基因过量表达不会引起植物致死。因此，T-DNA的插入位点可能是URO基因启动子的关键调控位点。为此，我们将T-DNA插入位点后的序列接上At3g23140基因进行表达(p-URO，如图7所示)，所得的转化子都为野生型植株表型(结果未显示)。表明At3g23140基因在uro突变体中的过量表达并非由于其启动子调控元件的改变所致。
实施例7关于URO基因功能的进一步分析前面的分析表明，uro突变体中生长素的时空分布的特异性发生了改变。在克隆到URO基因后，我们将URO基因过量表达到DR5::GUS植株中，所获得的转化子表型与转化野生型植株所获得的转化子表型一致(如图10E和F)。将这一生长受抑的转化子进行GUS染色分析表明，过量表达URO基因的转化子中大量积累了GUS的分布，在子叶和顶端分生组织特别明显(如图10F和G)。可见URO基因的确影响到了拟南芥植株中生长素的时空分布的特异性。但这一调控的机制还需深入的研究。
对URO基因的表达模式的初步分析表明URO基因在野生型植株中遍在表达，但表达量很低。为了进一步的分析URO基因的功能，我们对URO基因的表达模式进行了进一步的分析，将URO基因起始编码框前的1.5kb序列克隆后接上GUS表达基因(SEQ ID NO6)，将这一构建转化到野生型植株中以观察URO基因的表达模式。结果如图10所示，URO基因在雄蕊及细嫩的胚中表达明显。其他组织的染色正在进行中。
对URO基因表达模式的仔细分析不仅可以让我们更清楚的了解URO基因的作用方式，对URO基因的功能分析也有很大的帮助，因此，仍需用更精确的方法研究URO基因的表达模式，如原位杂交等。针对URO基因对植物的生长发育有量上的调节作用，可以用诱导URO基因适量适时表达的方法对URO基因的作用方式进行更深的分析。现有的分析表明，uro突变体中的T-DNA插入是引起URO基因过量表达的原因，对这一调控机制的研究也将有助于了解URO基因的功能。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>URO基因及其用途<130>053918<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>519<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgaaccacc gggacaaaca aattgattcc ggctctggct ctggagaaaa ccgccggact 60tatgactgcg acatctgcaa gagaggtttc acgaatcctc aagccctcgg tggtcacaat120aacatccacc gcagggaacg cgaaagatac ccctcctcct cttcttcttc tcactcattt180ccattttctc ttccgttacc atctcagtct ccctcctcct ccacaaactt cacaaaccct240cctccttatt ttccgaccat tgagtcatac ctacaccaag ggtctcagcc acctattaac300cctagccaca acacacaata ctttggatca tcatcatcat caagaggagg agggagattt360gctcaagggg cgtctcatga tcttaatttg agcttagggc tcggatccat gaatgaagat420gatgacactc accggagccc accagagacc ggaggttctc aacctcaaga tggtgatctt480gatcttgatc ttcgactcgg cggtcatcgt catcattaa 519<210>2<211>172<212>PRT<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Asn His Arg Asp Lys Gln Ile Asp Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu1 5 10 15Asn Arg Arg Thr Tyr Asp Cys Asp Ile Cys Lys Arg Gly Phe Thr Asn20 25 30Pro Gln Ala Leu Gly Gly His Asn Asn Ile His Arg Arg Glu Arg Glu35 40 45Arg Tyr Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Phe Pro Phe Ser Leu50 55 60Pro Leu Pro Ser Gln Ser Pro Ser Ser Ser Thr Asn Phe Thr Asn Pro65 70 75 80Pro Pro Tyr Phe Pro Thr Ile Glu Ser Tyr Leu His Gln Gly Ser Gln85 90 95Pro Pro Ile Asn Pro Ser His Asn Thr Gln Tyr Phe Gly Ser Ser Ser100 105 110Ser Ser Arg Gly Gly Gly Arg Phe Ala Gln Gly Ala Ser His Asp Leu115 120 125Asn Leu Ser Leu Gly Leu Gly Ser Met Asn Glu Asp Asp Asp Thr His130 135 140Arg Ser Pro Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gln Pro Gln Asp Gly Asp Leu145 150 155 160Asp Leu Asp Leu Arg Leu Gly Gly His Arg His His165 170
<210>3<211>4836<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3000)<223>T-DNA序列<220>
<221>misc_feature<222>(3001)..(3519)<223>URO序列<220>
<221>misc_feature<222>(3520)..(4836)<223>下游序列<400>3acgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagatgt ttatttcggc gtgtaggaca 60tggcaaccgg gcctgaattt cgcgggtatt ctgtttctat tccaactttt tcttgatccg 120cagccattaa cgacttttga atagatacgc tgacacgcca agcctcgcta gtcaaaagtg 180taccaaacaa cgctttacag caagaacgga atgcgcgtga cgctcgcggt gacgccattt 240cgccttttca gaaatggata aatagccttg cttcctatta tatcttccca aattaccaat 300acattacact agcatctgaa tttcataacc aatctcgata caccaaatcg atggtggcca 360ttacctcgtt agcccaaagc ctagaacacc tgaaacggaa agactactcc tgcttagaac 420tagtagaaac tctgatagcg cgttgtgaag ctgcaaaatc attaaacgcc cttctggcta 480cagactggga tggtttgcgg cgaagcgcca aaaaaattga tcgccatgga aacgccggag 540taggtctttg cggcattcca ctctgtttta aggcgaacat cgctaccggc gtatttccca 600caagcgccgc tacgccggcg ctgataaacc acttgccaaa gataccatcc cgcgtcgcag 660aaagactttt ttcagctgga gcactgccgg gtgcctcggg aaatatgcat gagttatcgt 720ttggaattac aagcaacaac tatgccaccg gggcggtgcg aaacccgtgg aatccagatc 780tgataccagg gggctcaagc ggtggtgtgg ctgctgcggt agcaagccga ttgatgttag 840gcggcatagg caccgatacc ggtgcatctg ttcgcctacc cgcagccctg tgtggcgtag 900taggatttcg accgacgctt ggtagatatc cgggagatcg gataataccg gttagcccta 960cccgggacac tcccggaatc atagcgcagt gcgtagccga tgttgtaatc ctcgaccgga1020taatttccgg cacaccggag agaataccac ccgtgccgct gaaggggcta aggatcggcc1080tccctacaac ctacttttat gatgaccttg atgctgatgt ggccctagca gctgaaacaa1140cgattcgcct gctagcaaac aaaggcgtaa cttttgttga agctaacatt ccccaccttg1200acgaactgaa taaaggggcc agcttcccag ttgcactcta tgaatttcca cacgctctaa1260aacagtatct cgacgacttt gtaaaaactg tttctttttc tgacgtcatc aaaggaattc1320gtagccctga tgtagccaac attgccaatg cgcaaattga tggacatcaa atttccaaag1380ctgaatatga actggcccgc cactccttca gaccaagact tcaagccacc tatcgcaact1440acttcaaact gaatagatta gatgctattc tcttcccaac agcacccttg gtggccagac1500ccataggtca ggattcctca gttatccaca atggcacgat gctggacaca ttcaagatct1560acgtgcgaaa tgtggaccca agcagcaacg caggcctacc tggcttgagc attcctgttt1620gcctgacacc tgatcgcttg cctgttggaa tggagatcga tggattagcg gattcagacc1680aacgtctgtt agcaatcggg ggggcattgg aagaagccat tggattccga tattttgccg1740gtttacccaa ttaaactttc taccatgttc gtttttacaa tttttcagat tgatgacaat1800caatccttgt attgcgtcta tgaacaacag tgccttatgt tataaatcga ataataactt1860gcgatggaga ttttgaacaa actttaattt atgatttaac caataaaagt ctttgcaata1920atcatgttcg ataaataatt ttattatcag tgataaactt tagatatttc ttggaatagg1980catcttcata taacaataat tctttttcga atttaaatta tatatcttaa gcaaattaca2040tttttcctaa attataggga aatataatta aagttcaagc aatcctattt aggcataaag2100tagttaatac aatttatata atatataatt tgccgtccac tatcctttac aaatttgtca2160aatctgcatt atgaaattaa tgactttttt gaattgtctc gccgtgtgag gacagacgtg2220aaggcaccca ccttttaatt tggatgcacc tctcacctgc tacaacatcg ataccgtcga2280
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1.一种分离的URO蛋白，其特征在于，它含有具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。
2.如权利要求1所述的URO蛋白，其特征在于，该多肽选自(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影响植物木质素含量或分枝数量的由(a)衍生的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该核苷酸序列编码权利要求1所述的URO蛋白。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQID NO2所示氨基酸序列的多肽和驱动该基因表达的上游启动子区序列。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自以下序列中的一种(a)具有SEQ ID NO1所示的序列；(b)在SEQ ID NO3中第1-3519位所示的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-4836位所示序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
8.一种降低植物中木质素含量或增加植物分枝数量的方法，其特征在于，该方法包括增加所述植物中URO基因或其同源基因的表达。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过插入T-DNA序列而增强该URO基因或其同源基因的表达。
10.一种改良植物的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有URO蛋白DNA编码序列，所述的影响植物木质素含量或分枝数量蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影响植物木质素含量或分枝数量的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该URO蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述URO蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供一种拟南芥UPRIGHT ROSETTE(URO)基因及其用途。通过调控该基因可降低植物中木质素含量和增加植物分枝数量。本发明还涉及该基因在降低植物木质素和增加植物分枝数量方面的用途。
文档编号A01H1/00GK1887904SQ20051002716
公开日2007年1月3日 申请日期2005年6月27日 优先权日2005年6月27日
发明者孙越, 袁政, 黄海 申请人:中国科学院上海生命科学研究院