专利名称：以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是一种以Bt蛋白B^86-Cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775-806.]。自 1981 年 khn印f 等克隆了 Bt 的第一个 ICPs 基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列，截止目前为止已发现和克隆了四五百种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cryIAc。在接下来的几年里，转cryIAb基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/cryIA基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益， 农民种植转基因作物量逐年增加，给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白在植物保护领域的应用潜力巨大，有待人们去大力开发。Bt886-cry3Aa是目前分离出的已知对对鞘翅目害虫有特异毒杀作用的苏云金芽孢杆菌分泌的毒力晶体蛋白，该毒力蛋白对桑天牛有特异毒力。桑天牛，属鞘翅目天牛科沟胫天牛亚科。其寄主包括桑、构、^^、白杨、欧美杨、柳、榆、苹果、沙果、樱桃、梨、野海棠、柞、褚、刺槐、树豆、枫杨、批把、油桐、花红、柑桔等。 其成虫食害寄主嫩枝皮和叶；幼虫于枝干的皮下和木质部内，向下蛀食，隧道内无粪屑，隔一定距离向外蛀1通气排粪屑孔，排出大量粪屑，削弱树势，重者枯死。Bt蛋白或基因的应用将是防治天牛为害林木的有效突破口。筛选分离克隆新的、 高毒力的Bt基因，提高现有Bt蛋白的毒力及杀虫活性，可以丰富杀虫基因资源，为转基因植物与工程菌株提供新的基因来源，可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
发明内容
本发明根据上述领域的需求，提供一种人工融合的Bt蛋白，本发明的实验数表明该融合蛋白比野生Bt蛋白能够在害虫体内滞留更长时间，从而具有更高的杀虫活性。以Bt蛋白Bt886_cry3Aa为基础的融合蛋白，其特征在于所述Bt886_cry3Aa蛋白的肽链的至少一端融合了氨基酸序列如ID No. 1的短肽Pl ；或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的氨基端融合了氨基酸序列如kq ID No. 1 的短肽Pl且羧基端融合了氨基酸序列如^^ ID No. 2所示的短肽P2。所述融合蛋白的氨基酸序列是^^ ID No. 3所示的氨基酸序列；或者kq ID No. 3 所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。所述融合蛋白的氨基酸序列是^^ ID No. 4所示的氨基酸序列；或者kq ID No. 4 所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。所述融合蛋白的氨基酸序列是^^ ID No. 5所示的氨基酸序列；或者kq ID No. 5 所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。编码上述任一融合蛋白的基因。所述基因的核苷酸序列如kq ID No. 6、7或8所示。含有上述基因的重组表达载体。由所述重组表达载体转化而得的宿主细胞。含有上述融合蛋白的杀虫剂。所述基因或重组表达载体在制备转基因植物中的应用。所述基因或重组表达载体在提高植物抗虫性中的应用。所述融合蛋白的制备方法，其特征在于将权利要求7所述的重组表达载体转入到宿主细胞中，诱导宿主细胞表达融合蛋白，分离融合蛋白。 本发明在前人已分离出的对鞘翅目有特异毒杀作用的Bt886-Cry3Aa基因以及筛选获得的天牛肠道内切葡聚糖酶特异结合活性短肽Pi、P2的基础上，将编码Pp P2短肽的DNA序列与Bt886-cry3Aa基因通过PCR扩增进行基因重组获得多种连接方式Cry3Aa融合蛋白的基因，并将Cry3Aa融合蛋白和Cry3Aa蛋白的基因分别构建到原核表达载体中得到融合蛋白的表达载体pET-30b(+)-Cry3Aa，pET-30b (+)-Pl-cry3Aa, pET-30b ( + )-P2-cry3Aa, pET_30b ( + )_cry3Aa_Pl，pET_30b ( + )_cry3Aa_P2， pET-30b (+) -Pl-cry3Aa-P2, pET_30b (+) -P2-cry3Aa_Pl。将这些表达载体转化到大肠杆菌中进行高效表达，获得亲合短肽与杀虫晶体蛋白的融合蛋毒白。本发明以桑天牛幼虫为试虫，进行融合肽生物活性的分析测定，计算Cry3Aa融合蛋白和Cry3Aa蛋白的致死率和生长抑制率，比较了 Cry3Aa融合蛋白与野生型Cry3Aa毒蛋白的毒性差异，将Cry3Aa融合蛋白与Cry3Aa毒蛋白饲喂桑天牛幼虫，比较Cry3Aa蛋白与融合Cry3Aa毒蛋白在昆虫消化道中的残留量和排泄物中的含量，分析毒蛋白在昆虫消化道内的滞留时间的差异，这些实验证明本发明获得的其中三种融合蛋白(Pl_cry3Aa，cry3Aa-Pl和Pl-cry3Aa-P2)较野生型 Cry3Aa蛋白具有更高的杀虫活性，能在害虫体内滞留更长时间，如表1及图5所示。
本领域技术人员可以根据本发明公开的融合蛋白的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代，缺失和/或增加一个或几个氨基酸得到与所述融合蛋白相同功能和活性的突变蛋白，应当理解为也在本发明的保护范围内。编码本发明的融合蛋白的基因，除本发明提供mkq ID No. 6、7、8所示的核苷酸外，由于密码子的简并性以及不同物种对密码子的偏好性，本领域技术人员可以调整出多种编码本发明的融合蛋白的基因序列。也都在本发明的保护范围内。将编码上述融合蛋白的基因作为外源基因克隆到适合不同宿主的骨架载体中得到多种重组表达载体，如本发明得到的pET-30b (+)-cry3Aa、pET_30b (+)-Pl-cry3Aa、 pET-30b ( + )-P2-cry3Aa、pET_30b ( + )_cry3Aa_Pl、pET_30b ( + )_cry3Aa_P2、 pET-30b (+) -Pl-cry3Aa-P2、pET_30b (+) -P2-cry3Aa_Pl，然后将重组表达载体转入宿主细胞中，如本发明采用的大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，诱导表达出本发明所要求保护的融合蛋白ο这类重组表达载体，以及转化有该重组表达载体的宿主细胞也在本发明要求保护的范围内。这些表达载体用于制备具有抗虫性的转基因植物的用途也在本发明的保护范围内，这种用途能够降低杀虫剂的使用量，减少环境污染，具有重要的应用价值。可以通过发酵转入融合蛋白基因的菌株，获得含有融合蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂。本领域技术人员，可以通过将转入上述重组表达载体的细菌或真菌进行大规模发酵得到本发明的融合蛋白。
图1. SDS-PAGE 凝胶检测M =Western Blot蛋白质分子量标准；1 未用IPTG诱导的cry3Aa ；2 加IPTG诱导的 cry3Aa 3 未用 IPTG 诱导的 Pl_cry3Aa ；4 加 IPTG 诱导的 Pl_cry3Aa ；5 未用 IPTG 诱导的 P2-cry3Aa ；6 加 IPTG 诱导的 P2_cry3Aa ；7 未用 IPTG 诱导的 cry3Aa_Pl ；8 加 IPTG 诱导的cry3Aa-Pl ；9 加IPTG诱导的pET_30b (+)空载对照；10 未用IPTG诱导的cry3Aa_P2 ； 11 力口 IPTG 诱导的 cry3Aa-P2 ； 12 未用 IPTG 诱导的 Pl-cry3Aa_P2 ； 13 力口 IPTG 诱导的 Pl-cry3Aa-P2 ；14 未用 IPTG 诱导的 P2_cry3Aa_Pl ；15 加 IPTG 诱导的 P2_cry3Aa_Pl图2. Western Blot检测目的蛋白M =Western Blot蛋白质分子量标准；1 未用IPTG诱导的cry3Aa ；2 加IPTG诱导的 cry3Aa ；3 未用 IPTG 诱导的 Pl_cry3Aa ；4 加 IPTG 诱导的 Pl_cry3Aa ；5 未用 IPTG 诱导的 P2-cry3Aa ；6 加 IPTG 诱导的 P2_cry3Aa ；7 和 16 加 IPTG 诱导的 pET_30b (+)空载对照；8 未用IPTG诱导的cry3Aa-Pl ；9 加IPTG诱导的cry3Aa_Pl ；10 未用IPTG诱导的 cry3Aa-P2 ；11 加 IPTG 诱导的 cry3Aa_P2 ；12 未用 IPTG 诱导的 Pl-cry3Aa_P2 ；13 加 IPTG 诱导的 Pl-cry3Aa-P2 ； 14 未用 IPTG 诱导的 P2-cry3Aa_Pl ； 15 加 IPTG 诱导的 P2-cry3Aa-Pl图3.检测到的肽段在Cry3Aa氨基酸序列中的分布情况图4. ELISA检测目的蛋白图5. Cry3Aa蛋白和融合Cry3Aa蛋白对桑天牛幼虫的影响图6.短肽融合Cry3Aa对桑天牛幼虫生长发育的影响图7.桑天牛幼虫取食Cry3Aa和融合Cry3Aa蛋白后不同时间的排泄物重量图8.取食Cry3Aa和短肽融合Cry3Aa后桑天牛不同时间排泄物中Cry3Aa含量
图9. Cry3Aa和短肽融合Cry3Aa蛋白在桑天牛中肠内的滞留时间
具体实施例方式以下材料为已知材料，本实验室也有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于实验。质粒pET-30b(+)_2K。桑天牛幼虫。实施例1.构建融合基因的原核表达载体以本实验室保存的携带有cry3Aa基因的pET-30b(+)_a(质粒为模板，以在引物5’ 端添加了纤维素酶亲合短肽P1，P2的引物(如下表)进行PCR扩增，得到Cry3Aa融合蛋白基因。通过一系列分子克隆操作获得了 7个pET-30b(+)原核表达载体pET-30b(+)-Cry3Aa、 pET-30b ( + )-Pl-cry3Aa、pET_30b ( + )_P2_cry3Aa、pET_30b ( + )_cry3Aa_Pl、 pET-30b (+) -cry3Aa-P2、pET_30b (+) -Pl_cry3Aa_P2、pET_30b (+) -P2_cry3Aa_Pl。
权利要求
1.以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白，其特征在于所述Bt886_cry3Aa蛋白的肽链的至少一端融合了氨基酸序列如ID No. 1的短肽Pl ；或者所述Bt886-Cry3Aa蛋白的肽链的氨基端融合了氨基酸序列如kq ID No. 1的短肽Pl且羧基端融合了氨基酸序列如^^ ID No. 2所示的短肽P2。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列是kqID No. 3,Seq IDID No. 5所示的氨基酸序列；或者kq ID No. 3、Seq ID No. 4或kq ID No. 5所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其核苷酸序列如％(1ID No.6、7或8所示。
5.含有权利要求3所述基因的重组表达载体。
6.由权利要求5所述重组表达载体转化而得的宿主细胞。
7.杀虫剂，含有权利要求1或2任一所述融合蛋白。
8.权利要求3所述基因或权利要求7所述重组表达载体在制备转基因植物中的应用。
9.权利要求3所述基因或权利要求7所述重组表达载体在提高植物抗虫性中的应用。
10.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于将权利要求7所述的重组表达载体转入到宿主细胞中，诱导宿主细胞表达融合蛋白，分离融合蛋白。
全文摘要
本发明以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途，属于生物技术领域。以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白，其特征在于所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的至少一端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1；或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的氨基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1且羧基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.2所示的短肽P2。该融合蛋白比野生Bt蛋白能够在害虫体内滞留更长时间，具有更高的杀虫活性。
文档编号A01N47/44GK102276728SQ20111022714
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者卢孟柱, 唐芳, 胡建军, 赵树堂, 郭长花, 陈敏 申请人:中国林业科学研究院林业研究所