专利名称：诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法。
背景技术：
小立碗藓隶属葫芦藓科，小立碗藓属，是迄今为止同源重组频率最高的陆生植物，它的基因组为460mb，是拟南芥的4倍，和水稻基因组相差不多，染色体为27条。近年来，Schaefer DG等研究所经过实验证明其同源组频率和酵母差不多，是拟南芥的1000倍。小立碗藓已成为继拟南芥后植物界中又一模式植物。由于小立碗藓具有较高的同源重组率，越来越多的学者以其作为研究对象，在功能基因组学、植物生理、发育生物学、系统进化学等方面进行广泛的研究，这就需要大量小立碗藓，这样靠自然生长远远不能满足需要。但目前，国内外还缺乏关于小立碗藓的组织和细胞的培养技术，经过查新，还没有出现关于诱导小立碗藓愈伤组织并生成配子体的方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，通过诱导愈伤组织并分化生成配子体，从而得到大量繁殖的小立碗藓，满足在功能基因组学、植物生理、发育生物学、系统进化学等方面的需要。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现本发明提供一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，该方法具有以下步骤1、将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0-2％，并含0-0.5mg/L的6-BA和0-0.5mg/L的KT的一种或两种激素的Knop培养基上进行诱导培养，诱导培养天数为28天；2、将培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的6-BA的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的2，4-D的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的KT的Knop分化培养基上进行分化培养，培养天数为21天。
上述诱导培养和分化培养的条件均为培养温度为24-26℃，光照周期为12h/d，光照度为3000-4000lx。
上述步骤1)中对小立碗藓愈伤组织进行诱导培养所使用的糖浓度为0.5％的Knop培养基中，添加0.1mg/L的KT激素或糖浓度为2％的Knop培养基中，添加0.05mg/L的KT激素或糖浓度为2％的Knop培养基中，添加0.05mg/L的6-BA激素为最佳，诱导小立碗藓愈伤组织的效果最为理想。愈伤组织结构较为松散，颜色嫩绿，且褐化率低。
上述步骤2)中将诱导出的小立碗藓愈伤组织转接到未添加任何激素的Knop培养基中为最佳，分化出的配子体最多。
本发明提供的一种诱导小立碗藓愈伤组织并分化生成配子体的方法，其是运用组织培养技术，在改良的Knop培养基中添加不同种类和浓度配比的植物激素诱导小立碗藓的愈伤组织使其分化出正常的植株，从而大量繁殖小立碗藓，作为各种试验的材料，以满足对小立碗藓的大量需求。
图1是本发明实施例1的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图2是本发明实施例2的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；
图3是本发明实施例3的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图4是本发明实施例4的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图5是本发明实施例5的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图6是本发明实施例6的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图7是本发明实施例7的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图8是本发明实施例8的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图9是本发明实施例9的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图10是本发明实施例10的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图11是本发明实施例11的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图12是本发明实施例12的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图13是本发明实施例13的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图14是本发明实施例14的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图15是本发明实施例15的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图16是本发明实施例16的小立碗藓愈伤组织诱导培养效果图；图17是本发明实施例17的小立碗藓愈伤组织分化培养后的效果图；图18是本发明实施例17的小立碗藓愈伤组织分化培养后的另一效果图；图19是本发明实施例19的小立碗藓愈伤组织分化培养后的效果图；图20是本发明实施例20的小立碗藓愈伤组织分化培养后的效果图；具体实施方式
一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，该方法具有以下步骤1、将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0-2％，并含0-0.5mg/L的6-BA和0-0.5mg/L的KT的一种或两种激素的Knop培养基上进行诱导培养，诱导培养天数为28天；
2、将培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的6-BA的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的2，4-D的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的KT的Knop分化培养基上进行分化培养。
本发明的诱导培养和分化培养的条件均为培养温度为24-26℃，光照周期为12h/d，光照度为3000-4000lx。
本发明的Knop培养基为常用的植物培养基，即每1L Knop中含有KCL0.07604g，MgSO4·7H2O 0.8282g，KH2PO40.2504g，Ca(NO3)2·4H2O 1.0013g，CuSO4·5H2O0.027mg，KI 0.014mg，ZnSO4·7H2O 0.027mg，H3BO30.309mg，Na2MoO4·2H2O0.012mg，MnCl2·4H2O 0.198mg，CoCl2·6H2O 0.027mg，FeSO4·7H2O 12.5088mg，酒石酸氨0.4604mg，并加入重量百分比为0.8％的琼脂，且采用1N NaOH将其PH值调节至6.5。
本发明的Knop分化培养基每1L Knop中含有KCL 0.07604g，MgSO4·7H2O0.8282g，KH2PO40.2504g，Ca(NO3)2·4H2O 1.0013g，CuSO4·5H2O 0.027mg，KI0.014mg，ZnSO4·7H2O 0.027mg，H3BO30.309mg，Na2MoO4·2H2O 0.012mg，MnCl2·4H2O0.198mg，CoCl2·6H2O 0.027mg，FeSO4·7H2O 12.5088mg，酒石酸氨0.4604mg，并加入重量百分比为0.5％的葡萄糖和重量百分比为0.8％的琼脂，且采用1N NaOH将其PH值调节至6.5。
以下通过实施例进一步说明本发明，但应理解，这些实施例只是示例性的，本发明并不局限此。以下实施例只是所使用的Knop培养基的糖浓度不同，及添加的6-BA激素浓度和KT激素浓度不同，或所使用的Knop分化培养基未添加任何生长物质、添加不同的6-BA激素、2，4-D激素、KT激素而已。
下述实施例1至实施例16为本发明小立碗藓愈伤组织诱导培养的实施例。
实施例1
将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0％，未添加6-BA激素和KT激素的Knop培养基上进行诱导培养，诱导培养天数为28天后；小立碗藓未被诱导形成愈伤组织。不能进行分化培养。
实施例2将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0％，添加0.05mg/L的6-BA激素和0.05mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织小，且褐化严重，褐化率为100％。
实施例3将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0％，添加0.1mg/L的6-BA激素和0.1mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织小，且褐化严重，褐化率为100％。
实施例4将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0％，添加0.5mg/L的6-BA激素和0.5mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织小，且褐化严重，褐化率为100％。
实施例5将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0.5％，添加0.1mg/L的6-BA激素，未添加KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织较大，结构紧密，但褐化严重，褐化率为95％。
实施例6
将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0.5％，添加0.5mg/L的6-BA激素和0.05mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织较大，结构紧密，但褐化严重，褐化率为95％。
实施例7将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为1％，添加0.5mg/L的6-BA激素，未添加KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织较大，结构紧密，但褐化严重，褐化率为95％。
实施例8将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为1％，未添加6-BA激素，添加0.5mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织较大，结构较为松散，褐化率约为85％。
实施例9将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为1％，添加0.1mg/L的6-BA激素和0.05mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织较大，结构较为松散，褐化率约为85％。
实施例10将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为2％，添加0.1mg/L的6-BA激素和0.5mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织较大，结构较为松散，褐化率约为85％。
实施例11
将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为2％，添加0.5mg/L的6-BA激素和0.1mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织较大，结构较为松散，褐化率约为85％。
实施例12将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0.5％，添加0.05mg/L的6-BA激素和0.5mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织体积大，结构紧密，褐化率约为75％。
实施例13将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为1％，添加0.05mg/L的6-BA激素和0.1mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织体积大，结构紧密，褐化率约为75％。
实施例14将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0.5％，未添加6-BA激素，添加0.1mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织大，结构松散，褐化率较低，褐化率约为50％。
实施例15将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为2％，添加0.05mg/L的6-BA激素，未添加KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织大，结构松散，褐化率较低，褐化率约为50％。
实施例16
将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为2％，未添加6-BA激素，添加0.05mg/L的KT激素，诱导培养天数为28天后；小立碗藓被诱导形成的愈伤组织大，结构紧密，褐化率最低，仅为15％。
从以上实施例中可以看出，添加葡萄糖的培养基中诱导出的愈伤组织较大，那是因为葡萄糖为愈伤组织生长提供了所需的碳源，但糖浓度的大小对愈伤组织的生长并无明显影响。
并且可以看出，只要添加6-BA或KT任一种激素或两种激素都添加的培养基能成功诱导出愈伤组织。通过实施例发现，添加单一激素的诱导效果较为理想，尤其实施例5、实施例15和实施例16的效果最为理想。
实施例17至实施例20为本发明小立碗藓愈伤组织诱导培养后，进行分化培养的实施例。
实施例17将上述实施例2至实施例16培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到未添加任何激素的Knop分化培养基上进行分化培养；培养21天后就可观察到从小立碗藓愈伤组织上有正常的配子体长出，且该实施例生成的配子体最多。
实施例18将上述实施例2至实施例16培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到添加0.5mg/L6-BA激素的Knop分化培养基上进行分化培养；培养21天后就可观察到从小立碗藓愈伤组织上有正常的配子体长出。
实施例19将上述实施例2至实施例16培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到添加0.5mg/LKT激素的Knop分化培养基上进行分化培养；培养21天后就可观察到从小立碗藓愈伤组织上有少数配子体长出。
实施例20将上述实施例2至实施例16培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到添加0.5mg/L2，4-D激素的Knop分化培养基上进行分化培养；培养21天后就可观察到从小立碗藓愈伤组织上，长出的原丝体最多，但配子体较少。
在本发明步骤1)中采用实施例5或实施例15或实施例16诱导小立碗愈伤组织的效果最为理想，在步骤2)中采用实施例17分化得到的配子体最多。
权利要求
1.一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于该方法具有以下步骤1)、将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0-2％，并含0-0.5mg/L的6-BA和0-0.5mg/L的KT的一种或两种激素的Knop培养基上进行诱导培养，诱导培养天数为28天；2)、将培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的6-BA的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的2，4-D的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L的KT的Knop分化培养基上进行分化培养，培养天数为21天。
2.根据权利要求1所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于所述诱导培养和分化培养的条件均为培养温度为24-26℃，光照周期为12h/d，光照度为3000-4000lx。
3.根据权利要求1或2所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于上述步骤1)中对小立碗藓愈伤组织进行诱导培养所使用的糖浓度为0.5％的Knop培养基中，添加0.1mg/L的KT激素，上述步骤2)中将诱导出的小立碗藓愈伤组织转接到未添加任何激素的Knop分化培养基中。
4.根据权利要求1或2所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于上述步骤1)中对小立碗藓愈伤组织进行诱导培养所使用的糖浓度为2％的Knop培养基中，添加0.05mg/L的KT激素，上述步骤2)中将诱导出的小立碗藓愈伤组织转接到未添加任何激素的Knop分化培养基中。
5.根据权利要求1或2所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于上述步骤1)中对小立碗藓愈伤组织进行诱导培养所使用的糖浓度为2％的Knop培养基中，添加0.05mg/L的6-BA激素，上述步骤2)中将诱导出的小立碗藓愈伤组织转接到未添加任何激素的Knop分化培养基中。
6.根据权利要求1或2所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于所述Knop培养基加入重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop培养基PH值调节至6.5；所述Knop分化培养基每1L Knop中含有KCL 0.07604g，MgSO4·7H2O 0.8282g，KH2PO40.2504g，Ca(NO3)2·4H2O 1.0013g，CuSO4·5H2O 0.027mg，KI 0.014mg，ZnSO4·7H2O 0.027mg，H3BO30.309mg，Na2MoO4·2H2O 0.012mg，MnCl2·4H2O 0.198mg，CoCl2·6H2O 0.027mg，FeSO4·7H2O12.5088mg，酒石酸氨0.4604mg，并加入重量百分比为0.5％的葡萄糖和重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop分化培养基PH值调节至6.5。
7.根据权利要求3所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于所述Knop培养基加入重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop培养基PH值调节至6.5；所述Knop分化培养基每1L Knop中含有KCL 0.07604g，MgSO4·7H2O 0.8282g，KH2PO40.2504g，Ca(NO3)2·4H2O 1.0013g，CuSO4·5H2O 0.027mg，KI 0.014mg，ZnSO4·7H2O 0.027mg，H3BO30.309mg，Na2MoO4·2H2O 0.012mg，MnCl2·4H2O 0.198mg，CoCl2·6H2O 0.027mg，FeSO4·7H2O12.5088mg，酒石酸氨0.4604mg，并加入重量百分比为0.5％的葡萄糖和重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop分化培养基PH值调节至6.5。
8.根据权利要求4所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于所述Knop培养基加入重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop培养基PH值调节至6.5；所述Knop分化培养基每1L Knop中含有KCL 0.07604g，MgSO4·7H2O 0.8282g，KH2PO40.2504g，Ca(NO3)2·4H2O 1.0013g，CuSO4·5H2O 0.027mg，KI 0.014mg，ZnSO4·7H2O 0.027mg，H3BO30.309mg，Na2MoO4·2H2O 0.012mg，MnCl2·4H2O 0.198mg，CoCl2·6H2O 0.027mg，FeSO4·7H2O12.5088mg，酒石酸氨0.4604mg，并加入重量百分比为0.5％的葡萄糖和重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop分化培养基PH值调节至6.5。
9.根据权利要求5所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于所述Knop培养基加入重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop培养基PH值调节至6.5；所述Knop分化培养基每1L Knop中含有KCL 0.07604g，MgSO4·7H2O 0.8282g，KH2PO40.2504g，Ca(NO3)2·4H2O 1.0013g，CuSO4·5H2O 0.027mg，KI 0.014mg，ZnSO4·7H2O 0.027mg，H3BO30.309mg，Na2MoO4·2H2O 0.012mg，MnCl2·4H2O 0.198mg，CoCl2·6H2O 0.027mg，FeSO4·7H2O12.5088mg，酒石酸氨0.4604mg，并加入重量百分比为0.5％的葡萄糖和重量百分比为0.8％的琼脂，且将上述Knop分化培养基PH值调节至6.5。
10.根据权利要求6至9任一权利要求所述的一种诱导小立碗藓产生愈伤组织并分化生成配子体的方法，其特征在于采用1N NaOH将上述Knop培养基和Knop分化培养基的PH值调节至6.5。
全文摘要
本发明涉及一种诱导小立碗藓愈伤组织并分化生成配子体的方法，其步骤为1)将小立碗藓消毒后，切取小立碗藓的茎尖接种到糖浓度为0－2％，并含0－0.5mg/L的6－BA和0－0.5mg/L的KT的一种或两种激素的Knop培养基上进行诱导培养，诱导培养天数为28天；2)将培养28天后产生的小立碗藓愈伤组织转接到Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L6－BA的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/L2，4－D的Knop分化培养基上进行分化培养；或转接到含0.5mg/LKT的Knop分化培养基上进行分化培养，培养天数为21天。本发明运用组织培养技术，在改良的Knop培养基中添加不同种类和浓度配比的植物激素诱导小立碗藓的愈伤组织使其分化出正常的植株，从而大量繁殖小立碗藓，以满足对小立碗藓的大量需求。
文档编号A01H4/00GK1685809SQ20051002661
公开日2005年10月26日 申请日期2005年6月9日 优先权日2005年6月9日
发明者曹同, 陈静文 申请人:上海师范大学