专利名称：：一种爪哇拟青霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种爪哇拟青霉菌株及其在防治害虫方面的应用。
背景技术：
：在红火蚁、斜纹夜蛾、粉虱和小菜蛾等害虫的防治上，多采用传统的化学防治方法，在生物农药防治方面，目前在国内尚未发现爪哇拟青霉菌株用于防治上述害虫的相关专利申请。爪哇拟青霉菌是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，可以作为防治某些对苏云金杆菌(Bt)产生抗药性的昆虫的替代防治药物。
发明内容本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种爪哇拟青霉菌株。本发明的另一个目的是提供所述爪哇拟青霉菌株的应用。本发明的目的通过下述技术方案来实现提供一种爪哇拟青霉菌株，所述菌株为爪哇拟青霉菌U-N2，菌株保藏号CCTCCNo:M208085，2008年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述爪哇拟青霉菌株属丝孢目、拟青霉属。所述爪哇拟青霉菌株是从广西省弄岗自然保护区被虫生真菌自然侵染的小菜蛾虫体上分离获得，其在査氏培养基上菌落呈层状，中间隆起的一层边缘不整齐，土黄色，菌落背面中央白色，外缘淡黄色，瓶梗基部膨大成柱状或椭圆形，向上突然变细，7.5-12.5X2-2.5um，2-3个轮生于分生孢子梗上；分生孢子柱形或长椭圆形，4-6.7X1—1.5um，呈离散的长链。本发明同时提供了所述爪哇拟青霉菌株在制备防治粉虱、斜纹夜蛾、红火蚁、蚜虫或小菜蛾的药物方面的应用，本发明的爪哇拟青霉菌对防治红火蚁、斜纹夜蛾、蚜虫、粉虱和小菜蛾等多种害虫有效。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果(l)本菌株是从广西省弄岗自然保护区被侵染的小菜蛾虫体上分离获得，为中国本土的菌株，并非从国外引进，能较好地适应国内的自然环境。(2)本发明所述的爪哇拟青霉菌是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新作用机理、对环境无污染、无残留的特征，适应有机食品生产的要求。(3)本发明的爪哇拟青霉菌对防治红火蚁、斜纹夜蛾、蚜虫、粉虱和小菜蛾等多种害虫有效。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一歩详细阐述本发明。下述实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述该菌株的发明思想，实施方式不一一在实施例中追述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明内。实施例1爪哇拟青霉的分离、纯化、鉴定和筛选1.1材料在广西省弄岗自然保护区的蔬菜上采集到一种被虫真菌侵染的小菜蛾Plutellaxyostella虫尸。查氏培养基(Czapek—Dox):N线2g，K2HP041g，KC10.5g，MgS040.5g，FeS040.01g，蔗糖30g，琼脂20g，加入水使总体积为1000ml并煮沸后经高压灭锅12rC灭菌30min。无菌操作条件所有器皿和用具须经高压灭锅灭菌(12rc，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。培养条件置于25t:光照(14L:10D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4"C冰箱贮存。1.2病原菌的分离、鉴定(一)病原菌的分离、纯化与鉴定(1)分离从采回的被虫生真菌感染的小菜蛾虫尸样品上分离病原菌。利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入Czapek平板中，倒置于25。C恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到Czapek斜面，再转入4。C冰箱贮存。(2)复壮将分离到的菌株在Czapek平板上培养7天，待形成菌落后加入0.03%吐温-80的无菌水收集孢子，待孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，搅拌速度参照实验室常规，然后将带有小菜蛾幼虫的叶片浸入1X10'孢子/ml孢子悬浮液中10秒钟，取出晾千后在90%以上的湿度下保湿24小时。10天后挑取被感染的小菜蛾，按(1)所述的方法分离到A分离株。(3)纯化对A分离株在Czapek平板上培养10天，待形成孢子后，挑取分生孢子制成1Xl()3孢子/ml的孢子悬液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入PDA培养基上，放在培养箱中培养，获得B、C、D、E、F、G共6个分离株。(4)病原菌的鉴定根据病原菌的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初歩鉴定。1、菌落形态描述将获得的6个分离株接种到Cz即ek平板上，于25。C条件下培养。23天可见到长出白色的菌丝，菌落呈层状，中间隆起的一层边缘不整齐，土黄色，5天后产生分生孢子。菌落背面中央白色，外缘淡黄色。2、菌丝和孢子形态描述瓶梗基部膨大成柱状或椭圆形，向上突然变细，7.5-12.5x2-2.5罔，23个轮生于分生孢子梗上。分生孢子柱形或长椭圆形，4-6.7x1-1.5拜，呈离散的长链。(二)爪哇拟青霉分离株的筛选虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，又存在有准性生殖现象，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著，菌株不同，其LD50、LT5o可相差数倍至数十倍。高产优质菌株的筛选与获得，是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选常用的4个指标分别为致病力、产孢量、孢子萌发率、菌落生长速率。本发明以这些指标为依据，筛选爪哇拟青霉的优势菌株。(1)供试菌株的处理经纯化获得的爪哇拟青霉B、C、D、E、F、G共6个分离株，在Czapek平板于25士0.5。C的恒温箱(14L:10D)中培养。(2)供试昆虫与寄主植物小菜蛾，将网室中词养在芥蓝上的小菜蛾成虫，接种到无虫的芥蓝幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将芥蓝幼苗置于25士0.5'C的光照培养箱中，待小菜蛾发育至2龄若虫时待用。芥蓝5rasW乙、sca/^M^i'sZ.，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用46片展开叶的盆栽苗。(3)菌落生长速率和产孢量的测定将6个分离株分别配制成lxl()7孢子/ml的分生孢子悬液，分别取lml悬液滴入Czapek培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待12天长出菌丝后用直径为13mm的打孔器取新鲜菌落，接种于Czapek平板上，然后置于培养箱中培养(L:D=14:10)。每个菌株5次重复。第14天测定菌落直径并收集分生孢子用血球计数板记数测定产孢量。具体操作如下用直尺测量菌落直径，并用直径为5mm的灭菌打孔器在培养皿中取菌丝生长均匀的菌块，然后放入加有20ml0.3%吐温-80无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数测定产孢量。6个分离株的菌落生长速率和产孢量见表1，菌落生长速率除B与G、E与F差异不显著外，其余的分离株之间差异显著，其中C分离株的菌落生长速率最大，F分离株的菌落生长速率最小。生长14天后，除分离株D与E、G和B的产孢量差异不显著外，其它分离株之间的产孢量差异显著，其中C分离株的产孢量最高。表1爪哇拟青霉6个分离株的生长速率和产孢量(14d)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(4)孢子萌发率的测定将6个分离株分别培养14天后，用无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加34滴无菌水保湿(100，RH)，培养24h后镜检。每个处理3个重复。6个分离株中，C、G分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著，实验结果见表2。其中C分离株的孢子平均萌发率最高，D分离株的孢子萌发率最低。表2爪哇拟青霉6个分离株的分生孢子萌发率(24h)<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(5)分离株对小菜蛾2龄幼虫的致病力测定将6个分离株培养14天后，用无菌水收集孢子，配制成浓度为1()7分生孢子/mL的孢子悬液。将带有2龄小菜蛾幼虫的芥蓝叶片浸入悬液中，对照浸入无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为34片叶，每叶50100头若虫，3次重复。摘下处理过的叶片，插于盛有无菌水的花泥中，置于透明的保鲜盒内。再置于25士0.5。C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察10天。上述所有试验数据均可以在数据处理软件SAS系统上处理完成。致病力研究结果表明，所有分离株的侵染率与对照相比差异显著。6个分离株在第3天开始表现出侵染症状，从第5天的侵染率可看出C、D、E、G分离株显著高于B、F分离株，第10天时C分离株与其它分离株的侵染率差异显著。从总体而言，分离株C的致病力较强，平均为91.47%(10天)，B分离株的侵染率较低，为73.23%(10天)，实验结果见表3:表3爪哇拟青霉6个分离株对小菜蛾的致病力<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(6)爪哇拟青霉分离株的筛选在筛选优良分离株时，致病性和产孢量是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落生长速率次之。在本发明中从菌落生长速率、产孢量和致病性上看，分离株C较为优良，具有致病性强、产孢量高等特点，结合表1和表3实验结果进行比较。综合比较各方面的因素，C分离株为最佳菌株，将其命名为IJ-N2菌株，经贵州大学刘爱英教授鉴定为爪哇拟青霉Zsar/"j'avam'，(Friendrichs&Bally)，其菌株保藏号CCTCCNo:M207088，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述爪哇拟青霉ZsanVzj'awm/ci^(Friendrichs&Bally)菌株IJ-N2，属丝孢目，拟青霉属。在查氏培养基上菌落呈层状，中间隆起的一层边缘不整齐，土黄色，菌落背面中央白色，外缘淡黄色，瓶梗基部膨大成柱状或椭圆形，向上突然变细，7.5-12.5X2-2.5um，2-3个轮生于分生孢子梗上。分生孢子柱形或长椭圆形，4-6.7X1-1.5ym，呈离散的长链。上述所有试验数据均可在数据处理软件SAS系统上处理完成。实施例2爪哇拟青霉IJ-N2菌株对红火蚁的致病力测定生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本发明就爪哇拟青霉IJ-N2菌株对红火蚁的致病力进行测定，以筛选出在防治时所用的最佳浓度。供试昆虫红火蚁，自广州大学城草坪，采集后在室内饲养一段时间，待种群稳定后挑选出大小一致的健康大型工蚁用于试验。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的爪哇拟青霉IJ-N2菌株，采用Czapek平板，于25土0.5。C的恒温箱(14L:10D)中培养14天，加入0.3%吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成5X105、1X106、5X106、1X107、5Xl()7孢子/ml5个浓度梯度待用。(2)分离株对红火蚁的致病力测定将红火蚁大型工蚁浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入含0.03%吐温-80的无菌水中，20秒钟后取出，自然晾干。每处理为30头虫，3次重复。处理过的红火蚁大型工蚁放置于25士0.5"C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察14天。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。(3)爪哇拟青霉菌株对红火蚁大型工蚁的累计死亡率接种后的第45天，各处理区的红火蚁大型工蚁开始表现出发病症状，如可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现孢子，随后红火蚁大型工蚁死亡。表4为爪哇拟青霉处理后红火蚁大型工蚁第7天、14天的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加红火蚁大型工蚁的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，烟粉虱2龄的死亡率也增加。其中1X106和1X1()7处理区，红火蚁大型工蚁的累计死亡率差异不显著。表4爪哇拟青霉菌株对红火蚁大型工蚁的累计死亡率<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。实施例3爪哇拟青霉IJ-N2菌株对斜纹夜蛾幼虫的致病力测定供试昆虫与寄主植物斜纹夜蛾，将网室中饲养在芥蓝上的斜纹夜蛾成虫，接种到无虫的芥蓝幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将芥蓝幼苗置于25土0.5。C的光照培养箱中，待斜纹夜蛾发育至2龄幼虫时待用。芥蓝石m^caow2/7e^^L.，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用810片展开叶的盆栽苗。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的爪哇拟青霉IJ-N2菌株，在Czapek平板上于25士0.5。C的恒温箱(14L:10D)中培养10天，加入0.03%吐温一80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成lxl05、5xl05、lxl06、5xl06、lxl07孢子/ml5个浓度梯度待用。(2)分离株对斜纹夜蛾幼虫的致病力测定将带有斜纹夜蛾2龄幼虫的芥蓝叶片浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为34片叶，每叶10头若虫，3次重复。处理过的叶片放入灭菌的25cmX35cm托盘中，并放置于25士0.5。C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，并更换新鲜的芥蓝叶片，连续观察10天。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。(3)爪哇拟青霉菌株对斜纹夜蛾2龄的累计死亡率接种后的第23天，各处理区的幼虫开始表现出发病症状，如虫体行动迟缓、食欲不振，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现孢子，随后斜纹夜蛾死亡。表5为爪哇拟青霉处理2龄幼虫后第5天、10天的累计死亡率结果，表明随着浓度的增加，斜纹夜蛾2龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，斜纹夜蛾2龄的死亡率也增加。其中1X106和1X107处理区，斜纹夜蛾的累计死亡率差异不显著。表5爪哇拟青霉对斜纹夜蛾2龄幼虫的累计死亡率浓度5d10dlxl050.12±0.43c0.26土1.33c5xl050.16±0.85bc0.31土1.05clxl060.24±1.21b0.56士l,24b5xl060.35±1.23ab0.76±1.81ab1xl070.41±2.01a0.88±2.01aCK0.05±0.42c0.08±0.85d注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。权利要求1、一种爪哇拟青霉菌株，其特征在于所述菌株为爪哇拟青霉菌IJ-N2，菌株保藏号CCTCCNoM208085，2008年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏。2、根据权利要求1所述爪哇拟青霉菌株，其特征在于所述爪哇拟青霉菌株属丝孢目、拟青霉属。3、根据权利要求1所述爪哇拟青霉菌株，其特征在于所述爪哇拟青霉菌株在査氏培养基上菌落呈层状，中间隆起的一层边缘不整齐，土黄色，菌落背面中央白色，外缘淡黄色，瓶梗基部膨大成柱状或椭圆形，向上突然变细，7.5-12.5x2-2.5)mum，2-3个轮生于分生孢子梗上；分生孢子柱形或长椭圆形，4-6.7xl-1.5mum，呈离散的长链。4、一种权利要求1所述爪哇拟青霉菌株的应用，其特征在于应用于制备防治粉虱、斜纹夜蛾、红火蚁、蚜虫或小菜蛾的药物中。全文摘要本发明公开了一种爪哇拟青霉菌株及其应用，所述菌株为爪哇拟青霉菌IJ-N2，菌株保藏号CCTCCNoM208085，2008年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述菌株是从广西省弄岗自然保护区被虫生真菌自然侵染的小菜蛾虫体上分离获得的野生菌株，将野生菌株回接于小菜蛾虫体上复壮获得爪哇拟青霉菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株，经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，爪哇拟青霉对粉虱、红火蚁、斜纹夜蛾、蚜虫、小菜蛾等害虫具有很强的侵染杀虫效果。文档编号A01N63/04GK101343614SQ200810029158公开日2009年1月14日申请日期2008年7月1日优先权日2008年7月1日发明者任顺祥,振黄申请人:华南农业大学