专利名称：一种用石斛组织诱导原球茎的方法
技术领域：
本发明涉及一种用石斛组织诱导原球茎的方法。
背景技术：
石斛属是兰科植物中的最大的属之一，为多年生草本植物，原产地主要分布在亚热带和热带地区，全球有1500余种，我国约76种。石斛属植物是我国传统的名贵中药材， 最早在《神农本草经》中即有记载，此外在明代李时珍的《本草纲目》中也有详细记载。我国约有40种石斛兰可做药用。其中比较著名的有金钗石斛、铁皮石斛和霍山石斛等。古籍上记载石斛具有强阴益精，补肾益力，轻身延年等作用，此外还有益胃生津，滋阴清热，止咳润肺的功效。现代研究也表明石斛中含有抗肿瘤，抗衰老和增加人体免疫力的成分。同时石斛兰花姿优美，花色艳丽，花期较长，且大部分都有芳香性，也是深受人们喜爱的观赏花卉。由于石斛兰集药用和观赏于一体的价值，自然繁殖力极低，生长缓慢，加之掠夺性采挖，致使野生石斛兰资源已经严重枯竭，我国已将其列为濒于绝灭的受保护的植物之一。 目前几乎所有用作观赏植物栽培的石斛兰都是杂交种，种子小，数目多且发育不完全，同时种子繁殖无法保持其品种特性，结实率低，分株能力弱，因而繁殖系数低，繁殖速度慢，很难满足市场对植株品质的要求，利用组织培养技术快速繁殖石斛兰，能够克服其种子繁殖与分株繁殖技术上的缺点，因此石斛兰的组培快繁研究非常必要，且具有较高的实用价值。原球茎诱导是组织培养一个关键的环节，目前石斛植物原球茎诱导效率不高，已成为制约石斛兰快速繁殖的关键步骤之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效利用石斛组织诱导原球茎的方法，主要是用石斛茎尖进行原球茎诱导，为石斛兰的快速繁殖和工业化大规模培养创造条件。本发明采用的技术方案是一种用石斛组织诱导原球茎的方法，所述方法包括(1)取石斛组织进行常规无菌处理，所述石斛组织来自石斛茎尖、根尖或者幼嫩茎段；(2)无菌处理的石斛组织在诱导培养基中进行诱导培养，先于黑暗条件下23 25°C培养一周后，再进行光照培养20 30d，光照周期为12h/天、温度23 25°C，至诱导获得原球茎；所述诱导培养基组成如下琼脂糖3 4g/L，萘乙酸0. 5 aiig/L，6-BA 0. 3 lmg/L，溶剂为V2MS培养基。光照培养20d时原球茎增大到合适程度，并开始发绿，若进行继代培养，可以选择这个阶段进行继代培养，可以有效保证继代效果；25d左右为最适移栽时间，此时原球茎开始分化出根和芽，分化速度和顺序有培养基主城有关；30d左右培养基营养成分减少，渐渐开始影响原球茎的生长，最好在此之前移栽。MS为常用的基本培养基，其无机盐与离子的浓度较高，是较为稳定的平衡培养液，但是硝酸盐含量较高，而1/2MS是将MS的大量元素减半其他不变而配制的培养基，主要是降低无机盐浓度，作用和MS大致相同只是不同植物不同要求而已。1/2MS培养基的成分如下大量元素:KN03 950mg/L, NH4NO3 825mg/L, KH2PO4 85mg/L, MgSO4. 7H20185mg/L, CaCl2. 2H20 220mg/L ；微量元素KI 0· 415mg/L，H3BO3 3. lmg/L，MnSO4. 4H20 11. 15mg/L, ZnSO4. 7H20 4. 3mg/L, Na2MoO4. 2H200. 125mg/L, CuSO4. 5H20 0. 0125mg/L, CoCl2. 0. 0125mg/L, Na2. EDTA37. 3mg/L, FeSO4. 7H20 27. 8mg/L ；有机成分肌醇 100mg/L，甘氨酸 ang/L，盐酸硫胺素(VBl) 0. lmg/L，盐酸吡哆醇(VB6)0. 5mg/L，烟酸 VB5 或 VPP 0. 5mg/L，蔗糖 40g/L，琼脂 7g/L，溶剂为水。优选的所述诱导培养基组成如下琼脂糖3. 8g/L，萘乙酸0. 5mg/L,6-BA 0. 66mg/ L，溶剂为1/2MS培养基，pH5. 8 ；具体的，所述无菌处理为先用75%乙醇漂洗2 3次，然后用0. 升汞溶液浸泡处理5 IOmin (茎尖、根尖5min，茎段IOmin)，最后再用无菌水冲洗2 3次。实验发现茎尖的诱导成功率最高，因此所述石斛组织优选来自茎尖。本发明石斛优选为铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、束花石斛、齿瓣石斛和霍山石斛中的一种。本发明的有益效果主要体现在(1)方法操作简单，生产成本低，环境污染低；(2) 诱导成功率高，用茎段培养诱导率一般在50 %左右，根尖可以达到60 % 70 %，茎尖具有最好的诱导成功率可以达到75%左右；C3)培养周期短，可以在较短时间内获得大量原球茎，诱导出的原球茎可直接进行无菌培养获得大量幼苗；(4)直接利用组织培养，良好保持亲本性状。
图1为诱导出的原球茎；图2为原球茎开始分化成苗；图3为原球茎分化成苗。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 a、石斛外植体选择及无菌处理1、选取云南铁皮石斛(产地云南)幼嫩茎尖，切取约0.3cm左右的尖端部分，先用自来水冲洗，除去表面污物，再用蒸馏水漂洗；2、将尖端置于75% (ν/ν)乙醇中处理30 60s，漂洗两次；3、将乙醇漂洗后的茎尖置于0. 1% (w/w)升汞溶液中浸泡5min ；4、取出后用无菌水漂洗3次，除去表面吸附的升汞溶液；b、原球茎诱导1、将无菌处理后的石斛茎尖置于石斛原球茎诱导培养基上进行原球茎诱导。培养基组成为l/2MS+3. 8g/L 琼脂糖 + 萘乙酸 0. 5mg/L+6-BA0. 66mg/L ；pH5. 8 ；2、在黑暗环境培养一周，温度保持在23 25°C ；
3、将暗培养后的材料(图1)转为光照培养，温度保持在23 25°C，光照周期12h/ day,光照培养20d时原球茎增大到合适程度，并开始发绿(图2)，第25d开始分化出根和芽 (图3)，此时可进行移栽；按照上述方法，原球茎诱导成功率约75%。C、大规模繁殖将诱导出的原球茎进行继代培养后进行分株，组织培养至形成新的植株即可进行分栽。以金钗石斛、鼓槌石斛、束花石斛、齿瓣石斛和霍山石斛分别按上述方法进行原球茎的诱导培养，原球茎诱导成功率均在60%以上。
权利要求
1.一种用石斛组织诱导原球茎的方法，所述方法包括(1)取石斛组织进行无菌处理，所述石斛组织来自石斛茎尖、根尖或者幼嫩茎段；(2)无菌处理的石斛组织在诱导培养基中进行诱导培养，先于黑暗条件下23 25°C培养一周后，再进行光照培养20 30d，光照周期为12h/天、温度23 25°C，至诱导获得原球茎；所述诱导培养基组成如下琼脂糖3 4g/L，萘乙酸0. 5 ang/L，6-BA0. 3 lmg/L， 溶剂为1/2MS培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述诱导培养基组成如下琼脂糖3.8g/L，萘乙酸 0. 5mg/L，6-BA 0. 66mg/L，溶剂为 1/2MS 培养基，pH5. 8。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述无菌处理为先用75%乙醇漂洗2 3 次，然后用0. 升汞溶液处理5 lOmin，最后再用无菌水冲洗2 3次。
4.如权利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所述石斛组织来自茎尖。
全文摘要
本发明提供了一种用石斛组织诱导原球茎的方法，所述方法包括(1)取石斛组织进行常规无菌处理，所述石斛组织来自石斛茎尖、根尖或者幼嫩茎段；(2)无菌处理的石斛组织在诱导培养基中进行诱导培养，先于黑暗条件下23～25℃培养一周后，再进行光照培养20～30d，光照周期为12h/天，温度23～25℃，至诱导获得原球茎；本发明的有益效果主要体现在(1)方法操作简单，生产成本低，环境污染低；(2)诱导成功率高，用茎段培养诱导率一般在50％左右，根尖可以达到60％～70％，茎尖具有最好的诱导成功率可以达到75％左右；(3)培养周期短，可以在较短时间内获得大量原球茎，诱导出的原球茎可直接进行无菌培养获得大量幼苗；(4)直接利用组织培养，良好保持亲本性状。
文档编号A01H4/00GK102428874SQ201110445130
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者朱涵毅, 王慧中, 薛大伟 申请人:杭州师范大学