专利名称：活性生物抗菌物及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜 和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的生物制剂一活性生物抗菌物及其生产方法，属 于生物制品及其制造领域。
背景技术：
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药 物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的 “超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环 境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了 人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍 受重视。60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和 “溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有 选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞 裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用，这一 独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌 的生长温度为20-30°C，最适生长温度为26. 3°C，35°C以上就不能生长繁殖，且只能在活菌 上生长。而人体内的正常温度一般为37°C左右，动物体内的正常温度一般为40°C左右。除 蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的 生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害； 尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质 保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解(杀灭)细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主 菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某 些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到 宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌 细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止 新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌，但噬菌体对相 应的宿主菌高度特异。蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特 异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、 体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种以蛭弧菌和噬菌体的混合培养物为主要成分，用于 防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、 抑制蓝藻生长的生物制剂——活性生物抗菌物及其生产方法。实现本发明目的的技术解决方案是一种活性生物抗菌物，是以蛭弧菌和噬菌体 的培养物为主要成份按比例混合制成，其特征在于，蛭弧菌和噬菌体的混合培养物通过以 下方法制备(1)蛭弧菌培养物的获得先制得失活的蛭弧菌宿主菌，然后以此失活宿主菌为 宿主，用蛭弧菌常规培养法制取蛭弧菌培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型 的、能裂解有害细菌的、不破坏有益细菌的、在10_43°C环境中能生长的蛭弧菌菌株，然后将 上述过程中制得的失活宿主菌和选育出的蛭弧菌悬浮在稀释液中，校正其PH值3. 8-10. 0， 在10-43°C环境中发酵培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用。(2)噬菌体培养物的获得制取敏感的噬菌体宿主菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取噬菌体培养物，再 选择于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑典型的能裂解有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好 的单噬斑浸泡于营养肉汤中，然后，取上清再制营养肉汤双层琼脂平板，最后将上述过程中 制得的噬菌体培养物和敏感的宿主菌悬液悬浮在营养肉汤中，校正其PH值3. 8-10.0，在 10-43°C环境中发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的宿主菌，经检验确定无菌的 发酵培养物或将发酵培养物冻干备用。(3)将上述蛭弧菌发酵培养物或将发酵培养物过滤浓缩冻干粉和经检验确定无菌 的噬菌体发酵培养物或将发酵培养物冻干粉按1 1-1 1000000的比例配制，即蛭弧菌 的含量为lO-liTpfu/ml，噬菌体的含量为10-1016pfu/ml ；混合配制，使其悬浮在媒介液或 混合在赋形剂中；即得到产品。上述步骤(1)具体可以是用常规方法制取宿主菌悬液；然后加热，或用氯仿(三 氯甲烷)处理，制得失活宿主菌悬液；然后以此失活宿主菌悬液为宿主，用蛭弧菌常规培养 法制取其培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型的、能裂解相应有害细菌的、不 破坏有益细菌的蛭弧菌菌株，然后，再制双层琼脂平板，调高温度培养，选育出在10-43°C环 境中能生长的蛭弧菌菌株，最后将上述过程中制得的失活宿主菌悬液和选育出的蛭弧菌按 10 1-105 1的比例悬浮在稀释液中，校正其PH值为3.8-10.0，在30-431环境中发酵 培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用。上述步骤(2)具体操作是用常规方法制取敏感的(相对应的有害细菌)宿主 菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取其培养物，再选择于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑 典型的、能裂解相应有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好的单噬斑浸泡于营养肉汤中， 然后，将上述过程中制得的噬菌体培养物和敏感的(相对应的有害细菌)宿主菌悬液按 1 10-1 IO5的比例悬浮在营养肉汤液中，校正其PH值为3. 8-10.0，在10-43°c环境中 发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的(相对应的有害细菌)宿主菌。经检验确 定无菌的发酵培养物或将发酵培养物冻干备用。用本产品防治人、动物体细菌病时，以口服产品给药为主要途径，也可辅以其他给 药途经；用于水生动物细菌病防治时，产品直接泼洒到养殖环境水体中的方式，也可辅以口服；用本产品防治植物细菌病时，可以根部包埋，或叶面喷洒；果、蔬、花卉、食品、水产品保 质保鲜以叶面喷洒为主要给药途径，也可浸泡；用本产品清除环境中有害细菌和蓝藻类时， 可以直接泼洒到环境水体中。本发明所提供的活性生物抗菌物经中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体研究 室测试，对人体致病菌伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、绿脓杆 菌、金黄色葡萄球菌等人体有害细菌的裂解率在75-95. 38%以上。南京农业大学、山东 农业大学测试，对动物致病菌猪大肠杆菌、鸡白痢杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、耶尔森氏菌、 链球菌、假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌，溶藻弧菌、伤口弧菌、鳗弧菌、肠型点状 气单胞菌、柱状屈挠杆菌、荧光假单胞菌、和植物致病菌水稻白叶枯病菌、白菜软腐病菌、 生姜青枯病菌等动、植物有害细菌的裂解率在92. 43%以上。南京农业大学、天津农业大 学、江西农业大学、江苏省畜牧局测试，产品用于防治仔猪肠道细菌病的结果显示，预防保 护率为87. 46-99. 33%，降低死亡率99%以上。江苏省农产品质量检验检测中心、南京市 科技局农业处、山东省莱芜市农业局科技处测试结果显示，活性生物抗菌物用于黑莓等果 蔬食品保质保鲜时，可延长保质保鲜期3-7天；用于辣椒、生姜青枯病的防治，保护率为 79. 86-94. 12%，对植物常见的致病菌，如柄锈菌、假单胞菌、水稻白叶枯病菌、胡萝卜软腐 病欧文氏菌、柑桔溃疡病黄单胞菌、白菜软腐病菌等的裂解率为93. 76%。本发明公开的生产活性生物抗菌物的方法，避免了在活菌上培养蛭弧菌所造成的 环境污染，而且培养周期短、产量高；特别是使得蛭弧菌、噬菌体对细菌病防治人体、动物、 植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长等 成为现实。
具体实施例方式本发明中能杀灭有害细菌(是指本领域技术人员所理解的含义)，如沙门氏菌属、 弧菌属、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌属、耶尔森氏菌属、绿脓假单胞菌属、葡萄球菌属、链球 菌属中的大部分致病菌；保护有益细菌(是指本领域技术人员所理解的含义或国家食品药 品监督管理部门明文批准的)，如干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、乳酸片球菌、枯草芽 孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母、藻泽红假单胞菌、 蜡样芽胞杆菌、脆弱拟杆菌等。下述实施例中具体实验筛选得出的菌株，只为说明本发明的 方法，不构成对本发明保护范围的限定。本发明中所说的蛭弧菌和噬菌体，可向菌种保藏机构索取或从环境中分离获得。 并分别测定蛭弧菌和噬菌体的裂解范围。选择对常见的沙门氏菌属、弧菌属、志贺氏菌属、 大肠埃希氏菌属、耶尔森氏菌属、绿脓假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属中的大部分有害 细菌有裂解(杀灭)作用的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株。本发明的宿主菌，首先用常规方法获取对蛭弧菌敏感的、不产毒素的非致病菌为 宿主菌，如大肠杆菌K12、C600，欧文氏菌，植物乳杆菌等，再用加热或氯仿致死的方法使宿 主菌失活。具体做法是(以大肠杆菌C600为例)向菌种保藏机构索取或从环境中分离得 到大肠杆菌(本实验的大肠杆菌C600来源于中国科学院微生物研究所)，将其在营养琼脂 上划线分离，培养后，作相应的血清凝集，取凝集反应阳性的单菌落，接种到营养肉汤中，培 养后，转种琼脂斜面培养，用灭菌蒸馏水洗脱菌苔，去除培养基中的营养物质，再加入灭菌蒸溜水配制成菌悬液；然后加热灭菌，或者用氯仿(三氯甲烷)处理，即得到失活的大肠杆菌。其次，以上述失活的大肠杆菌为宿主，首先筛选对有害细菌裂解范围相对较广，又 能不破坏有益细菌的蛭弧菌，用蛭弧菌常规培养法获取其培养物后，再对其进行驯化。具体 做法是从菌种保藏机构索取或从环境中分离得到蛭弧菌，并将其和失活的大肠杆菌宿主 加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着培 养，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂 平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43°C环境中能生长的蛭弧菌株。然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值3. 8-10. 0，经发酵培养，即得到蛭弧 菌培养物，蛭弧菌培养物也可冻干成粉剂。用噬菌体分离方法获取对有害细菌敏感的噬菌体，具体做法是向菌种保藏机构 索取或从病原体或环境中分离获得致病菌菌株，将其在营养琼脂上划线分离，培养后，作相 应的血清凝集，取凝集反应呈阳性的单菌落，接种到营养肉汤中培养，获得致病菌培养物。 然后，以致病菌培养物为宿主，筛选对有害细菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养 法获取其培养物后，选育出在10_43°C环境中能生长的对对应的致病菌有较强的裂解能力 的噬菌体毒株。然后，以对应的致病菌为宿主，校正其pH值3. 8-10. 0，经发酵培养，即得到噬菌体 培养物，噬菌体培养物也可冻干成粉剂。最后将得到的蛭弧菌培养物(或冻干培养物)和得到的噬菌体培养物(或冻干培 养物)按1 1-1 1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为lO-liTpfu/ml，噬菌体的含 量为10-1016pfu/ml。混合即得到用于防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产 品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的生物制剂——活性生物抗菌物。实施例一蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果1、菌株来源蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验 室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒 株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Bd39、Bd40、Bd59、Bd76、Bd81、Bd94、Bd98、 Bd329、Bd334 和弧菌噬菌体 f V3、f M6、f la、f lb，志贺氏菌噬菌体 f P22、f 119X、f 17、 Φ /F2a，伤寒噬菌体# Vi、φ S154，致病性大肠杆菌噬菌体# Τ2、φ Τ7，绿脓杆菌噬菌体 φ ΡΕ5、# Α、步 B。3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备蛭弧菌培养物的制备参见中华微生物学和免疫学杂志1982，2(1) :12_15。获得 的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双 层琼脂平板上，使其凝固，接着37°C培养28小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸 泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育 出在 10-43°C环境中能生长的蛭弧菌株 Bd39、Bd40、Bd59、Bd76、Bd81、Bd94、Bd98、Bd329、 Bd334。然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3. 8-10. 0，经发酵培养，即得到蛭 弧菌培养物。Uf 胃白勺im :#JALBacteriophages IntersciencePublishers, Inc. ,NewYork USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的 弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志 贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养 法获取其培养物。最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103_7pfu/ml ；噬菌体培养物，噬菌体的 含量为 ΙΟ6—13 fu/ml。4、不同种属细菌培养物的制备24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分 离，37°C培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37°C培养4-6小时，即得到不同种属 细菌培养物。实验设计以蛭弧菌的含量为103_7pfu/ml，噬菌体的含量为106_13pfu/ml混合培养 物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加 0. 5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37°C培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设 以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。5、结果见附表1。表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株混合培养物
霍乱弧菌古典型569B+
霍乱弧菌El Tor型18001+霍乱弧菌El Tor型18003 霍乱弧菌El Tor型E 97 不凝集弧菌17007 副溶血弧菌20004 福氏志贺氏菌51573 福氏志贺氏菌F171-1 宋氏志贺氏菌51592 鲍氏志贺氏菌51582 伤寒沙门氏菌50097 伤寒沙门氏菌0901 副伤寒甲沙门氏菌50001 副伤寒乙沙门氏菌50005 肠炎沙门氏菌50041 鼠伤寒沙门氏菌50013 猪霍乱沙门氏菌50019 致病性大肠杆菌44813 致病性大肠杆菌44817 变形杆菌49207 绿脓杆菌10102 金黄色葡萄球菌26003 粪链球菌32221 枯草杆菌6750权利要求
一种活性生物抗菌物，其特征在于，是以蛭弧菌和噬菌体的培养物为主要成份按比例混合制成，其特征在于，蛭弧菌和噬菌体的混合培养物通过以下方法制备(1)蛭弧菌培养物的获得先制得失活的蛭弧菌宿主菌，然后以此失活宿主菌为宿主，用蛭弧菌常规培养法制取蛭弧菌培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型的、能裂解有害细菌、不破坏有益细菌的、在10 43℃环境中能生长的蛭弧菌菌株，最后将上述过程中制得的失活宿主菌和选育出的蛭弧菌按101 100001的比例悬浮在发酵培养液中，校正其pH值3.8 10.0，经发酵培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用；(2)噬菌体培养物的获得制取敏感的噬菌体宿主菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取噬菌体培养物，再选择于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑典型的能裂解有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好的单噬斑浸泡于营养肉汤中，然后，取上清再制营养肉汤双层琼脂平板，最后将上述过程中制得的噬菌体培养物和敏感的宿主菌悬液按110 1108的比例悬浮在发酵培养液中，校正其pH值3.8 10.0，经发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的宿主菌；经检验确定无菌的发酵培养物或将发酵培养物冻干备用；(3)将上述蛭弧菌发酵培养物或将发酵培养物过滤浓缩冻干粉和经检验确定已经无菌的除菌过滤后的噬菌体发酵培养物或将发酵培养物冻干粉按11 11000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为每毫升10 1010pfu，噬菌体的含量每毫升为10 1016pfu；混合配制，使其悬浮在媒介液或混合在赋形剂中；即得到产品。
2.一种制备权利要求1所述活性生物抗菌物的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)蛭弧菌培养物的获得先制得失活的蛭弧菌宿主菌，然后以此失活宿主菌为宿主， 用蛭弧菌常规培养法制取蛭弧菌培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型的、能 裂解有害细菌、不破坏有益细菌的、在10-43°C环境中能生长的蛭弧菌菌株，最后将上述过 程中制得的失活宿主菌和选育出的蛭弧菌按10 1-10000 1的比例悬浮在的发酵培养液 中，校正其PH值，经发酵培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用；(2)噬菌体培养物的获得制取敏感的噬菌体宿主菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取噬菌体培养物，再选择 于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑典型的能裂解有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好的单 噬斑浸泡于营养肉汤中，然后，取上清再制营养肉汤双层琼脂平板，最后将上述过程中制得 的噬菌体培养物和敏感的宿主菌悬液按1 :10-1 108的比例悬浮在发酵培养液中，校正其 PH值，经发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的宿主菌；经检验确定无菌的发酵 培养物或将发酵培养物冻干备用；(3)将上述蛭弧菌发酵培养物或将发酵培养物冻干粉和经检验确定无菌的噬菌体发 酵培养物或将发酵培养物冻干粉按1 :1_1 =1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为每毫升 10-10、伪，噬菌体的含量每毫升为IO-IO16Pfu ；混合配制，使其悬浮在媒介液或混合在赋 形剂中；即得到产品。
全文摘要
本发明涉及一种活性生物抗菌物及其生产方法。所说的活性生物抗菌物，是以蛭弧菌和噬菌体的培养物为主要成份按比例混合制成。主要制备步骤是先分别获得蛭弧菌培养物和噬菌体培养物，再将它们按1∶1-1∶1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为10-1010/pfu，噬菌体的含量为10-1016/pfu；混合配制，使其悬浮在媒介液或混合在赋形剂中；即得到产品。本发明用于防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长具有明显的效果。
文档编号A01P13/00GK101991611SQ201010549139
公开日2011年3月30日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者秦生巨 申请人:秦生巨