专利名称：一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，属于医学动物模型研究领域。
背景技术：
细菌生物被膜(biofilm，BF)是指 单一或多种类群细菌为了适应周围环境，吸附于异物或组织表面，繁殖并分泌大量多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，使得细菌相互聚集、粘连、缠绕，形成具有三维立体结构的膜样物，是细菌微菌落聚集体(Hall-Stoodley L, Costerton Jff, Stoodley P.Bacterial biofilms :from the naturalenvironment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol, 2004,2 :95-108)。在自然界中，任何细菌在成熟条件下都可以形成生物被膜，并且90%以上的微生物是以生物被膜的形式生存生长的(Costerton Jff, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms acommon cause of persistent infections. Science, 1999, 284 :1318-1322)。美国疾病控制预防中心专家估计65%以上的人类细菌感染与BF有关(Potera C, Forging a linkbetween biofilms and disease. Science, 1999, 283 :1837,1839),因而有关生物被膜的研究日益成为热点。已有越来越多的实验证明生物被膜可能是细菌在宿主体内真实的存在形式，这提示如果能有效预防控制BF感染，在临床感染治疗中将具有重要意义。生物被膜状态下的细菌性质于浮游状态的细菌有较大不同，其对抗生素及宿主的免疫反应不敏感，临床上发现即使多次试验证明有效的药物，也不能彻底清除生物被膜，这就导致感染迁延不愈，浪费了大量的人力及物力，形成了公共卫生问题。所以，建立一种新型的更符合临床实际情况的、简单、可靠的体内细菌生物被膜动物感染模型，用以研究细菌在动物体内真实存在形成，从而理解细菌的致病机理，以期控制疫病。近年来，体内生物被膜模型的建立方法有大量的报道，但大部分是都是人为外源性的把部分器械(导管，组织套管等)埋于动物体内，造成体内感染的动物模型，此类方法都不能很好的模拟真实的细菌感染的途径，定植于组织的部位，与理想的体内感染有一定差异。目前在脊髓动物模型上埋植导管等建立的体内模型主要包括中心静脉导管模型、皮下异源物质的感染模型、腹膜内外源物质的感染模型、尿道感染模型、呼吸道感染模型和骨髓炎感染模型等。研究者首次利用大鼠模型来研究金黄色葡萄球菌(Ulphani JS, RuppMEiModel of Staphylococcus aureus central venous catheter-associated infectionin rats. Lab Anim Sci，1999，49 :283-287)和表皮葡萄球菌(Rupp ME，Ulphani JS,Fey PD， Mack D， Characterization of Staphylococcus epidermidis polysaccharideintercellular adhesin/hemagglutinin in the pathogenesis of intravascularcatheter-associated infection in a rat model. Infect Immun，1999，67 :2656-2659)在动物体内生物被膜的形成。在这种模型上，硅胶导管被埋至于大鼠的静脉导管上，以细菌接种静脉导管。皮下异源物质感染模型主要用到一种由聚四氟乙烯材质的组织套管，里面包含玻璃珠和其他材料，这种外源的物体被埋入皮下，使得细菌生物被膜能在上面生成。该模型的主要优点在于微生物细胞可以很容易的在组织套管中定植，并不需移出。在很多体内生物被膜研究中，细菌能够在埋入兔子和老鼠腹膜腔内的生物材料上形成生物被膜。这种情况是在埋入生物材料后接种一定量的细菌(Buret A, Ward KH, Olson ME,Costerton Jff,An in vivo model to study the pathobiology of infectious biofilmson biomaterial surfaces. J Biomed Mater Res, 1991,25 :865-874)。该模型的优势是让机体建立ー种慢性感染，使得宿主长期处于细菌感染状态(Gagnon RF，Richards GK, A mousemodel of implant-associated infection. Int J Artif Organs, 1993,16 :789-798)。Satoh 等(Satoh M, Munakata K, Kitoh K, Takeuchi H, Yoshida 0, A newly designedmodel for infection-induced bladder stone formation in the rat. J Urol,1984,132 1247-1249)利用此模型把锌碟片埋植于 大鼠的膀胱中，然后经膀胱接种变形杆菌，随后证实尿道感染中细菌生物被膜的形成和基质的产生在尿道感染中起重要作用(Nickel JC,Olson M,McLean RJ,Grant SK,Costerton Jff,An ecological study of infected urinarystone genesis in an animal model. Br J Urol, 1987, 59 :21-30)。气管导管动物模型主要是将灭菌的导管插入动物气管后，将一定量菌液通过导管注入肺内，该方法与临床上气管感染生物被膜的实际形成过程不相符合，且主要反映的不是气管内真实的情況。以上方法都存在手术放置外源异物造成动物机体的感染，不是真实反映病原菌天然感染的真实状态，由于手术放置外源异物给动物体带来了较大刺激，并有可能导致手术后其他细菌的感染，从而干扰实验結果。因此，建立真实反映机体生物被膜感染的体内模型，深入研究细菌生物被膜在动物体内形成的机制，就显得尤为重要。随着相关技术的不断更新和发展，人们对细菌生物被膜的认识和理解将越发深入和透彻，也就可以更好地控制生物被膜，造福社会。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单易行、对研究者技术要求低，模型制作成功率高，能真实模拟细菌体内生物被膜感染的动物模型的构建方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了ー种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，包括以下步骤(I)细菌悬液的准备；(2)实验动物的麻酔及背部肌肉感染；(3)鉴定动物模型相关指标。步骤(I)中细菌悬液由以下方法获得将_80°C温度下保存的用于接解的细菌划哥伦比亚血平板，挑单菌落在培养基中37°C的温度下过夜培养；然后取菌液加入新鲜THB培养基，37°C摇床继续培养过夜，涂片检查为纯培养后，以I : 100接种摇菌培养4-6小时获得对数生长期的菌体，以分光光度计测定0D600值为08-1. O之间；将菌体以无菌THB清洗2-3遍后；以THB培养基调节细菌浓度为IO6个/ml备用。所述用于接种的细菌为猪链球菌临床分离株。所述的实验动物为纯系斑马鱼。实验动物的麻酔及背部肌肉感染为用浓度95 μ g/mL的三卡因间氨苯酸こ脂甲磺酸盐(MS-222)将斑马鱼麻醉；背部接种5 X IO4/鱼的细菌数量，对照组注射THB培养基，感染后24h，无菌采取背部感染的部位，将背部肌肉固定于2%的多聚甲醛中。分别在感染24小时后将所述实验方法的斑马鱼处死，对斑马鱼相关指标进行鉴定。所述的鉴定包括对背部肌肉制备冰冻组织切片，进行HE染色、革兰氏染色和扫描电镜(SHM)观察。采用本发明的方法，通过斑马鱼背部肌肉注射猪链球菌，建立了细菌形成生物被膜感染的体内动物模型，有效地模拟了细菌感染动物的真实情况，发现猪链球菌在斑马鱼背部肌肉内大量积聚，形成生物被膜感染的状态，获得的体内动物模型符 合实际且稳定性好，从而为进ー步了解细菌在动物体内存在的真实状态，了解细菌生物被膜在体内的形成机制及深入理解细菌的致病机理，开发相关药物提供了动物模型。同时，该构建方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。
图I为斑马鱼背部肌肉冰冻切片HE染色结果；图2为斑马鱼背部肌肉冰冻切片革兰氏染色结果；图3为斑马鱼背部肌肉扫描电镜結果。
具体实施例方式实施例I.细菌悬液的准备将_80°C保存的猪链球菌菌株划哥伦比亚血平板，挑单菌落在培养基中37°C过夜培养。然后取菌液加入新鲜THB培养基(市售)，37°C摇床继续培养过夜，涂片检查为纯培养后，以I : 100接种摇菌培养4-6小时获得对数生长期的菌体，以分光光度计测定0D600值为08-1. O之间。将菌体以无菌THB清洗2-3遍后。以THB培养基调节细菌浓度为IO6个/ml备用。2.实验动物的麻酔及背部肌肉感染斑马鱼的饲养方法按一般热带鱼的饲养方法饲养。用浓度95 μ g/mL的三卡因间氨苯酸こ脂甲磺酸盐(MS-222)(杭州动物药品厂)将斑马鱼麻酔。根据实验室报道确定的进行预实验确认接种的细菌剂量。背部接种5 X IO4/鱼的细菌数量，对照组注射THB培养基，感染后24h，无菌采取背部感染的部位，将背部肌肉固定于2%的多聚甲醛中或液氮中。3.动物模型相关指标的鉴定(I)冰冻切片的制备将制备好的斑马鱼背部肌肉组织切成大约24X24X2mm的大小速放于冷冻台上，冰冻。调好欲切的厚度，进行切片。(2)常规HE染色步骤冰冻切片固定(10 30s) —稍水洗(I 2s)-_苏木精液染色(30 60s)—流水洗去苏木精液(5 IOs)—I%盐酸こ醇(I 3s) —稍水洗(I 2s) —促蓝液返蓝(5 IOs)-流水冲洗(15 30s)—O. 5%曙红液染色(30 60s) —蒸馏水稍洗(I 2s)—80%こ醇(I 2s)—95%こ醇(I 2s)—无水こ醇(I 2s)—石炭酸ニ甲苯(2 3s)— ニ甲苯⑴(2 3s)—ニ甲苯(II) (2 3s)—中性树胶封固。(3)常规革兰氏染色将制备好的冰冻切片进行常规革兰氏染色。革兰氏阴性菌呈红色，而革兰氏阳性菌保有原来的紫色。(4)扫描电镜观察将无菌采取的斑马鱼背部肌肉组织放于4%戊ニ醛固定6h ；0. IM磷酸缓冲液清洗3次,姆次IOmin ;2%锇酸固定至样品黑透,用O. IM磷 酸缓冲液清洗3次,姆次IOmin ;再依次用30%、50%、70%和90%こ醇脱水15min ;最后用100%こ醇脱水两次，毎次15min ;放入干燥篮，用临界点干燥仪进行干燥；取出干燥样品，用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪进行喷金处理(电流15mA，2min)。按需要调节观察条件，在扫描电镜下对处理好的样品进行观察并拍摄电镜照片。4.模型建立的评价结果(I)肉眼分析所有细菌接种组都可见背部肌肉有坏死灶并有渗出液，显示感染迹象。空白对照组创面相对清洁，几乎无渗出。(2) HE染色光学显微镜下分析由图I显示猪链球菌在斑马鱼肌肉组织中出现明显的集群现象。A :斑马鱼肌肉丛切HE染色B :斑马鱼肌肉横切HE染色(3)革兰氏染色结果由图2显示猪链球菌在斑马鱼肌肉组织中出现明显的细菌聚团成簇的现象，可见明显形成生物被膜的细菌集落。(4)扫描电镜分析由图3可知，扫描电镜显示在感染的创面有有多糖包裹的类似干“生物被膜”样的膜样结构，把细菌包裹形成细胞簇，包裹形成的膜不同于宿主本身的细胞膜，厚度厚于细胞壁。
权利要求
1.ー种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤， (1)细菌悬液的准备； (2)实验动物的麻酔及背部肌肉感染； (3)鉴定动物模型相关指标。
2.根据权利要求I所述的体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于步骤(I)中细菌悬液由以下方法获得将-80°C温度下保存的用于接解的细菌划哥伦比亚血平板，挑单菌落在培养基中37°C的温度下过夜培养；然后取菌液加入THB培养基，37°C摇床继续培养过夜，涂片检查为纯培养后，以I : 100接种摇菌培养4-6小时获得对数生长期的菌体，測定OD600值为08-1. O之间；将菌体清洗2-3遍后；调节细菌浓度为IO6个/ml备用。
3.根据权利要求2所述的体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于所述用于接种的细菌为猪链球菌临床分离株。
4.根据权利要求1-3中任一条所述的体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于所述的实验动物为纯系斑马鱼。
5.根据权利要求1-3中任一条所述的体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于实验动物的麻酔及背部肌肉感染为用浓度95μ g/mL的三卡因间氨苯酸こ脂甲磺酸盐(MS-222)将斑马鱼麻醉；背部接种5 X IO4/鱼的细菌数量，对照组注射THB培养基，感染后24h，无菌采取背部感染的部位，将背部肌肉固定于2%的多聚甲醛中。
6.根据权利要求I所述的体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于分别在感染24小时后将所述实验方法的斑马鱼处死，对斑马鱼相关指标进行鉴定。
7.根据权利要求I所述的体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于所述的鉴定包括对背部肌肉甲醛固定制备组织切片，进行HE染色、革兰氏染色和扫描电镜(SEM)观察。
全文摘要
本发明涉及一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，它包括以下步骤，(1)细菌悬液的准备；(2)实验动物的麻醉及背部肌肉感染；(3)鉴定动物模型相关指标。采用本发明的方法，通过斑马鱼背部肌肉注射猪链球菌，建立了细菌形成生物被膜感染的体内动物模型，有效地模拟了细菌感染动物的真实情况，发现猪链球菌在斑马鱼背部肌肉中大量积聚，形成生物被膜感染的状态，获得的体内动物模型符合实际且稳定性好，从而为进一步了解细菌在动物体内存在的真实状态，了解细菌生物被膜在体内的形成机制及深入理解细菌的致病机理，开发相关药物提供了动物模型。同时，该构建方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。
文档编号A01K61/00GK102669017SQ20111042798
公开日2012年9月19日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者余祖华, 刘一尘, 史明艳, 张才, 张春杰, 张蕾, 易力, 李小康, 汪洋, 程相朝 申请人:河南科技大学