可将生物活性化合物递送到反刍动物肠道的细菌的培养方法

专利名称：可将生物活性化合物递送到反刍动物肠道的细菌的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于将生物活性化合物递送到反刍动物胃肠道的微生物的鉴别方法，该微生物对瘤胃内的灭活作用天然耐受，本发明还涉及一种对瘤胃内的灭活作用耐受性较差的有益菌的培养方法，以使其更能耐受对瘤胃内的灭活作用。当通过口腔给反刍动物时，这些微生物能够通过胃肠到递送给反刍动物整个细胞及其所包含的营养成分和生物活性分子。本发明还包括培养的更能耐受瘤胃内的灭活作用，可用于胃肠道递送生物活性化合物给反刍动物的微生物，以及以其补充反刍动物饲料的方法。
背景技术：
基于双岐杆菌(Bifidobacterium)、Propionibacerium和乳酸菌(Lactobacillus)的益生菌培养物越来越多地用于单胃家畜和人类以维护其肠道功能。据称其益处包括促进消化、改善免疫功能和减轻胃肠道不适。虽然以酵母和真菌类以生菌为主的益生菌在反刍动物中也在使用，但是很难保证这些益生菌能过通过瘤胃，进入小肠和大肠，这就限制了肠道功能益生菌对反刍动物中的用处。
瘤胃是细菌进入反刍动物体内的主要障碍，试验表明饲料中添加的细菌培养物在离开瘤胃时只有不到10％能被摄取。原生动物对细菌的吞噬和消化作用是瘤胃内细菌降解的主要原因。瘤胃原生动物降解细菌的第一步，也是限速步骤时是细胞壁的降解。以前的研究表明这种降解深受细胞壁成分和组成的影响，而实际上，在培养过程中如果存在持续的降解细胞壁的酶，溶菌酶的压力，细胞壁就有可能“变硬”，从而更能耐受原生动物的吞噬作用。
在反刍动物，消化的饲料进入网-瘤胃——反刍动物拥有的多个胃是中的第一的。吞咽的饲料在网-瘤胃中预消化或被细菌发酵作用降解。大量的消化的蛋白在网-瘤胃中降解成可溶性的多肽和氨基酸。一部分多肽和氨基酸非常浪费地转变成氨，不能再被反刍动物利用。剩余的部分被瘤胃内的微生物利用并整合到其自身的生物体中。当瘤胃内容物进入胃和肠时，瘤胃中部分微生物的生物量和残余的瘤胃内容物一起，从网-瘤胃中排出。这些微生物体随后在小肠被消化，为反刍动物提供营养。然而，网-瘤胃中的相当大部分细菌被寄生在网-瘤胃中的原生动物消灭和消化。这对于宿主反刍动物来讲是很浪费的过程，因为细菌细胞及其所含的营养没有排出瘤胃，并且没有贡献为反刍动物的营养。
相似地，人们给动物饲喂细菌制剂，该制剂粘附在肠道上皮细胞因此可加快动物生长速度和饲料转化(美国专利No.4,980,164和美国专利No.5,256,425)。然而，在反刍动物，细菌在通过瘤胃时存活率很低。为了克服口服制剂活性的丢失，Batich(美国专利No.6,242,230)描述了一种用凝胶基质封装细菌的方法，从而使细菌可以被递送到动物的肠道。Batich的目的是防止宿主动物针对细菌产生的免疫反应而致的存活率低下。Batich的设计是为了克服宿主的免疫反应，而对原生动物消化没有任何抵抗作用，因此瘤为中的水解环境可导致封装基质的降解。这也是一个昂贵的方法，并且使用了能降低某些微生物活性的化学物质。
酵母比细菌大许多倍，因此对瘤胃中的原生动物吞噬作用不象细菌那样敏感，但是，在瘤胃内它们通常容易裂解。Shiozaki等(美国专利No.4,562,149)描述了一种培养絮凝酵母Saccharomyces cerevisiae的方法，能使细胞增加10～20％的S-腺苷甲硫氨酸。该发明是采用酵母，而不是细菌合成甲硫氨酸的一种尝试。虽然很新颖，但是经济上并不可行，因为酵母合成该氨基酸的效率并不象细菌那样高。另外，没有证据表明这种方法能产生一种能抵抗瘤胃降解作用的产品。
相似地，Ohsumi等(Biosci.Biotech.Biochem.58，1302-1305(1994)描述了一种培养富含赖氨酸的酵母的方法，虽然常常可以观察到野生酵母中赖氨酸的含量的增加，还不能认为该方法是能规避瘤胃的产生赖氨酸的经济的方法。Strauss等(Can.J.Anim.Sci.(2004))使用另外一种酵母——毕赤酵母(Pichia pastori)来表明如果该微生物是基因工程的，它可以用来将某些重组蛋白携带到反刍动物的小肠中。然而，Pichia pastoris被认为是不安全的，不能用于饲喂家畜。
Bolla等(美国专利6,737,262)描述了一种将基因工程转化的真菌或者其它微生物整合到饲料中的方法，然而这些微生物只能产生多肽或至少两个氨基酸，而不是单个的氨基酸。另外，发明人也说明为了保证多肽能够规避瘤胃环境，可能还需要进一步的包裹。
在以上的例子中，都需要对酵母细胞进行大量的筛选活基因工程操作。典型的絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)饲喂给家畜益能提供瘤喂可用的营养物质，但不太适合产生大量的在小肠有活性的生物活性分子。虽然细菌在商业上可用于产生比较木范围更大的生物活性化合物和营养成分，其目的是为了使化合物分泌出细胞外，从而使化合物更易分离。目前还没有发明一种细菌制剂的培养方法，不管是通过大量的菌种筛选还是培养条件，能使细菌及其中的生物活性分子不受瘤胃的降解。
为了生产适合饲胃反刍动物的细菌制剂、营养成分和其它生物活性化合物，保护这些活形成分抵抗瘤胃中微生物降解是非常重要的。众所周知，如果保护生长限制必需的氨基酸和其它生物活性化合物的来源不被瘤胃中的微生物降解作用影响，之后可以被动物在胃肠道中吸收，就可以提高肉、羊毛和/或牛奶的产率。
大量的发明通过采用化学基质进行包裹、包衣或包埋的方法来稳定生物活性化合物或营养物质。美国专利No.3,959,493提供了一种含有生物活性化合物的在瘤胃内稳定的产品，该产品是用脂肪酸保护的。授予Grass等的美国专利No.3,655,864，讲述了可允许瘤胃后递送生物活性饲料添加剂的组合物，该组合物是用一种液态不饱和高级脂肪酸包埋在甘油三硬脂酸酯基质中，或者用甘油三硬脂酸酯基质包衣的。
授予Drake等的美国专利No.4,473,545，叙述了动物饲料添加剂，它含有由相对不溶的粘合剂，一种可溶颗粒物质和活性物质组成的组合物。该颗粒物质在特定的pH条件下易溶，该颗粒物质的溶解可以增加粘合剂的透水性从而使放活性物质。
美国专利No.4,533,557讲述了一种反刍动物的饲料添加剂，它包含一种片剂或者颗粒剂形式的混合物，由至少一种生物活性成分、壳聚糖和保护性的长链脂肪酸组成。美国专利No.6,238,727和美国专利No.5,885,610描述了一种不溶性的必需氨基酸的矿物质的盐的生产，因其在瘤胃内不溶所以不会被微生物降解，从而之后可以在小肠被吸收。
Klose(美国专利No.6,013,286)描述了一种物质的组合物和给反刍动物饲喂生物活性化合物的方法，该方法能使化合物不直接进入瘤胃，而是完整无损地进入小肠。本方法需要一种比重为0.3～2.0的很特殊的物质，并且该颗粒包括一个用疏水膜完全包裹的活性物质的核心。另外，在疏水膜表面还需要一种表面活性剂以保证颗粒不会在瘤胃内漂浮。
以上所有发明的生物活性化合物都被包裹或包埋在基质中以保护其不被瘤胃降解，需要首先由微生物发酵或者化学合成得到该化合物，然后纯化并包封。这种多步骤的方法不仅昂贵，而且不能生产出在瘤胃中得到保护的生物活性化合物。在每一步骤回收的时候都有产品或者生物活性的损失。
L-赖氨酸是由产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)发酵产生的。谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)菌株的产量可以通过菌株筛选、发酵工程(例如搅拌、供氧、培养基组分)的改善来提高。同时，利用重组DNA技术来增加单个生物合成基因的数量也用来提高L-赖氨酸的产量。通过这种方式，通过增加表达某一物质的DNA片断的数量，例如表达抗氨乙基半胱氨酸(EP88166)，表达反馈抑制天冬氨酸激酶(EP387527)，二氢吡啶二羧酸合成酶(EP197335)，天冬氨酸氨基转移酶(EP219027)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EP143195 and EP358940)，天门冬氨酸半醛脱氢酶(EP219027)和丙酮酸脱羧酶(DE19831609)，已经获得了L-赖氨酸产量的增加。
在L-赖氨酸的工业化生产中，需要从菌体中分离出L-赖氨酸已增加细菌合成L-赖氨酸的效率。已经发现基因LysE负责将L-赖氨酸输出到谷氨酸棒状杆菌菌株的胞浆外并进入到基质中，这对于有效的L-赖氨酸的工业化生产使非常关键的(Tryfona et al.，Process Biochem(2004))。增加LysE L-赖氨酸输出载体的活性也能增加L-赖氨酸的产量(DE19548222)。
目前存在的问题是缺少一种能保护细菌和其它微生物不被瘤胃降解，从而能够完整地递送到小肠的措施。同样，它们产生的活性化合物也必须分泌到也必须从细菌细胞分泌出来才能被纯化，一旦纯化后，生物活性化合物由必须通过包裹或者包埋技术保护来防止瘤胃的降解作用。

发明内容
本发明发现了可用于为反刍动物通过胃肠道递送生物活性化合物的耐受瘤胃灭活作用的革兰氏阳性细菌(G+细菌)菌株鉴别方法。还发现了提高可用于为反刍动物通过胃肠道递送生物活性化合物的耐受瘤胃灭活作用的细菌菌株耐受瘤胃灭活作用的方法，无论该菌株对瘤胃灭活作用的天然耐受性如何。
因此，本发明的一个方面，是提供了一种评估细菌菌株耐受瘤胃体内灭活作用的体外方法，该方法包括如下步骤在含有天然瘤胃液或合成瘤胃液的营养培养基中体外培养一种可用于为反刍动物通过胃肠道递送生物活性化合物的G+细菌菌株；和测定随着时间变化细菌培养物中蛋白降解的情况。
选择瘤胃液是为了模拟细菌菌株在被喂食时所遇到的瘤胃环境。天然瘤胃液取自喂食24小时后健康反刍动物的瘤胃内容物。合成瘤胃液是一种为了模拟瘤胃环境所选择的物质的混合物，包括一种或几种能够在瘤胃内杀灭微生物的摄食原生动物。本领域的普通技术人员很容易找到这样的摄食原生动物。
本发明的方法优选地，是按照Wallace等的方法(Br.J.Nutr.，58，313-323(1987))测定C14标记的亮氨酸释放来估计蛋白降解情况，该内容包括在此处作为参考文献。其结果用速率表示为每小时降解的细菌占当前残余细菌的％。本发明来说，每小时降解速率小于8％的细菌菌株被定义为耐受瘤胃灭活作用。优选每小时降解速率小于6％的细菌菌株给反刍动物递送生物活性化合物，更优选每小时降解速率小于4％的菌株。
因此，耐受瘤胃灭活的菌株中，每天将有20％以上给动物的喂养量的完好地通过网瘤胃。优选的菌株每天将有50％以上给动物的喂养量完好地通过网瘤胃；更优选菌株每天将有80％以上给动物的喂养量完好地通过网胃。
因此，本发明这一方面的一个实施方式进一步包括根据Wallace等的方法测定C14标记的亮氨酸释放来估计细菌菌株降解速率，每小时小于8％作为耐受瘤胃灭活作用的鉴别步骤。
根据本发明这一方面的另一个实施方式，本发明中有益细菌菌株是一种产赖氨酸的细菌菌株，优选一种谷氨酸棒状杆菌(Cornyebacterium glutamicum)菌株，更优一种赖氨酸生产过剩的谷氨酸棒状杆菌菌株，包括遗传改造的赖氨酸生产过剩的谷氨酸棒状杆菌菌株。然而，实际上本方法可用于任何需要评价对瘤胃灭活作用耐受的给反刍动物通过肠胃递送生物活性化合物的菌种。
对本发明而言，“胃肠道递送”定义为包括通过反刍动物的皱胃、小肠和大肠递送。确切地说，生物活性化合物的递送位置在于所需递送的生物活性化合物的性质，这一点，对于一个寻求使用该化合物的本技术领域的普通技术人员来讲是可以理解的。本发明没有改变递送的位置，而是保护生物活性化合物在递送时不被瘤胃灭活。
本发明这一方面还提供了一种方法，能够筛选瘤胃降解性降低的细菌菌株，该菌株可用于为反刍动物胃肠道递送某一细菌和包含在之内的生物活性化合物，其中的细菌细胞壁可以提供瘤胃规避保护细胞内容物。筛选到的细菌菌株可能足以耐受瘤胃降解，不需要进一步改造就可以把这些有益菌饲喂给反刍动物。
已经发现的足以耐受瘤胃的改变作用，不需要进一步改造就可以将其细胞内容物喂食给反刍动物的细菌菌株包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13058菌株、13825菌株、14066菌株、14067菌株、14068菌株、21127菌株和700239菌株。因此，本发明另一方面提供了一种瘤胃规避饲料添加剂，含有含赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株生物体，菌株选自谷氨酸棒状杆菌ATCC13058菌株，13825菌株，14066菌株，14067菌株，14068菌株，21127菌株和700239菌株。
本发明还提供了一种可以增强细菌菌株对瘤胃灭活作用耐受性的方法。本发明这一方面的方法，既可以用于经鉴定耐受瘤胃灭活作用的菌株，又可以用于经鉴定不能耐受瘤胃灭活作用的菌株。
因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种提高培养的菌株瘤胃灭活作用耐受性的方法，其中的菌株是在营养上对反刍动物有益的G+细菌，该方法包括如下步骤通过至少一次传代，在含有一定量的能有效诱导对原生动物摄食耐受的细菌细胞壁生长的溶菌酶的培养基中培养该菌株；和从含溶菌酶的培养基中回收菌株。
根据本发明这一个方面的一个实施方式，溶菌酶在培养基中的浓度大约为0.01～100μg/ml。根据本发明这一个方面的另一个实施方式，采用多次传代培养，优选的传代次数是大约2～20次。
根据本发明这一个方面的另外一个实施方式，回收步骤是在最后一次传代之后，在此情况下回收该生物量，该细菌的细胞壁耐受瘤胃的降解。然后生物量优选脱水并浓缩按照传统的方法饲喂反刍动物。
根据本发明这一方面的另外一个实施方式，菌株是一种产赖氨酸的菌株，优选地，是Cornye-bacterium glutamicum菌株，更优选地，是已知能够过量产生赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株。然而，实际上本方法同样地适用于任何需增加对瘤胃的耐受性的、可以用来为反刍动物胃肠递送生物活性化合物的菌种。
本发明还包括瘤胃规避饲料添加剂，该添加剂含有细菌生物量，可用于为反刍动物胃肠递送生物活性化合物，对瘤胃灭活作用耐受，可由本发明的任一方法获得；以及使用瘤胃规避饲料添加剂添加到反刍动物饲料中的方法。当包含在动物饲料中提供给反刍动物时，细菌作为为反刍动物胃肠递送生物活性化合物的系统。
下面阐述的本发明的优选的实施方式，结合附图，使本发明前述的和其它的目的、特征和优势更加明显。


图1两个未经溶菌酶培养的谷氨酸棒状杆菌菌株和反刍月形单胞菌(S.ruminantium)Z1081菌株降解率的比较图2同样的两个经溶菌酶培养的谷氨酸棒状杆菌菌株和反刍月形单胞菌Z1081菌株降解率的比较图3经溶菌酶培养的菌株C.gluta-micum ATCC 13869、700239、31269和菌株S.bovisES1在瘤胃液中的降解量的比较图4未经溶菌酶培养和经过溶菌酶培养的同样两个菌株谷氨酸棒状杆菌和菌株S.bovisES1在瘤胃液中的降解率的比较图5未经溶菌酶培养和经过溶菌酶培养的菌株Bifidobacter.Longum、Propionibacteriumfreudenreichii、Lactobacillus raffinolactis、Lacto.fermentum Lactobacillus lactis、Lactobacillus pentosus、Propionibacter.acidipropionici和菌株S.bovis ES1在牛瘤胃液中的降解的比较具体实施方式
为了赋予有益菌对瘤胃降解作用的耐受性，在溶菌酶存在的营养培养基中培养有益菌，优选地，在发酵条件下培养，发酵是培养商业用量的特定生物和优化目标生物活性化合物合成的理想方法。适合的营养培养基的例子包括Lennox培养基(Kumagai et.al.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，69，2051-2056(2005))，CGXII培养基(Keilhauer et al.1993.JBacteriol1755595-5603)，Luria Bertani肉汤培养基(Lennox，E.S.1955.Virology 1190-206)以及Broer和Kramer所描述的复合培养基(J.Bacteriol.1990，172，7241-7248)。
溶菌酶按照能够有效地增强对瘤胃裂解耐受性的浓度加入营养培养基中。溶菌酶的浓度不应该太低，以防在瘤胃中降解表现的改善不能观察到统计上的和商业上显著性的；溶菌酶的浓度也不应该太高，以至于对细菌的生长抑制到令人难以接受的程度。因此，优选地，溶菌酶的浓度为大约0.1～100μg/ml，更优选为大约1～10μg/ml。
优选的方法采用在含有溶菌酶的培养基中系列多次传代。更优选的方法是采用系列传代大约2～10。优选地，每次传代细菌培养的时间为大约12～48小时，并且在溶菌酶存在时总培养时间为大约1～20天。
细菌细胞通过过滤和/或离心收获，浓缩和/或干燥并以商业可接受的方式包装。
本发明使用溶菌酶赋予对瘤胃灭活作用耐受性的方法，可适用于任何为反刍动物通过胃肠道递送生物活性化合物的菌种。这些菌种的例子包括但不限于双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)，罗伊氏乳杆菌(Lacto-bacillus reuteri)，成人型的双叉杆菌(Bifidobacteriumlongum)，右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，嗜热双岐杆菌(Bifidobacterium thermophilum)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，缓慢芽胞杆菌(Bacillus lentus)，嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)，有害片球菌(Pediococc.cerevis.(damnosus))，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)，费氏丙酸桿菌(Propionibacter.freudenreichii)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)，嗜淀粉拟杆菌(Bacteroides amylophilus)，纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)，多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)，乳油链球菌(Streptococcus cremoirs)，瘤胃细菌(Bacteriodes ruminicola)，delbrueckii乳酸菌(Lactobacillus delbrueckii)，丁二酮乳链球菌(Streptococcus diacetilactis)，猪拟杆菌(Bacteroides suis)，发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)，粪链球菌(Streptococcusfaecium)，青春型双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，菌株瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveti-cus)，中间链球菌(Streptococcus intermedius)，动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)，乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，乳链球菌(Streptococcus lactis)，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
得到的饲料添加剂对单胃动物包括人类也是有益的，即使他们并不需要瘤胃规避的特性。
本发明特别适用于G+细菌，因为其有厚厚的肽聚糖细胞壁。G+细的例子包括但不限于分枝杆菌(mycobacteria)，诺卡氏菌(nocardia)，乳酸杆菌(lactobacillus)，链球菌(streptococcus)，杆菌(Bacillus)和棒状杆菌(Corynebacteria)。已经建立的许多商业上有用的产赖氨酸的菌株如谷氨酸棒状杆菌菌株，非常适用于本发明，例如谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239。优选能合成高浓度的L-赖氨酸的Corynebacteria glutamicum菌株，如菌株ATCC strains 21127和700239。还优选外输因子基因LysE缺如的菌株。
可以通过在溶菌酶存在条件下培养获得的菌株来递送的生物活性化合物包括营养物质如氨基酸及其衍生物、氨基酸的羟化同源体、蛋白、碳水化合物、脂类、维生素和动物药物，可以是一种，也可以是两种或两种以上的结合。
生物活性化合物的例子包括氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸等；氨基酸衍生物如N-酰基氨基酸、N-羟甲基甲硫氨酸钙盐、盐酸赖氨酸等；氨基酸的羟化同源体例如2-羟基-4-甲硫基-丁酸及其盐等；碳水化合物如淀粉、蔗糖和葡萄糖等；脂类如ω-3脂肪酸，ω-6脂肪酸，反式脂肪酸等；维生素和有类似维生素功能的物质如维生素A、乙酰维生素A、棕榈酸维生素A，B族维生素如硫胺、盐酸硫胺、核黄素、烟酸、烟碱，泛酸酯钙、泛酸酯胆碱、维生素B6、盐酸维生素B6、氯化胆碱、维生素B12、生物素、叶酸等；p-氨基苯酸、维生素D2、D3、维生素E等。
除了营养物质外，生物活性化合物还可以包括治疗性的化合物包括激素如雌激素、己烯雌酚、己雌酚，甲状蛋白、甲状腺激素、生长激素等；生物活性化合物还包括治疗性的蛋白和多肽，包括酶如淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、乳糖酶和脂酶等；激素类的蛋白如生长激素等；杀菌结合碳水化合物如甘露聚糖和呋喃-寡聚糖和抗菌肽化合物如细菌素。
因此，本发明的方法，除了对天然存在的菌株和通过大量筛选得到的菌株适用外，也可适用于重组菌株。故而能产生目标治疗性多肽或蛋白的基因工程重组菌株，也能通过本发明的方法安全规避瘤胃，通过胃肠道递送多肽或蛋白。
细菌细胞表面的化合物也可通过胃肠道递送，因此，细菌细胞本身也具有价值。另外，在本发明中，那些不具有营养价值但可以竞争肠道的病原的细胞(即竞争排除)也包括在“生物活性化合物”的范畴。
本发明还提供了一种独立的体外鉴别方法，以识别对瘤胃灭活不敏感菌株或者通过在含有溶菌酶的培养基上培养获得对瘤胃灭活作用耐受性的菌株。该评估耐受瘤胃灭活作用的菌株的方法可适用于上述提到的有益菌株。本方法既适用于鉴别那些对瘤胃灭活作用天然耐受的菌株，也适用于那些其耐受瘤胃灭活作用的能力是在含有溶菌酶的培养基中培养而获得的菌株。
该体外方法在含有天然或合成的瘤胃液中的培养基中培养能用于胃肠到递送生物活性化合物的G+菌株，并且测定蛋白随时间降解的速度。培养基中含有大约80～99％(体积百分比)的营养培养基和大约1～20％(体积百分比)瘤胃液。适合的培养基包括Dehority氏培养基(Scott and Dehority，J.Bacteriol.，89，1169.1175(1965))、Hobson氏M2培养基(Hobson，Methods Microbiol.，3B，133-149(1969))和CRT培养基(Wallace et.al.，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，53，965-970(2003))。Hungate(Hungate RE 1966.The rumen and its microbes.Academic Press，New York，NY)和Hobson&Stewart(The Rumen Microbial Ecosystem，Chapman and Hall，London)的书中所描述的许多其它培养基也适用。
选用瘤胃液使为了接近瘤胃环境。天然瘤胃液是从健康反刍动物瘤胃内容物中获得的。例如，瘤胃液可以从瘤胃造瘘的反刍动物取得。瘤胃液优选从同种反刍动物获得，优选从喂食后24hr内获得，更优选在清晨喂食饲胃后大约1～3hr获得。瘤胃液应注意出去不需要的颗粒物。
合成瘤胃液是模仿进入瘤胃可能遇到的环境中的物质制备的。该液体含有一种或几种能杀灭微生物的摄食原生动物，以及细菌生长的营养物质包括糖类、磷酸盐、碳酸氢盐缓冲液、矿物盐、挥发性脂肪酸和维生素。合成瘤胃液的例子Hobson&Stewart有详尽的描述(The Rumen Microbial Ecosystem，Chapman and Hall，London).可致微生物降解的瘤胃原生动物的例子包括前毛属(Epidinium)，Eudiplodinium，均毛中属(Isotricha)密毛虫属(Dasytricha)，内毛属(Entodinium)和多甲亚属(Polyplastro)n(Ivan et.al.2000aJ Anim Sci78，750-759；Ivan et.al.2000b.J Dairy Sci 83，776-787)。
被评估的有益菌在培养基上培养，温度为在瘤胃可能遇到的温度环境，即大约36～40℃。孵育的时间可根据菌株在瘤胃中可能停留的时间选择，一般是1～48hr。为了获取更多的数据，也可以采用更长的时间，例如12～48hr。根据该数据，按照菌株在瘤胃中实际停留的时间，可以推断出蛋白降解的量。
菌株蛋白降解情况用随时间产生的降解产物的重量表示。本发明中优选的方法是按照Wallace等的方法(Wallace et al.，Br.J.Nutr.，58，313-323(1987))测定C14标记的亮氨酸，以此来计算蛋白的降解，其内容作为文献纳入本文。其结果用速率表示为每小时降解的细菌占当前残余细菌的％。本发明来说，每小时降解速率小于8％的细菌菌株被定义为耐受瘤胃灭活作用。优选每小时降解速率小于6％的细菌菌株给反刍动物递送生物活性化合物，更优选每小时降解速率小于4％的菌株。
评价后认为对瘤胃降解不耐受的菌株，即降解速率每小时大于8％的菌株，可以在溶菌酶存在的条件下培养以增强其对瘤胃降解的耐受性。其耐受性的改善情况可在溶菌酶培养后再评价。再评价使用天然瘤胃液或者合成瘤胃液，采用本发明的体外评价方法进行。改善的程度可以用同样单位时间内降解速率减少的百分率来表示。然而，和达到本发明定义的的耐受瘤胃灭活作用的阈值相比，改善的程度并没有那么重要。也就说，耐受大幅度的增加并不一定够，而少量的增加也许就足够了。
鉴定为对瘤胃降解作用耐受的有益菌，或在溶菌酶培养后瘤胃降解作用耐受的有益菌，也可以继续培养(必要使为了增强对瘤胃降解的耐受可加溶菌酶)。用商业发酵设备包括批式培养设备、流加式培养设备和连续培养设备获得商业用量的生物量。生物量可以选择性地用可接受的填充剂、粘合剂和调味剂或类似物混合，成为瘤胃规避饲料添加剂。或者生物量本身即可作为饲料添加剂，可加入反刍动物的饲料中使用。另外，生物量和其它添加剂也可以溶解或者悬浮于液体介质中，作为饲料添加剂喷于饲料。制成何种形式，对于本领域的技术人员来讲实际上是很常规的，众所周知。其它的反刍动物营养物质也可以加于任何一种形式的瘤胃规避饲料添加剂中。
收获的耐受瘤胃降解的细菌细胞可以添加于传统的反刍动物饲料中喂养反刍动物，该饲料常常是反刍动物可食的植物性物质，例如豆类干草、杂草干草、玉米饲料、杂草饲料、玉米、豆类、燕麦、大麦、谷类提取物、啤酒糟、豆粕和棉籽粕，用量按照畜牧营养师推荐的量即可，通常不超过饲料干重的5％。
对于瘤胃保护性的赖氨酸饲料添加剂，例如含有谷氨酸棒状杆菌生物量的饲料添加剂，加入到固体饲料干重的添加剂的量应该是能有效提供每天每kg体重反刍动物的代谢需求的赖氨酸，平均为5～150mg。优选每kg体重反刍动物为15～75g代谢需求的赖氨酸，代谢需求的赖氨酸可用测定瘤胃体外模拟系统的赖氨酸流量计算。也可以用安装胃(或肠)插管的动物，测定赖氨酸到小肠的流量计算，和/或采用代谢需求赖氨酸缺乏的饲料喂养的雌性反刍动物，根据奶中蛋白增加的百分率来计算。大量的本领域技术人员知悉的方法都可用来确定代谢需求的赖氨酸的量。
本发明的瘤胃规避饲料添加剂可以给予任何需要营养添加剂的反刍动物，包括家畜、实验动物、动物园和其它野生展览动物，例如，耕牛、公牛、绵羊和山羊。瘤胃规避饲料添加剂可用于喂养产肉、产奶、产皮毛的家畜或者劳力动物。
以下列举非限制性的实施例来阐释本发明。除另有说明外，所有含量和百分比都是重量或者重量百分比，所有温度均为摄氏度。
实施例实施例1.谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)菌株对原生动物摄食造成的瘤胃降解的敏感性根据Wallace等(Br.J.Nutr.，58，313-323(1987))描述的方法确定瘤胃液中谷氨酸棒状杆菌和反刍月形单胞菌(S.ruminantium)(代表“一般的”瘤胃细菌)的降解。
在好氧Wallace和McPherson培养基中生长谷氨酸棒状杆菌菌株(ATCC 13761和ATCC13869)。在厌氧Wallace和McPherson培养基中生长反刍月形单胞菌Z108。上述Wallace等人的杂志文献中公开了Wallace和McPherson培养基及其制备方法。培养物在39℃下生长过夜。通过在室温下1000g×10分钟离心收集细胞。将细胞重悬于含5mMC14L-亮氨酸的厌氧Coleman缓冲液中，温育过夜(OD＝1.0)，以标记细菌蛋白。取出样品(1ml)，置于0.25ml25％TCA中进行蛋白测定。将两个50μl的等分试样置于闪液(scintillation fluid)中以测定增加的放射性的量。
从三只喂食2小时后的绵羊中取出瘤胃液，用纱布过滤。加入未标记的L-亮氨酸(5mM)，使过滤后的瘤胃液(SRF)保持温暖。将样品(ImL)加入1mL的4％福尔马林中，以进行原生动物计数。
将4.5ml的SRF或缓冲液加入标记后的细菌细胞悬液(0.5ml)，在39℃下培养。分别在0、1、2、3小时取出样品(0.5ml)，置于0.125ml TCA中。在14000rpm下离心样品3分钟，对200μl上清液进行计数，以测定释放的放射性，其代表被原生动物降解的细菌蛋白。
基于代表被原生动物降解的细菌蛋白的放射性的释放，在每个时间点测定降解百分数。用以下等式对数据进行拟合(Mehrez和Orskov，1987)Y＝a+(c-a)*1-(exp[-kd*x])；其中Y＝在特定时间x(小时)的降解；a＝起始降解；c＝最大降解；kd＝降解速率(hr-1)；根据以下等式确定选定的瘤胃传代速率的有效降解性Y＝a+(c*kd)/(Kd+Kp)其中Kp＝瘤胃周转率(turnover rate)结果显示在图1.中。与反刍月形单胞菌Z108相比，谷氨酸棒状杆菌的两个菌株都显示了快速降解。与反刍月形单胞菌Z108的21.9％相比，经过3小时温育后菌株10336和13869分别消失71.2和83.1％。菌株13761和13869在瘤胃周转率0.07hr-1下的有效降解性分别为71.2和53.8％。
实施例2.谷氨酸棒状杆菌在低溶菌酶水平下的生长制备Wallace和McPherson非C14培养基(24×7ml)。向四组试管中的每一个中加入过滤灭菌的溶菌酶(0.1；1.0；10；100；或1000μg/ml)。对最后一组的四支试管，加入0.5ml的Coleman’s D培养基(对照)。用谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13761培养物接种试管，在39℃下温育48小时，在24和48小时对各生物体测定OD值(650nm)。
菌株13761在最低的两个溶菌酶水平(0.1和1μg/ml)下生长良好。在100μg/ml生长减半，在1000μg/ml下生长被完全抑制。
实施例3.在存在溶菌酶的条件下谷氨酸棒状杆菌的生长对原生动物摄食易感性的影响方法与实验1的基本上相同，只是谷氨酸棒状杆菌ATCC 13761和ATCC 13869如实验1中生长，或在溶菌酶的存在下生长(0.5ml的0.25μg/ml溶菌酶；16.7μg/ml终浓度)。和实验1一样，反刍月形单胞菌Z108被用作对照。
结果如图2所示。对所有生物体而言，此实验中的降解都低于实验1中的。当菌株在不存在溶菌酶的(天然)条件下生长时，与反刍月形单胞菌Z108的13.3％相比，经过3小时温育后菌株13761和13869分别消失37.9和42.8％。然而，当在存在溶菌酶的条件下生长时，对菌株13869而言3小时降解减少至15.2％，但对菌株13761没有影响(36.3％)。当不在存在溶菌酶的条件下生长时，菌株13761和13869在瘤胃周转率0.07hr-1下的有效降解性分别为53.8和64.7％；当在存在溶菌酶的条件下生长时，有效降解性分别为36.1和24.5％。
实施例4-6.在存在溶菌酶的条件下谷氨酸棒状杆菌菌株13869、700239和31269的生长对原生动物摄食易感性的影响从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得谷氨酸棒状杆菌菌株13869、700239和31269。根据ATCC的说明，在营养琼脂上使培养物复活，转移到营养肉汤(broth)中。当观察到健康生长时(在营养肉汤中在39℃下经过3×24h传代)，在营养肉汤加或不加(plus orminus)20μg/ml鸡卵白溶菌酶中在39℃下使培养物进行生长3×24h。预先从绵羊的瘤胃中分离牛链球菌ES1，在威尔士Wales大学农业科学研究所(Institute of Rural Sciences，University of Wales，Aberystwyth)培养物保藏中心保存。
通过在含瘤胃液(rumen fluid)的Wallace和McPherson培养基中在39℃下使培养物生长24小时来标记细菌，所述培养基以氨半胱氨酸和L-[U-14C]亮氨酸作为唯一添加的氮源，并且先在溶菌酶存在下生长培养物，然后添加20μg/ml鸡卵白溶菌酶(hens egg whitelysozyme)。通过离心收集细胞，用Coleman盐溶液D(Coleman，1978)清洗一次，再用过滤后的瘤胃液温育。瘤胃液是在早晨喂食后2小时从三只接受青贮草配给(grass silage basedration)的瘤胃造瘘的(rumen-fistulated)牛中抽取的。用四层纱布过滤瘤胃液。
通过在3小时温育过程中释放到三氯乙酸可溶物质中的[14C]测定表观(apparent)蛋白降解。所有培养中均使用终浓度为5mmol/L非标记的L-亮氨酸。
在三小时温育过程中不同细菌在瘤胃液中的破坏(breakdown)示于图3。细菌破坏速率(％/h)的初始比较显示谷氨酸棒状杆菌菌株700239的破坏比其他谷氨酸棒状杆菌菌株或瘤胃细菌(牛链球菌)明显缓慢(谷氨酸棒状杆菌13869，700239和31269，以及牛链球菌ES1分别为5.63，2.58，8.27，6.88％/h SED 1.287，图4)。当单独研究谷氨酸棒状杆菌菌株的数据时，虽然所用菌株之间的破坏速率显著不同，但对这些菌株而言，用溶菌酶预温育显然没有带来改进(表1)。
Table 1-在存在和不存在溶菌酶的条件下的生长对瘤胃液中谷氨酸棒状杆菌菌株13869，700239和31269的破坏的影响


本文所用测试基于Wallace等的描述，其中在存在过量的未标记亮氨酸的瘤胃液中细菌释放的C14亮氨酸被用于测定瘤胃中细菌的破坏。对三种细菌菌株而言，使培养物在溶菌酶中生长对瘤胃液中的破坏速率没有显著的影响，只是数值减少约16％。缺乏影响的两种可能的理由如下所述培养时间在目前的实验中，谷氨酸棒状杆菌与溶菌酶总共温育96小时(在20μg/ml营养肉汤中三次24小时传代，加上一次在Wallace和McPherson培养基中传代以标记细胞)。可能不够时间使培养物针对溶菌酶改变它们的细胞结构。
在不存在溶菌酶的条件下培养物的低降解性在目前的实验中，在不存在溶菌酶的条件下生长的谷氨酸棒状杆菌菌株的降解性从9至3％/h变化。这比先前记录的其他谷氨酸棒状杆菌菌株的数值要低(菌株10334和10337为12和14％/h)，而比B.fibrisolvens的数值(约30％/h)低得多，其中初次观察到溶菌酶可减少降解。相反，本文中牛链球菌的数据与先前观察到的非常接近。溶菌酶保护作用很小的原因可能是细胞已对原生动物攻击产生相关抗性。
值得注意的是，当谷氨酸棒状杆菌700239在存在溶菌酶的条件下生长时，降解速率约为2％/h。假设加入瘤胃的谷氨酸棒状杆菌700239在液相中以相对适度的10％/h的降解速率离开瘤胃，则24小时后约77％的谷氨酸棒状杆菌700239会通过(bypass)瘤胃，低于15％被降解。以更实际的15％/h液体周转计算，超过85％会通过瘤胃，低于12％会被降解。
在目前的实验中，在存在溶菌酶的条件下的生长不能明显地保护被研究的谷氨酸棒状杆菌菌株免于在瘤胃中降解。然而，谷氨酸棒状杆菌菌株700239对在瘤胃中降解有很大的抗性，预期可以提供一种合适的载体，用于使氨基酸(例如赖氨酸)通过瘤胃。
实施例7-13.在存在溶菌酶的条件下，对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、费氏丙酸杆菌(Propionibacerium freudenreichii)、Lactobacillus raffinolactis、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳杆菌(Lacto-bacillus lactis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、戊糖乳杆菌和产酸丙酸杆菌(Propionibaceriumacidipropionici)菌株的生长对原生动物摄食的影响通过在存在溶菌酶的条件下，体外生长除谷氨酸棒状杆菌之外的七种不同的可能的益生菌(probiotic organisms)，研究对它们在瘤胃液中破坏的影响。如实施例1-6中那样，用典型的瘤胃细菌-牛链球菌作为对照。
从国家工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB)和国家食品细菌保藏中心(Aberdeen)获得长双歧杆菌、费氏丙酸杆菌和产酸丙酸杆菌。从Kevin Hillman博士(Gutbugs，UK)那里获得Lactobacillus raffinolactis、发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌和戊糖乳杆菌。
如实施例4-6所述生长并标记细菌(包括牛链球菌ES1)，测定表观蛋白破坏。图5显示了不同细菌在瘤胃液中温育3小时后的破坏情况。在存在溶菌酶的条件下的生长使牛链球菌、费氏丙酸杆菌和L.raffinolactis的破坏降低了超过70％。戊糖乳杆菌、长双歧杆菌和发酵乳杆菌的破坏降低了40至50％，而对乳酸乳杆菌或产酸丙酸杆菌(表2)的破坏没有影响。
表2-在存在和不存在溶菌酶的条件下的生长对瘤胃液中的前生命期生物体的影响

前述实施例和对优选的实施方式的描述，应认为是对由权利要求定义的本发明的解释，而不是限制。可以使用上文给出的特征的大量组合，而不背离有权利要求给出的本发明。这些变化不应被认为背离了本发明的精神和范围，所有的这些变化被认为包括在权利要求的范围之中。
权利要求
1.一种提高产赖氨酸革兰氏阳性细菌菌株的瘤胃灭活抗性的方法，该方法包括以下步骤在生长培养基中使细菌菌株培养物生长至少传代一次，所述培养基包含溶菌酶，溶菌酶的含量可以有效地诱导抵抗原生动物摄食的细菌细胞壁的生长；并且从含溶菌酶的培养基中回收细菌菌株。
2.权利要求1的方法，其中所述细菌菌株是谷氨酸棒状杆菌的菌株。
3.权利要求2的方法，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株是选自13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239的ATCC菌株。
4.权利要求2的方法，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株过量产生赖氨酸。
5.权利要求4的方法，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株经过遗传修饰以过量产生赖氨酸。
6.权利要求1的方法，其中所述生长培养基中溶菌酶浓度为约0.01至约100μg/ml。
7.权利要求6的方法，其中所述溶菌酶浓度为约0.1至10μg/ml。
8.权利要求1的方法，其中在含有溶菌酶的生长培养基中进行多次传代。
9.权利要求8的方法，其中在含有溶菌酶的生长培养基中进行约2至约10次传代。
10.一种抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其包含用权利要求1的方法培养的产赖氨酸细菌菌株。
11.权利要求10的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其中所述细菌菌株是谷氨酸棒状杆菌的菌株。
12.权利要求11的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株过量产生赖氨酸。
13.权利要求12的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株经过遗传修饰以过量产生赖氨酸。
14.权利要求10的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其中所述细菌菌株的瘤胃降解速率低于每小时约8％，所述速率是根据Wallace等的方法，通过C14标记的亮氨酸的释放而测定的。
15.权利要求14的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其中所述降解速率低于每小时约6％。
16.一种抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其包含产赖氨酸细菌菌株，所述细菌菌株的瘤胃降解速率低于每小时约8％，所述速率是根据Wallace等的方法，通过C14标记的亮氨酸的释放而测定的。
17.权利要求14或16的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其中瘤胃的降解速率使得每天给反刍动物喂食的细菌剂量中超过20％被完好地递送通过网胃-瘤胃(reticulo-rumen)。
18.权利要求14或16的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂，其中所述细菌菌株是选自13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239的谷氨酸棒状杆菌ATCC菌株。
19.一种提高反刍动物饲料配给(ration)的代谢可利用赖氨酸含量的方法，其包括向所述饲料配给中添加有效量的权利要求10或16的抗瘤胃的赖氨酸饲料添加剂。
20.权利要求19的方法，其中所述饲料添加剂被添加到所述饲料配给中，其添加量可以有效地为每公斤反刍动物体重提供约5至150mg的代谢可利用赖氨酸。
21.权利要求19的方法，其中所述反刍动物是奶牛。
22.一种评估产赖氨酸细菌菌株对体内瘤胃灭活的体外方法，该方法包括以下步骤在营养培养基中体外培养革兰氏阳性产赖氨酸细菌菌株，所述营养培养基含有天然或合成的瘤胃液；并且测定细菌培养物中蛋白降解，作为时间的函数。
23.权利要求22的方法，其中所述细菌菌株是谷氨酸棒状杆菌的菌株。
24.权利要求23的方法，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株是选自13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239的ATCC菌株。
25.权利要求23的方法，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株过量产生赖氨酸。
26.权利要求25的方法，其中所述谷氨酸棒状杆菌菌株经过遗传修饰以过量产生赖氨酸。
27.权利要求22的方法，其中所述测定蛋白降解步骤包括根据Wallace等的方法测定C14标记的亮氨酸的释放。
28.权利要求22的方法，其中所述方法进一步包括鉴别抵抗瘤胃灭活的细菌菌株的步骤，所述菌株具有每小时低于8％的降解速率。
29.权利要求22的方法，其中所述瘤胃液是天然瘤胃液。
30.权利要求22的方法，其中所述瘤胃液是合成的瘤胃液。
31.权利要求28的方法，其中所述方法进一步包括鉴别抵抗瘤胃灭活的细菌菌株的步骤，所述菌株所具有的瘤胃降解速率使得每天给反刍动物喂食的细菌剂量的超过20％可以完好地被递送通过网胃-瘤胃。
32.权利要求31的方法，其中被鉴别的菌株所具有的降解速率使得超过50％的所述剂量完好地递送。
全文摘要
提高培养的革兰氏阳性细菌菌株对瘤胃灭活的抗性的方法，用于向反刍动物胃肠道递送生物活性化合物，该方法包括在生长培养基中使细菌菌株培养物至少传代一次，所述生长培养基包含一定量的溶菌酶，能有效诱导细菌细胞壁的生长，抵抗原生动物摄食；所述方法还包括从含有溶菌酶的培养基中回收细菌菌株。本发明还公开了由独创的方法产生的通过瘤胃饲料补充剂，以及用所述通过瘤胃饲料补充剂为反刍动物补充饮食的方法，以及评估革兰氏阳性细菌菌株对体内瘤胃灭活的抗性的体外方法。
文档编号A23K1/16GK101072864SQ200580041808
公开日2007年11月14日 申请日期2005年12月6日 优先权日2004年12月6日
发明者莱尔·M·罗得, 詹姆士·C·纽勃得 申请人:赛格生物科学有限公司