专利名称：一种农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，属农业生物技术领域的基础技术，用以改良高羊茅等草坪草植物的品质性状。通过农杆菌介导法，将外源目标基因导入高羊茅愈伤组织，经过愈伤组织分化，获得具有新性状的高羊茅。
背景技术：
种植于公园、高尔夫球场等地的草坪草，对控制土壤风化、美化环境、提供运动、休闲场所具多功能性。随着草坪业在城市园林绿化建设中地位的日趋提高，它正发展成为潜力巨大的产业，在市场经济显示出明显的社会、生态、环境效益。草坪草种仅次于禾谷类杂交种，是目前世界上第二大交易种子，每年零售额达5.8亿美元，而且逐年递增，至2000年整个草坪业的交易将达900亿美元。如一个高尔夫球场、绿化、跑道等建设就需要60000lbs草种，而美国至少有14000个高尔夫球场。我国每年也至少要耗费百万美元的外汇进口草坪草种，仅1999年达3000吨左右。
高羊茅又称苇状羊茅(Festuca arundinacea)，是冷季型禾本科羊茅属草坪草，丛生型，分蘖性强，须根发达，入土深，具广泛适应性。高羊茅又具有较强的耐寒和耐热能力，夏季不休眠，是长江流域唯一能保持四季长绿的草坪草种。它适合种植于富含腐殖质、排水良好的疏松土壤中，在阳处和半阴处都能生长，适于建植大面积的绿化草坪。由于其还具有较高的营养价值，也是世界上重要的禾本科牧草；正是由于高羊茅具有抗干旱、耐脊薄、抗病、适应性广等优点，目前在我国的城市绿化和运动场地的建设中开始被广泛应用。
但高羊茅也存在诸如叶片粗糙、没有匍匐茎，夏季生长缓慢，易遭杂草侵害等缺陷。因此迫切需要克服上述缺点，育成抗杂草的品种。基因工程技术的发展为培育新的、有特殊功能品种提供了新的手段，开辟了植物分子育种新时代。
草坪草中遗传转化最早获得成功的是果园草(Horn，1988)、之后高羊茅(Wang，1992；Ha，1992；Dalton，1995)、红顶草(Asano，1994)、紫羊茅(Spangenberg，1994)、剪股颖(Lee，1996)、相继用原生质体融合法获得成功。原生质体一般都从胚性悬浮系中分离，借助电击和PEG法进行转化经看护培养继代，再生植株；在剪股颖(Zhong，1993；Hartman，1994；，1997)、多年黑麦草(Spangenberg，1995；Maas，1994)、紫羊茅和高羊茅(Spangenberg，1994)等草类中则采用基因枪法作转化；但由于植物原生质体的分离操作复杂、成功率极低；而且导入片段确定性不强、易出现共抑制现象和外源基因表达沉默等缺点，已成为高羊茅遗传改良的制约因素。
农杆菌介导法是目前双子叶植物的遗传转化的首先方法，由于农杆菌不是单子叶植物的天然宿主，对单子叶的高羊茅遗传转化应用很少，目前鲜有高羊茅的农杆菌介导转化法的相关报道。
发明内容本发明既是为了提供一种高效、稳定、简便的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，所述方法是将高羊茅愈伤组织置于含2～5mg/L 2，4-D的培养基中黑暗培养2～3周获得胚性愈伤组织，所得胚性愈伤组织再与含有携带外源基因质粒载体的农杆菌共培养，将质粒载体上的外源基因转移到高羊茅胚性愈伤组织基因组中，经抗性愈伤组织筛选、愈伤组织再生获得所述转基因高羊茅植株。针对高羊茅愈伤组织诱导的特异性，本发明增加了愈伤组织胚性诱导。由于高羊茅种子对2，4-D的敏感性不强，在诱导愈伤的过程中，2，4-D浓度很高，在愈伤诱导出来后，高浓度的2，4-D阻碍了愈伤组织的胚性化，这些非胚性愈伤组织如直接用于农杆菌转化，很难获得成功。因此，采用了降低2，4-D浓度，同时添加细胞分裂素的方法，来增强愈伤的胚性。
所述高羊茅愈伤组织来自敏感基因型高羊茅的成熟胚。
所述敏感基因型高羊茅为下列之一①迪斯绿、②佳美、③猎狗5号、④翠碧A、⑤宾哥。
所述农杆菌为EHA105。
所述高羊茅愈伤组织由高羊茅种子灭菌后于含7～12mg/L 2，4-D的培养基中黑暗室温培养6～8周得到。本发明在对不同品种的高羊茅愈伤组织诱导情况，以及不同的植物激素的配比研究的基础上，采用以MS为基本培养基，添加较高浓度的2，4-D(7～12mg/L)，黑暗室温培养6～8周作为诱导条件。
所述高羊茅种子灭菌步骤如下将高羊茅种子置于质量浓度70～98％的H2SO4溶液中浸泡1～20min，然后种子用无菌水反复冲洗，除去种皮及残余的H2SO4，再用0.1％升汞水溶液浸泡10～20min，倒掉升汞后，用无菌水反复冲洗，除去残余的升汞。在高羊茅种皮间，共生着一种顶孢霉属(Acremonium coenophialum)真菌，诱导时容易污染、出愈时间过长及分化率低等；本发明用一定浓度的H2SO4浸泡，既可以迅速去除种皮(高羊茅种子极小，不易机械或手工去皮)，又可避免培养过程中出现污染问题，并加快诱导速度。
所述的抗性愈伤组织筛选步骤如下将与农杆菌共培养得到的愈伤组织转入含200～500mg/L羧苄青霉素的MS基本培养基，温室培养1～2周后，转入200～500mg/L羧苄青霉素、20～50mg/L潮霉素的MS，室温培养，至生长出淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤组织。
所述愈伤组织再生步骤如下挑取淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤组织至含0.5～2.0mg/L BA、0.5～1.0mg/L NAA的MS基本培养基，光照室温培养至绿苗出现，绿苗转移至土壤中培养，正常生长，得到植株经基因表达检测，得到所述的转基因高羊茅植株。
具体的，所述方法按如下顺序步骤进行(1)高羊茅种子灭菌①将高羊茅种子置于容器中，加入质量浓度70％～98％H2SO4溶液浸泡1～20min，倒掉H2SO4溶液后，用无菌水反复冲洗，除去种皮及残余的H2SO4；步骤①得到的种子中加入0.1％升汞浸泡15min，倒掉升汞后，用无菌水反复冲洗，除去残余的升汞；(2)愈伤组织诱导①诱导培养基配置MS基本培养基中加入7～12mg/L 2，4-D，高温灭菌；②无菌条件下，将步骤(1)所得种子放置于诱导培养基中，黑暗室温培养6～8周；(3)愈伤组织的胚性化诱导①无菌条件下，切下步骤(2)所得愈伤组织，置于胚性诱导培养基1MS基本培养基中加入2～5mg/L 2，4-D、高温灭菌，黑暗培养2～3周；已胚性化的淡黄色愈伤组织，置于胚性诱导培养基2MS基本培养基中加入0.5～1mg/L NAA、0.5～1mg/L BA、高温灭菌，培养2～3天；
(4)农杆菌培养与分级活化①将携带外源基因的质粒载体转化入农杆菌，挑取含目标基因质粒的农杆菌，在YEP或LB固体培养基上划平板，室温培养3～4天；②选取单菌落，在YEP液体培养基上室温振荡培养至对数期；③取培养液加入AB液体培养基中，室温振荡培养至对数期；④取培养液加入含50～200mg/L乙酰丁香酮的AB培养基中，活化农杆菌至对数期；农杆菌首先在YEP培养基复活，进一步通过AB高渗培养基以及乙酰丁香酮的诱导。为了提高转化效果，农杆菌在浸染愈伤组织前，离心将菌体稀释于含乙酰丁香酮MS液体培养基中下，增强农杆菌的活性。
(5)农杆菌转化高羊茅愈伤组织①取活化农杆菌离心，弃上清，加入含50～200mg/L乙酰丁香酮的MS基本液体培养液，摇匀；②将胚性化的高羊茅愈伤组织挑入农杆菌培养液中，浸泡15min；③将被农杆菌浸泡的愈伤组织放置于无菌滤纸上，吸干水分；转入含1～0.5mg/L NAA、1～0.5mg/L BA的MS基本培养基中共培养2～3天④将愈伤组织用无菌水清洗，除去部分农杆菌；随后将愈伤组织转入含羧苄青霉素200～500mg/L的MS液体培养基中，浸泡15min，放置于无菌滤纸上，吸干水分；将愈伤组织转入含羧苄青霉素的MS液体培养基中浸泡，可极大避免筛选过程中农杆菌再次生长。
(6)抗性愈伤组织筛选①步骤(5)所得愈伤组织转入含羧苄青霉素200～500mg/L的MS基本培养基中，室温培养1～2周；②愈伤组织转入含200～500mg/L羧苄青霉素、20～50mg/L潮霉素的MS基本培养基，室温培养，至生长出淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤；本发明在抗性愈伤组织的筛选过程中，采用了分级逐步提高筛选压的方法，让感染农杆菌的愈伤组织首选能正常的生长，随后逐步添加筛选压来筛选已导入外源基因的愈伤组织，避免在筛选初期过高的筛选压抑制抗性愈伤的生长。
(7)愈伤组织再生①挑取淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤转至含0.5～2.0mg/L BA、0.5～1.0mg/LNAA、20～50mg/L潮霉素的MS基本培养基，光照室温培养至绿苗出现；②将绿苗转移至土壤中培养，正常生长；(8)转基因植株鉴定①取转基因植株叶片，提取DNA，对目标基因进行PCR扩增；②对目标基因进行Southern杂交，外源基因已导入的植株即为转基因高羊茅植株。
以宾哥高羊茅品种为例，所述方法按如下顺序步骤进行(1)高羊茅种子灭菌①将宾哥高羊茅种子置于玻璃烧杯，加入质量浓度98％H2SO4溶液浸泡90秒，倒掉H2SO4溶液后，用无菌水冲洗4次，除去种皮及残余的H2SO4；步骤①得到的种子中加入0.1％升汞浸泡15min，倒掉升汞后，用无菌水冲洗4次，除去残余的升汞；(2)愈伤组织诱导①诱导培养基配置MS基本培养基中加入9mg/L 2，4-D，高温灭菌；②无菌条件下，将步骤(1)所得种子放置于诱导培养基中，黑暗室温培养8周；(3)愈伤组织的胚性化诱导
①无菌条件下，切下步骤(2)所得愈伤组织，置于胚性诱导培养基1MS基本培养基中加入2mg/L 2，4-D、高温灭菌，黑暗培养2周；已胚性化的淡黄色愈伤组织，置于胚性诱导培养基2MS基本培养基中加入0.5mg/L NAA、0.5mg/L BA、高温灭菌，培养3天；(4)农杆菌培养与分级活化①将携带外源基因GUS的质粒载体pCAMBIA1301转化入农杆菌，挑取含目标基因质粒的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，室温培养3天；②选取单菌落，在YEP液体培养基上室温振荡培养至对数期；③取培养液加入AB液体培养基中，室温振荡培养至对数期；④取培养液加入含100mg/L乙酰丁香酮的AB培养基中，活化农杆菌至对数期；(5)农杆菌转化高羊茅愈伤组织①取活化农杆菌，3000rpm离心，弃上清，加入含100mg/L乙酰丁香酮的MS基本液体培养液，摇匀；②将胚性化的高羊茅愈伤组织挑入农杆菌培养液中，浸泡15min；③将被农杆菌浸泡的愈伤组织放置于无菌滤纸上，吸干水分；转入含0.5mg/L NAA、0.5mg/L BA的MS基本培养基中共培养3天；④将愈伤组织用无菌水清洗，除去部分农杆菌；随后将愈伤组织转入含羧苄青霉素500mg/L的MS液体培养基中，浸泡15min，放置于无菌滤纸上，吸干水分；(6)抗性愈伤组织筛选①步骤(5)所得愈伤组织转入含羧苄青霉素500mg/L的MS基本培养基中，室温培养2周；②愈伤组织转入，生长1周，再转入含500mg/L羧苄青霉素、50mg/L潮霉素的MS基本培养基，至生长出淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤；(7)愈伤组织再生①挑取淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤转至含2.0mg/L BA、0.5mg/L NAA、50mg/L潮霉素的MS基本培养基，光照室温培养至绿苗出现；②将绿苗转移至土壤中培养，正常生长；(8)转基因植株鉴定①取转基因植株叶片，提取DNA，对目标基因进行PCR扩增；②对目标基因进行Southern杂交，外源基因已导入的植株即为转基因高羊茅植株。
利用以上建立的农杆菌转化高羊茅的方法，我们将外源基因葡聚糖苷酸酶(GUS)、潮霉素(Hyg)基因导入了高羊茅中，并对转基因进行了PCR、Southern blot和组织化学法等检测，转化效率约为8％。
本发明建立的农杆菌介导转化高羊茅的转基因体系，不仅可以将外源基因葡聚糖苷酸酶(GUS)基因导入其中，也可以将其它植物的抗逆基因，还可将动物、微生物甚至人工合成的目的基因转入草坪草中，如导入能降解有机污染物的开苯环酶基因、富集重金属还原酶基因，培育出能够清除土壤中污染物的环保型草坪草种，使草坪不仅可以美化环境而且还具有污染治理的双重功能。
本发明通过对农杆菌介导法的改良，如优化高羊茅愈伤组织的诱导，改善农杆菌的培养方法，来提高农杆菌对其的转化能力，最终获得转基因的高羊茅植株。所述方法高效、稳定、简便，具有重大应用前景。
(四)
图1为pCAM1301转化质粒图谱；图2为高羊茅种子愈伤组织形成及胚性诱导；A高羊茅种子在含2mg/L2，4-D的培养基上诱导出愈；B8周后获得的愈伤组织；C愈伤组织在胚性诱导培养基1上胚性化诱导；D愈伤组织在胚性诱导培养基2上培养；图3为抗性愈伤组织的筛选；乳白色为抗性愈伤组织；图4为转基因愈伤组织分化成苗；A培养基上分化，B绿苗转移至土壤中培养；图5目的基因PCR扩增图；AGUS基因扩增，片段大小为563bp；BHgy基因扩增，片段大小为852bp；图6为Southern杂交图；图7为GUS基因表达图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例11高羊茅种子灭菌(以宾哥高羊茅品种为例)。
1)将3g高羊茅种子放置玻璃烧杯，加入98％H2SO490秒，倒掉H2SO4后，用无菌水冲洗4次，除去种皮及残余的H2SO4。
2)种子中加入0.1％升汞15min，倒掉升汞后，用无菌水冲洗4次，除去残余的升汞。
2愈伤组织诱导。
1)诱导培养基配置MS基本培养基中加入9mg/L 2，4-D，高温灭菌；随后倒入无菌培养皿。
2)在无菌条件下，将种子放置于诱导培养基中，黑暗培养8周，诱导率在67％以上(见图2A)。
3愈伤组织的胚性化诱导。
1)在无菌条件下，切下已诱导的愈伤组织，置于胚性诱导培养基1(MS基本培养基中加入2mg/L 2，4-D，高温灭菌)，黑暗培养2周(见图2C)。
2)挑取淡黄色愈伤组织(已胚性化)，置于胚性诱导培养基2(MS基本培养基中加入0.5mg/L NAA+0.5mg/L BA，高温灭菌)3天(见图2D)。
4农杆菌培养与分级活化。
1)挑取含GUS目标基因的质粒(pCAMBIA1301)的农杆菌(质粒图谱见图1)，在YEP固体培养基上划平板，室温培养。
2)3天后，选取单菌落，在3ml YEP液体培养基上室温振荡培养至对数期(OD＝0.6)。
3)取0.5ml培养液加入50ml AB液体培养基中，室温振荡培养至对数期(OD＝0.6)。
4)取0.5ml培养液加入50ml AB活化液体培养基中(AB培养基+100mg/L乙酰丁香酮)活化农杆菌至对数期(OD＝0.6)。
5农杆菌转化高羊茅愈伤组织。
1)取活化农杆菌，3000rpm离心，弃上清，加入无菌MS活化培养液(MS基本液体培养液+100mg/L乙酰丁香酮)50ml，摇匀。
2)将培养在胚性诱导培养基上的高羊茅愈伤组织挑入该农杆菌培养液中，浸泡15min。
3)将被农杆菌浸泡的愈伤组织放置于无菌滤纸上，吸干。
4)将愈伤组织转入胚性诱导培养基2共培养2～3天。
5)将愈伤组织用无菌水清洗，除去部分农杆菌；随后将愈伤组织转入含500mg/L羧苄青霉素的MS液体培养基中，浸泡15min，放置于无菌滤纸上，吸干。
6抗性愈伤组织筛选。
1)上述愈伤组织转入固体抗性筛选培养基1(MS基本培养基+500mg/L羧苄青霉素)，室温培养1～2周。
2)愈伤组织转入固体抗性筛选培养基2(MS基本培养基+500mg/L羧苄青霉素+30mg/L潮霉素)，生长1周；转入固体抗性筛选培养基2(MS基本培养基+500mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素)，至生长出淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤(见图3)。
7愈伤组织再生。
1)挑取淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤至再生培养基(MS基本培养基+2mg/L BA+0.5mg/L NAA+50mg/L潮霉素)，光照室温培养至绿苗出现(图4A)。
2)将绿苗转移至土壤中培养，正常生长(图4B)。
8转基因植株鉴定。
1)PCR检测；取转基因植株叶片，提取DNA，对目标基因GUS和选择标记基因Hyg进行PCR扩增，扩增引物为GUS5’-GGGATCCATCGCAGCGTAATG-3’，5’-GCCGACAGCAGCAGTTTCATC-3’；Hyg5’-TAGGAGGGCGTGGATATGGC-3’，5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’)；扩增条件为94℃5min；94℃1min，61℃1min，72℃1min 30个循环，72℃5min延伸，扩增长度分别为563bp和852bp。结果如图5所示，转基因植株扩增片段与预期结果完全一致，表明GUS与Hyg基因已经转入高羊茅基因组中。
2)Southern杂交；杂交方法按照分子克隆书上进行，结果见图6。从分子鉴定结果可以证实外源基因GUS已导入高羊茅中。
3)GUS基因表达检测；取植物组织浸泡在0.1mM的X-Gluc溶液中，37℃水浴过夜，然后70％酒精脱色，显微镜观察植物组织细胞已染成蓝色，结果如图7所示，表明GUS基因已表达。
序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110>浙江工业大学<120>一种农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>1gggatccatc gcagcgtaat g21<210>2<211>21<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>2gccgacagca gcagtttcat c21<210>3<211>20<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>3taggagggcg tggatatggc
序列表.ST2520<210>4<211>20<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>4tacacagcca tcggtccaga20
权利要求
1.一种农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述方法是将高羊茅愈伤组织置于含2～5mg/L 2，4-D的培养基中黑暗培养2～3周获得胚性愈伤组织，所得胚性愈伤组织再与含有携带外源基因质粒载体的农杆菌共培养，将质粒载体上的外源基因转移到高羊茅胚性愈伤组织基因组中，经抗性愈伤组织筛选、愈伤组织再生获得所述转基因高羊茅植株。
2.如权利要求1所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述高羊茅愈伤组织来自敏感基因型高羊茅的成熟胚。
3.如权利要求1所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述敏感基因型高羊茅为下列之一①迪斯绿、②佳美、③猎狗5号、④翠碧A、⑤宾哥。
4.如权利要求1所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述农杆菌为EHA105。
5.如权利要求1～4之一所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述高羊茅愈伤组织由高羊茅种子灭菌后于含7～12mg/L 2，4-D的培养基中黑暗室温培养6～8周得到。
6.如权利要求5所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述高羊茅种子灭菌步骤如下将高羊茅种子置于质量浓度70～98％的H2SO4溶液中浸泡1～20min，然后种子用无菌水反复冲洗，除去种皮及残余的H2SO4，再用0.1％升汞水溶液浸泡10～20min，倒掉升汞后，用无菌水反复冲洗，除去残余的升汞。
7.如权利要求1所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述的抗性愈伤组织筛选步骤如下将与农杆菌共培养得到的愈伤组织转入含200～500mg/L羧苄青霉素的MS基本培养基，温室培养1～2周后，转入200～500mg/L羧苄青霉素、20～50mg/L潮霉素的MS，室温培养，至生长出淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤组织。
8.如权利要求1所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述愈伤组织再生步骤如下挑取淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤组织至含0.5～2.0mg/L BA、0.5～1.0mg/L NAA的MS基本培养基，光照室温培养至绿苗出现，绿苗转移至土壤中培养，正常生长，得到植株经基因表达检测，得到所述的转基因高羊茅植株。
9.如权利要求1所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行(1)高羊茅种子灭菌①将高羊茅种子置于容器中，加入质量浓度70％～98％H2SO4溶液浸泡1～20min，倒掉H2SO4溶液后，用无菌水反复冲洗，除去种皮及残余的H2SO4；②步骤①得到的种子中加入0.1％升汞浸泡15min，倒掉升汞后，用无菌水反复冲洗，除去残余的升汞；(2)愈伤组织诱导①诱导培养基配置MS基本培养基中加入7～12mg/L 2，4-D，高温灭菌；②无菌条件下，将步骤(1)所得种子放置于诱导培养基中，黑暗室温培养6～8周；(3)愈伤组织的胚性化诱导①无菌条件下，切下步骤(2)所得愈伤组织，置于胚性诱导培养基1MS基本培养基中加入2～5mg/L 2，4-D、高温灭菌，黑暗培养2～3周；②已胚性化的淡黄色愈伤组织，置于胚性诱导培养基2MS基本培养基中加入0.5～1mg/L NAA、0.5～1mg/L BA、高温灭菌，培养2～3天；(4)农杆菌培养与分级活化①将携带外源基因的质粒载体转化入农杆菌，挑取含目标基因质粒的农杆菌，在YEP或LB固体培养基上划平板，室温培养3～4天；②选取单菌落，在YEP液体培养基上室温振荡培养至对数期；③取培养液加入AB液体培养基中，室温振荡培养至对数期；④取培养液加入含50～200mg/L乙酰丁香酮的AB培养基中，活化农杆菌至对数期；(5)农杆菌转化高羊茅愈伤组织①取活化农杆菌离心，弃上清，加入含50～200mg/L乙酰丁香酮的MS基本液体培养液，摇匀；②将胚性化的高羊茅愈伤组织挑入农杆菌培养液中，浸泡15min；③将被农杆菌浸泡的愈伤组织放置于无菌滤纸上，吸干水分；转入含1～0.5mg/L NAA、1～0.5mg/L BA的MS基本培养基中共培养2～3天④将愈伤组织用无菌水清洗，除去部分农杆菌；随后将愈伤组织转入含羧苄青霉素200～500mg/L的MS液体培养基中，浸泡15min，放置于无菌滤纸上，吸干水分；(6)抗性愈伤组织筛选①步骤(5)所得愈伤组织转入含羧苄青霉素200～500mg/L的MS基本培养基中，室温培养1～2周；②愈伤组织转入含200～500mg/L羧苄青霉素、20～50mg/L潮霉素的MS基本培养基，室温培养，至生长出淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤；(7)愈伤组织再生①挑取淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤转至含0.5～2.0mg/L BA、0.5～1.0mg/L NAA、20～50mg/L潮霉素的MS基本培养基，光照室温培养至绿苗出现；②将绿苗转移至土壤中培养，正常生长；(8)转基因植株鉴定①取转基因植株叶片，提取DNA，对目标基因进行PCR扩增；②对目标基因进行Southern杂交，外源基因已导入的植株即为转基因高羊茅植株。
10.如权利要求1所述的农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行(1)高羊茅种子灭菌①将宾哥高羊茅种子置于玻璃烧杯，加入质量浓度98％H2SO4溶液浸泡90秒，倒掉H2SO4溶液后，用无菌水冲洗4次，除去种皮及残余的H2SO4；③步骤①得到的种子中加入0.1％升汞浸泡15min，倒掉升汞后，用无菌水冲洗4次，除去残余的升汞；(2)愈伤组织诱导①诱导培养基配置MS基本培养基中加入9mg/L 2，4-D，高温灭菌；②无菌条件下，将步骤(1)所得种子放置于诱导培养基中，黑暗室温培养8周；(3)愈伤组织的胚性化诱导①无菌条件下，切下步骤(2)所得愈伤组织，置于胚性诱导培养基1MS基本培养基中加入2mg/L 2，4-D、高温灭菌，黑暗培养2周；③已胚性化的淡黄色愈伤组织，置于胚性诱导培养基2MS基本培养基中加入0.5mg/L NAA、0.5mg/L BA、高温灭菌，培养3天；(4)农杆菌培养与分级活化①将携带外源基因GUS的质粒载体pCAMBIA1301转化入农杆菌，挑取含目标基因质粒的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，室温培养3天；②选取单菌落，在YEP液体培养基上室温振荡培养至对数期；③取培养液加入AB液体培养基中，室温振荡培养至对数期；④取培养液加入含100mg/L乙酰丁香酮的AB培养基中，活化农杆菌至对数期；(5)农杆菌转化高羊茅愈伤组织①取活化农杆菌，3000rpm离心，弃上清，加入含100mg/L乙酰丁香酮的MS基本液体培养液，摇匀；②将胚性化的高羊茅愈伤组织挑入农杆菌培养液中，浸泡15min；③将被农杆菌浸泡的愈伤组织放置于无菌滤纸上，吸干水分；转入含0.5mg/L NAA、0.5mg/L BA的MS基本培养基中共培养3天；④将愈伤组织用无菌水清洗，除去部分农杆菌；随后将愈伤组织转入含羧苄青霉素500mg/L的MS液体培养基中，浸泡15min，放置于无菌滤纸上，吸干水分；(6)抗性愈伤组织筛选①步骤(5)所得愈伤组织转入含羧苄青霉素500mg/L的MS基本培养基中，室温培养2周；②愈伤组织转入，生长1周，再转入含500mg/L羧苄青霉素、50mg/L潮霉素的MS基本培养基，至生长出淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤；(7)愈伤组织再生①挑取淡黄色、没有褐化的新鲜愈伤转至含2.0mg/L BA、0.5mg/LNAA、50mg/L潮霉素的MS基本培养基，光照室温培养至绿苗出现；②将绿苗转移至土壤中培养，正常生长；(8)转基因植株鉴定①取转基因植株叶片，提取DNA，对目标基因进行PCR扩增；②对目标基因进行Southern杂交，外源基因已导入的植株即为转基因高羊茅植株。
全文摘要
本发明提供了一种农杆菌介导获得转基因高羊茅植株的方法，所述方法是将高羊茅愈伤组织置于含2～5mg/L 2，4－D的培养基中黑暗培养2～3周获得胚性愈伤组织，所得胚性愈伤组织再与含有携带外源基因质粒载体的农杆菌共培养，将质粒载体上的外源基因转移到高羊茅胚性愈伤组织基因组中，经抗性愈伤组织筛选、愈伤组织再生获得所述转基因高羊茅植株。本发明通过对农杆菌介导法的改良，如优化高羊茅愈伤组织的诱导，改善农杆菌的培养方法，来提高农杆菌对其的转化能力，最终获得转基因的高羊茅植株。所述方法高效、稳定、简便，具有重大应用前景。
文档编号A01H4/00GK1887063SQ20061005256
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者钱海丰 申请人:浙江工业大学