一种特异抑制肿瘤细胞和肿瘤新生血管的多肽ERC(N⁵)的制作方法

专利名称：一种特异抑制肿瘤细胞和肿瘤新生血管的多肽ERC(N⁵)的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质多肽领域，具体地讲，涉及一种能够同时识别肿瘤细胞和 肿瘤新生血管的多肽及其制备和用途。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病。据WH0 2001年统计，全 球存活的癌症患者约有8000余万人，每年新增癌症患者约1030万人，死于癌症 人口有600余万，居所有疾病死亡率的第二位。在巴黎举行的世界抗癌大会预测， 到2020年，全世界每年新增癌症患者将达到2000万人，死于癌症的人数将超过 1200万，并主要分布在发展中国家。恶性肿瘤的危害主要在于其无限的增值能力 和强大的迁移能力。尽管医学科学的发展使临床治疗肿瘤的能力有了很大的提 高，但肿瘤转移仍然是肿瘤临床治疗所面临的最严峻挑战。肿瘤的转移和肿瘤增值与毛细血管新生及多种黏附因子的作用有关。肿瘤在 生长过程中，首先建立起自身血管网络。由于肿瘤生成的基底膜和血管内皮均有 缺陷，肿瘤细胞极易穿越其基底膜屏障进入血液循环，进而向远端转移和扩散。 肿瘤细胞进入循环系统后，与白细胞或血小板形成癌栓，在远端血流缓慢的毛细 血管网处，癌栓粘附微血管内皮并诱导内皮细胞裂解。癌细胞穿出微血管后，与 基底膜接触并通过特殊膜受体结合基质蛋白，完成在远端组织的转移。转移的癌 灶进一步诱导新生血管以满足其过度的增长需要，并在一定的情况下再度发生转 移。从肿瘤转移过程可以看出，建立自身血管网络和诱导新生血管生成，是肿瘤 增值和转移的必备条件。抑制肿瘤新生血管的生成，阻断肿瘤细胞的营养供应， 即可达到抑制或阻断肿瘤增值与转移的目的，对于肿瘤的防治具有重要的意义。近年来，血管生成抑制剂已成为抗癌研究的热点之一，几乎年年召开相关的 国际性学术研讨会。血管新生抑制疗法有望成为继化学疗法、放射治疗及外科手 术以外，最具前瞻性的新一类疗法。早在1971年，美国哈佛大学医学院Dr. Folkman首先提出一种理论，解释抑制新血管生成，可以成为治愈肿瘤的新疗法。他认为，血管新生对肿瘤的生长非常重要。当肿瘤只有2 3mm大小时，它可依 靠渗透作用自外界取得养份。然而一旦超过这一大小，就需借助新生血管来获取 养份。经过三十多年的研究，迄今已有报道的血管新生抑制剂就有近三十种。虽然 还没有抗肿瘤血管生成药物正式应用于临床，但已有一些制剂正在进行基础及临 床试验，并已取得令人振奋的结果。研究较多的有Angiostatin、 Endostatin、 Echistatm等。Folkman等人在不同的老鼠身上分别接种三种老鼠的肿瘤细胞(肺 癌、纤维肉瘤、网状细胞肉瘤)，以及三种人类的肿瘤细胞(胰腺癌、大肠癌、乳 癌)。将Angiostatin注入这些老鼠体内，可使不同的肿瘤縮小均在95%以上。这些令人振奋的实验结果，为人类展现了不久的将来攻克癌症的曙光。抑制 肿瘤血管新生，以其疗效显著、无副作用、不产生肿瘤耐药等优点，有望成为部 分取代或协同治疗肿瘤的最新手段。然而，血管新生抑制疗法在动物实验中尽管显示了极大的优越性，但是多年 的研究发现，有些因素限制了血管新生抑制剂的推广和应用，如以Angiostatin为 例，它是目前被认为最强的血管生成抑制因子，具有高效抑制肿瘤新生血管形成、 超大剂量在人体中无毒副作用以及反复使用不出现耐药性等优点。但是，治疗所 需剂量很大且需每天进行，对于患者来讲，高额费用不堪重负，制约了漫长期限 的临床应用。其次是，血管新生抑制疗法属于恶性肿瘤综合治疗的一部分，并不 能完全替代其它疗法。血管生成抑制剂是通过抑制肿瘤血管生成，扼制肿瘤的生 长、转移，通常只能使肿瘤细胞处于蛰伏状态，并不直接杀死肿瘤细胞。单独应 用这种方法难以治愈肿瘤，对于原发肿瘤，还需结合手术、放疗、化疗等手段进 行综合治疗。基于现有血管新生抑制剂的局限性，科学家们仍在继续研究新的血管生成抑 制剂，不断探索疗效确切、成本低廉的血管新生抑制疗法。新近的研究报告指出，整合素(Integrin)家族成员之一的 &，在血管新生 过程中扮演着非常重要的角色。％/33在正常机体的血管中检测不到，但是内皮细 胞受到血管新生促进因子刺激活化时，则会大量表现出来，并且引发血管新生的 信息传递与内皮细胞的激活；与此同时，a^3在许多肿瘤细胞如结肠癌细胞、骨 肉瘤细胞、黑色素瘤细胞等表面也有表达，并且发现，在这些肿瘤细胞表面，还达。这些整合素可以被去整合素(Disintegrin)特异的超二级 结构RGD (Arg-Gly-Asp)模体识别并结合，使得 /33、 a5^的功能被抑制。研究 证明，去整合素作用于C^53，可以抑制肿瘤细胞或生长因子所引发的血管新生作 用，同时可以导致增生血管细胞的程序性凋亡(apoptosis);去整合素还可以通 过抑制肿瘤细胞表面avft、 a5^受体，抑制肿瘤细胞增值，引起肿瘤细胞凋亡。 这一结论为血管新生抑制剂的研究提供了新的思路。去整合素可以视为一种具有 双重功能的效应分子，它不仅能够抑制肿瘤血管新生，而且可以抑制和杀灭肿瘤 细胞。这就可以解决以往单独运用血管新生抑制剂不能杀死肿瘤细胞的难题。目 前国内外许多科研机构在致力于去整合素抑制肿瘤的研究。本实验室自上个世纪 卯年代即开始研究去整合素Echistatin，并建立了去整合素多肽的克隆、表达及制 备工艺。Echistatin由49个氨基酸组成，其中RGD (Arg、Gly^-Asp26)为其特异 性结合位点。生物学研究结果证明Echistatin除了可以抑制血小板聚集外，还 能呈剂量依赖性抑制鼠黑色素瘤细胞B16 BK6与纤维连接素、玻璃连接素、层 粘蛋白的粘附，并诱导新生血管内皮细胞DNA的断裂；Echistatin还能抑制结肠 腺癌细胞与纤维连接蛋白和几种抗癌细胞整合素单抗的结合。当然，进一步的研 究也发现，去整合素治疗肿瘤还存在一些问题，例如，整合素虽然分子量小，但 由于大多来自蛇毒，其免疫原性不容忽视。为了降低其免疫原性，国内外曾有一 些科学家通过化学方法合成RGD三肽，希望替代去整合素，但是RGD三肽的活 性下降了近百倍。进一步的研究提示，去整合素RGD周边序列对于维持其功能 具有重要作用；再如，由于去整合素可以识别多种不同的整合素，因此，其介导 的生物效应，作用广泛但不特异。由于不同去整合素对av&、 a5^等整合素的选 择性不同，通过改变去整合素RGD模体周边序列，可以影响其选择性。这一发 现为研究去整合素提供了新的思路。近年来，本实验室将研究重点放在去整合素 结构与功能的关系上，通过突变EchistatinRGD模体周边部分氨基酸，得到两种 不同的突变体Echistatin (A23K24G25D26W27)和Echistatin (A23R24G25D26N27)。 第一种突变体由于K^和W"的作用，特异地结合aub(33，而第二种突变体Echistatin (A23R24G25D26N27)则特异地结合％/33、 本实验室同时建立了这两种突变 体的基因工程生产工艺，并进行了药效学研究，基本确证了去整合素Echistatin 作用的特异性问题。本发明在Echistatin (A23R24G25D26N27)突变体基础上进行改造获得的ERC (N5)多肽，具有特异性抑制肿瘤细胞和肿瘤新生血管的作用， 迄今尚未见有相关报道。本发明的目的，在于提供一种能够同时特异性识别和抑制肿瘤细胞及肿瘤新 生血管的多肽，从而克服现有血管生成抑制剂存在副作用大、特异性不强等问题， 以期在临床治疗中发挥高效、特异的肿瘤抑制和杀灭作用。

发明内容
本发明提供了一种全新的小分子多肽，它由RGD (Arg-Gly-Asp)和部分 Echistatin的C端序列组成。根据Echistatin (A23R24G25D26N27)特异结合0^3、 0!5A 的特点，本发明将EchistatinN端l一22个氨基酸截断并对其27位氨基酸实施了突 变，其突变后蛋白质一级结构为ARGD7VMPRNPHKGPAT(粗体、斜体表示突变 后氨基酸序列)，经过计算机模拟，该小分子多肽具有一定柔软空间构象，RGD 模体和C端序列之间的距离接近于Echistatin结构中的RGD与C端的距离，理论上 具备Echistatin相似的生物学活性。改造后的多肽由RGD和Echistatin的部分C端结合，其第五个氨基酸为N，使 之更易于与 ft、 asA结合。本发明将该多肽命名为ERC(N5)。 ERC(N勺既保留 了Echistatin (A23R24G25D267V27)特异性识别ovft、 asA的优点，又以较小的分子 量降低了免疫原性，同时可以通过基因工程技术进行制备，既可降低成本，又能 解决现有血管生成抑制剂存在的缺陷。本发明的要点之一在于，提供一种新的小分子多肽设计与合成，其氨基酸序 列特征为ARGDiVMPRNPHKGPAT，其名称为ERC(N5)。本发明的要点之二在于，ERC(N5)的基因序列特征为get cgt ggt gac aac atg ccg cgt aac ccg cac aaa ggt ccg get act。本发明还提供了多肽ERC (N5)在恶性肿瘤增值和转移的临床治疗中的应用。发明优点本发明的优点与积极效果在于，利用基因工程与蛋白质工程技术，设计并制 备了一种小分子多肽，所述多肽不仅具有其它血管生成抑制剂的抑制肿瘤功效， 还具有杀灭肿瘤细胞的特异作用，有望成为一种新型血管生成抑制剂，为临床提供一种新的抗肿瘤药物和治疗方法。


图1一目的基因1%琼脂糖凝胶电泳结果
其中从左向右，第一泳道为DNAmarker,最下面条带分子量为100bp; 第二泳道为目的基因，其分子量小于100bp; 图2 —重组表达质粒载体？丁乂81- ERC(N5)的酶切鉴定
其中从左向右，第一泳道为低分子量DNAmarker，最下面条带分子量为 100bp;
第二泳道为pTXBl- ERC(NS)经酶切后的两个片段，最下面其分子量 小于100bp; 图3 —ERC(N5)-融合蛋白SDS-PAGE电泳图
其中第一泳道为蛋白marker,其分子量从大到小为97400， 66200， 43000， 31000， 20100， 14400;第二泳道为ERC(N5)-融合蛋白表达情况，在 43000和31000之间可见到融合蛋白条带存在。 图4一氨基酸序列为ARGDNMPRN肽段的MS/MS质谱图
其中纵坐标表示相对丰度，横坐标为质荷比，横坐标下面为相对应的氨基 酸序列。坐标轴之间的数字为相应的离子和质荷比。 图5—ERC (N5)抑制CAM新生血管示意图
其中包括对照组、O.l昭组，0,8吗组，1.6pg组 图6—ERC (N5)对肿瘤细胞抑制的剂量依赖性
其中横坐标表示蛋白质浓度(mg/ml)，纵坐标表示生长抑制率(％)
曲线代表人宫颈癌细胞株Siha; T-曲线代表人结肠癌细胞株SW4S0; ▲-曲线代表人结肠癌细胞株Colo205; *-曲线代表褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC-12，
-曲线代表非洲绿猴肾细胞株COS-7
图7—Hoechst 33258染色
其中7-1:未经处理的对照细胞；7-2: ERC (N5)处理8h; 7-3: ERC (N5) 处理16h; 7-4: ERC (N5)处理24h。实施方案
以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限 制本发明。
<实施例1>:利用基因工程与蛋白质分析技术相结合制备ERC(N5) (1)、 ERC(N5)多肽基因的获取
根据ERC(N^的氨基酸序列，利用大肠杆菌偏爱密码子，设计ERC(N"的全 基因序列，基因上游引入AWeI酶切位点和起始密码ATG，下游引入&户I酶切位 点，基因序列由TaKaRa公司合成，其特征为
ggt get cat atg get cgt欲f gflc ctflc啤ccg c ccg c"c flfl"欲Z ccg gc, gga aga gca aca
全基因序列经1%琼脂糖凝胶电泳，低于DNA Marker的100bp，有一目的条 带，符合预期大小(72bp，包括酶切位点)(图l)。 (2) ERC(N5)融合蛋白表达体系的构建
将合成所得目的基因片段首先亚克隆入pMD-18T克隆载体(购自TaKaRa公
司)，形成pMD-18T-ERC(NS)重组质粒，将其转化XL-lblue大肠杆菌(购自北
京北医联合生物工程公司)，经质粒提取、PCR、酶切鉴定，选取电泳鉴定正确
重组质粒进行DNA测序，将准确无误的重组子用AWe I和&p I限制性内切酶消化，
回收目的片段后，定向克隆于融合表达载体pTXBl (含有编码Intein蛋白基因序
列)(购自NEB公司)中，pTXBl属于IMPACT系统载体，具有自我剪切功能，
非常适用于表达小分子多肽。将重组质粒转化B121(DE3)大肠杆菌(购自博士德
公司)，构建B121(DE3)-pTXBl-ERC(N5)融合蛋白表达体系(图2)。
鉴定结果如图2所示，
显示100bp以下，有一 目的条带存在，符合预期大小，证明pTXBl- ERC(N5) 重组质粒构建成功。
(3) ERC(N5)融合蛋白表达及纯化 利用IPTG诱导宿主菌表达融合蛋白ERC(NS)-Intein，取少许样品行 SDS-PAGE电泳。收集菌液经超声破菌，确定融合蛋白的表达形式，然后利用 IMPACT系统的自我剪切特性对融合蛋白进行切割，使ERC(NS)-Intein融合蛋白 裂解并释放ARGDiV MPRNPHKGPAT(4) ERC(N5)结构确证
对精细纯化后目的蛋白进行LC-ESI-MS/MS质谱分析，鉴定目的蛋白一级结 构的正确性。MS/MS质谱图(二级质谱图)提示，ERC (N5) —级结构正确(图 4)。
<实施例2>: ERC(NS)抑制新生血管生成实验
(1) 材料
鸡胚110只(购自山西医科大学动物中心)，共分为11组，包括PBS阴性 对照组、ERC(N5)0.1pg组，0.2pg组，0.4pg组，0.8pg组、1.6pg组；ERC(N5) O,lpg 组，0.2吗组，0.4pg组,0.8吗组、l如g组;
(2) 方法 孵育
用1%的新洁尔灭清洗新鲜鸡蛋，将其放入37。C， 60%相对湿度的孵箱内常 规孵育，使鸡蛋的气室向上，鸡蛋长轴与蛋托呈80°角，每天翻蛋2 3次，至 第8天，选择成活的鸡胚进行标记，在尿囊膜两条主要血管交叉点离胚体一定距 离处确定开窗位置； 开窗
先在气室顶端开一个小孔减压，然后在选定位置消毒后开一个约 0.5cmx0.5cm的小窗，小心掀起壳膜，暴露其下方的尿囊膜及其血管； 施加测试物
分别置入已经加入对照dH20及受试样品的甲基纤维素膜，使其置于测试 区，用透明胶带纸封闭小窗，继续孵育48h，每组至少保证成活6只鸡胚； 取膜及拍照
去掉鸡胚绒毛尿囊膜(chrioall antoic membrane,縮写为CAM)平面以上 的卵壳膜，加入l:l的甲醇/丙酮固定液1.5ml/只，室温固定15min，待血液凝固 后剪下CAM，浸入水中使其展开。将CAM平铺于玻璃板上，继用另一玻璃板 压平，在解剖显微镜下观察。
(3) 结果
对照组血管普遍生长良好，血管分支适中；O.lpg ERC(NS)组血管数出现减 少，甚至个别小血管消失的现象；随着ERC(N"剂量的增加，小血管网出现不同 程度的缺陷，甚至有大量小血管的消失，局部区域仅有较大血管存在；在1.6pg 组，所有小血管全部消失，仅有大血管尚存且有出血现象；说明ERC(NS)有剂量依赖性的抑制血管新生作用。
<实施例3>:诱导肿瘤细胞侵袭和转移实验
(1) 材料 哺乳动物细胞株
人结肠癌细胞株ColQ205、 SW480，人宫颈癌细胞株Siha及褐家鼠肾上腺嗜 铬细胞瘤细胞株PC-12，非洲绿猴肾细胞株COS-7 (购自中国科学院细胞库)。 Colo205， SW480， Siha， COS-7细胞株用含10。/。胎牛血清的RPMI1640 (购自博士 德公司)培养液培养，PC12在含10。/。胎牛血清，5。/。马血清的RPMI1640 (购自博 士德公司)培养液中培养。
(2) 方法
将Siha细胞株经ERC (N5)作用24h后，收集存活细胞用无血清培养基重悬以 10"孔的密度接种于Boyden小室(Costar)，在侵袭实验中，需在8ptm孔径的聚 碳酸酯滤膜上加入10/il基质胶(25mg/50ml)，并在小室的底部加入含血清培养 基，然后在37'C细胞培养箱中继续培养24h。取出滤膜空气干燥5h，将滤膜的 细胞经甲醛固定后用吉姆萨染色，在光镜下计数侵袭和转移细胞的数目。
(3) 结果
ERC (N5)体外抗肿瘤作用
本实验为一定测试条件下(8h,37'C)，不同剂量ERC (N5)的测试结果。相 比受试的人癌细胞(Siha,SW480和Colo205)及褐家鼠癌细胞株(PC12)，非洲 绿猴肾细胞株COS-7对ERC (N5)杀伤活性的敏感程度要小得多，而且不同受 试癌细胞对ERC (N5)的敏感程度也不同，达到50%生长抑制率所需的作用浓 度范围约为0.2 1.25mg/ml。其中，PC12细胞对ERC (N5)的活性成分较敏感， 其明显受到ERC (N5)抗肿瘤活性成分的抑制，当浓度提高至0.5mg/ml时，显 微镜下可看到大量破裂溶解的细胞。 细胞凋亡检测结果
Hoechst 33258染色
用Hoechst33258染色可明显观察到细胞核形态的改变(图7)。在空白对照 组，细胞核形态呈圆形，淡蓝色，着色均匀(图7-l);经0.5mg/mlERC (N5) 处理8h.l6h和24h后，细胞核明显亮染，在许多细胞可见染色质浓縮聚集，有的细胞可观察到凋亡小体的形成，呈现典型的凋亡形态学改变。(图7-2，图7-3， 图7-4)。
Siha细胞株经ERC(N5) (0.5mg/ml)处理8h， 16h， 24h后，经Hoechst 33258
染色后，在荧光显微镜下观察细胞核形态的改变。
权利要求
1. 一种小分子多肽ERC(N5)，其蛋白质一级结构为ARGDNMPRNPHKGPAT，基因序列为gct cgt ggt gac aac atg ccg cgt aac ccg cac aaa ggt ccg gct act。
2、 制备权利要求1所述多肽ERC (N5)的方法，其主要步骤包括a、 目的基因的获取根据ERC(NS)的氨基酸序列，利用大肠杆菌偏爱密码 子，设计ERC(N"的全基因序列，在基因上、下游引入恰当的酶切位点合成得到；b、 融合蛋白表达体系的构建将目的基因片段克隆、转化大肠杆菌，经质粒提取、PCR、酶切鉴定，选取正确重组质粒进行DNA测序，将序列准确无误的 重组子经限制性内切酶消化，回收目的片段后，克隆于融合表达载体；c、 融合蛋白的表达含重组表达载体的宿主菌，在适当条件下表达融合蛋 白，进行SDS-PAGE电泳检测；d、 融合蛋白的精细与纯化采用高压液相HPLC方法，对ERC(N"进行精细 纯化，得到ERC(N"纯品；e、 融合蛋白的结构确证对精细纯化后的蛋白ERC(NS)进行LC-ESI-MS/MS 质谱分析，确证其一级结构。
3、 权利要求1所述多肽ERC (N5)在制备治疗恶性肿瘤增值及转移药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种特异抑制肿瘤细胞和肿瘤新生血管的多肽ERC(N⁵)，具体地讲，涉及运用基因工程与蛋白质工程技术设计、制备的一种小分子多肽ERC(N⁵)，实验研究结果表明，所述多肽不仅具有其它血管生成抑制剂抑制肿瘤的功效，还具有杀灭肿瘤细胞的特异作用，有望成为一种新型血管生成抑制剂，为临床提供一种新的抗肿瘤药物和治疗方法。
文档编号C12N15/11GK101280004SQ200810100199
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者利 张, 栋 张, 张建林, 方 李, 涛 杨, 杨利军, 勃 牛, 索利敏, 赵志强, 俊 闫 申请人:山西医科大学