专利名称：培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子。
背景技术：
水稻作为重要的粮食作物之一，为世界上一半以上的人口提供食物来源。水稻种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量将近占全国粮食总产的1/2。水稻病害一直严重影响水稻的生产。水稻病害的种类很多，全世界有近百种，我国正式记载的达70余种，有经济重要性的有20余种，其中稻瘟病、纹枯病和白叶枯病发生面积大、流行性强、危害严重，是水稻上的“三大重要病害”。以水稻白叶枯病为例，田间常在分蘖期观察到病症，并随植株的生长而发展，至抽穗期达到高峰。水稻遭受白叶枯病后，一般减产20-30%，严重时甚至绝收。不断提高水稻产量、品质及抗病性，为保障国家粮食安全和农业可持续发展有重要意义。目前应对农作物病害的主要手段是培育抗病品种和化学农药防治。然而现有的水稻抗病品种存在育种周期长、抗性丧失快等重大技术障碍，化学农药的施用对环境造成严重污染。从植物本身进一步挖掘抗病基因资源，可为应对水稻重大病害及不断产生的新病害提供抗病育种的新手段和新策略。目前，水稻中已定位30多个稻瘟病抗性位点和25个白叶枯病抗性位点。抗性基因(R基因)介导的抗病性水平高，常表现高抗，是抗病基因工程中常用的抗病基因。但R基因和病原菌avr基因的·互作表现为品种对小种的专化性抗性，所以R基因介导的水稻抗病性常因病原菌群体生理小种的变化而丧失。在真核生物中广泛存在的非编码小 RNA (nonconding small RNAs)包括 miRNAs (microRNAs)和 siRNA (short interferingRNAs)，可以通过对靶标RNA的剪切或翻译抑制，以及DNA或染色体的甲基化等调控靶标基因的表达。miRNA由非编码核基因转录而来，其基因多定位于基因之间的间隔区，也有一些位于基因的内含子区域，有些成族存在。对已测序的生物的基因组研究发现，越闻等的生物其基因间隔区所占比例越大。越来越多的研究表明，这些非编码小RNA参与了生物的生长发育和抗病应答过程。系统分析植物中参与这些应答过程的小RNA,并根据小RNA对应的革巴标基因分析靶标基因参与的代谢途径，为进一步应用小RNA调控植物抗病打下基础。大量的研究表明小RNA介导的基因沉默是植物和动物抵抗病毒侵染的重要分子机制。最新的研究表明，小RNA也参与了植物抗细菌的基础免疫反应。因此，小RNA为开发新的水稻抗病途径提供良好的基因资源。miRNA序列在拟南芥和水稻之间相对保守，但水稻中也存在其特异的miRNA，这可能暗示在水稻中存在特异的小RNA参与的基因调控网络；siRNA的种类多样，在不同物种之间的保守性不强，其功能尚未完全阐述清楚，但已有研究发现假单胞菌(Pseudomonassyringae)可以诱导拟南芥内源siRNA表达,并且siRNA在植物免疫中同miRNA—样有重要的调节功能。对水稻小RNA抗病基因资源的挖掘不但在植物抗病机理的研究上可能有新的重大发现，更重要的是分离鉴定对水稻抗病/植物免疫中有潜在应用价值的小RNA，可为水稻抗病育种提供拥有自主知识产权基因资源，建立水稻抗病育种的新策略。目前已发现内源小RNA广泛参与了植物形态建成、开花、根系发育、激素应答和抗胁迫反应等重要相关基因的表达调控。植物内源小RNA(small RNA)主要包括miRNA和siRNA两类。siRNA又分为主要的四类，分别为内源性siRNA (natural antisense siRNA,nat-siRNA)、反式作用 siRNA(trans-acting short interfering RNAs, tasiRNAs)、异染色质 siRNA (heterochromatic si RNAs, he si RNAs)和长 siRNA(long siRNA, IsiRNA)。不同的Dicer酶切割不同的底物产生21-30nt的小RNA，而miRNA和siRNA均能与特异的AGO(Argonaute)蛋白结合形成 RTSC 复合物(RNA-1nduced silencing complexes),并作用于不同的靶标基因，引起小RNA介导的基因沉默。水稻中有8个类Dicer (OsDCLs)、19个ARG0NAUTE 蛋白(OsAGOs)和 5 个依赖 RNA 的 RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,OsRDRs)。siRNA来源于入侵核酸或病毒复制形成的双链RNA，这些外源siRNA介导的RNA沉默是一种被动的防御机制；而在染色体上发现的内源性的siRNA则是细胞主动利用RNA沉默机制。最近的研究表明，在植物与病原细菌互作过程中，内源的小RNA也参与了植物抗细菌的基础免疫反应。研究者已经成功鉴定了两个植物病原细菌的病原相关分子模式PAMP(pathogen-associated molecular pattern)及其特异性的模式识别受体(patternrecognition receptor),即鞭毛蛋白片段f lg22 (其受体为激酶FLS2)和延长因子EF-TU (其受体为EFR)。其中，flg22可被水稻受体0sFLS2所识别已经获得实验证实。有意义的是，目前研究发现拟南芥的micr0RNA393会被flg22特异性地诱导，随后micr0RNA393介导了植物生长素受体基因TIR1，AFB2和AFB3mRNA的降解，使生长素信号途径受到抑制。又如，拟南芥miRNA途径关键基因DCLl和Henl突变的dcll_9和henl_l突变体，会表现出一定程度的免疫缺损，III型分泌系统突变的Pseudomonas syringae pv.tomato (Pto)DC3000 hrcC-病原菌，虽然不能分泌毒性蛋白因子，但在dcll_9和henl_l突变体上PtoDC3000 hrcC-和野生型Pto DC3000病原菌使上述两个拟南芥突变体都感病，miRNA途径的破坏甚至导致非寄主病原(如E.coli和P.fIuorescens)对拟南芥的侵染。miRNA途径可能是植物基础抗性的重要组成部分。进一步研究表明病原细菌(P.syringae)的效应蛋白AvrPtoB可通过抑制拟南芥pr 1-microRNA393的转录,从而抑制植物由细菌的效应蛋白引发的免疫反应，即 ETI (effector-triggered immunity)途径。启动子是调控基因表达的重要元件，是生物遗传操作中必要因素，对于基因功能的研究和转基因育种都具有重要价值。组成型启动子是应用较为广泛的启动子，多用于基因的过量表达，没有时间和空间的特异性；而诱导型启动子则因具有应答特异刺激下表达的特点而被应用在光、热、创伤、病原、激素等生物诱导或非生物逆境胁迫(干旱、高盐、低温等)条件下表达；组织特异性启动子在根、叶、花、果实等特定组织中表达。组织特异性启动子和诱导型启动子较组成型启动子在应用上的优势在于，只在特定时空表达而避免过度损耗能量，有利于平衡植物生长发育与应答逆境的关系。因此，挖掘诱导型或组织特异性启动子元件，转基因分子设计育种都具有重要作用。植物抗病基因工程所首选的最佳目的基因是来自植物自身的抗病基因，包括参与抗病功能调控的小RNA。利用病原诱导型的启动子驱动抗病相关的小RNA表达是较为理想的策略。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育抗病转基因植物方法。本发明提供的方法，为将micix)RNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得转基因植物；所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物。上述方法中，所述诱导型启动子为如下I)或2):I)由单顺式调控元件和CaMV35S启动子组成；2)由双顺式调控元件和CaMV35S启动子组成；所述microRNA393的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述单顺式调控元件的核苷酸序列为序列I的自5’末端第1-66位核苷酸；所述双顺式调控元件的核苷酸序列为序列2的自5’末端第1-114位核苷酸；所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列I的自5’末端第67-178位核苷酸或序列表中序列2自5’末端第115-226位核苷酸；上述micix)RNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。上述方法中，所述micr0RNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子通过植物表达载体导入所述目的植物；所述植物表达载体为如下a)或b):
a)为将序列表中的序列I插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体；b)为将序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体。上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。上述方法中，所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物是在引发所述病的病原菌诱导下产生的；所述病具体为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病的病原菌具体为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)。本发明的另一个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为如下a)或b):a)为将序列表中的序列I插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位点中，得到表达microRNA393的载体；b)为将序列表中的序列2插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位点中，得到表达microRNA393的载体。本发明的第三个目的是提供一种DNA分子A。本发明提供的DNA分子A，为如下1)-4)中的任--种:I)序列表的序列I自5’末端第1-66位核苷酸所不的DNA分子；2)序列表的序列2自5’末端第1-114位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所述DNA序列杂交且具有同样功能的DNA分子；4)与I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有同样功能的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2X SSC，0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。本发明的第四个目的是提供一种DNA分子B。本发明提供的DNA分子B，为如下为如下1)_4)中的任--种:I)序列表的序列I自5’末端第1-178位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列2自5’末端第1-226位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；4)与I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2X SSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。上述的DNA分子A或上述的DNA分子B在启动目的基因在植物中表达的应用。在上述应用中，所述目的基因为microRNA393或GUS (genbank号gb I S69414.1)；所述microRNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。本发明的实验证明 ，本发明提供的培育转基因植物的方法，为将含有诱导型启动子和micix)RNA393的重组载体转化水稻，得到的转基因水稻在病原侵染过程中才启动microRNA393基因表达，可以实现抗水稻白叶枯病菌的目的，避免microRNA393过表达及对转基因植物本身的不利影响。本发明的显著优点为在单子叶植物中抗病育种中具有重要的应用价值。本发明提供的诱导型启动子为WRKY家族转录因子结合位点顺式元件(ATCGTTGACCGAGTTGACTTTATCGTTGACCGAGTTGACTTT)与 CaMV35S mini 启动子-89 +1 (TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGA)序列融合,构建成单倍顺式元件和双倍顺式元件分别与CaMV35S mini启动子组成的诱导型启动子驱动microRNA393表达的植物表达载体。
图1为包含CaMV35S_89mini启动子的植物表达载体pBI_89的结构示意2为转⑶S基因水稻染色实验图3为中间载体pl300-DAS的结构示意图
图4为质粒构建过程简5为转基因水稻抗病实验
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、启动子的获得I)设计引物引物序列如表1:表I为引物序列
权利要求
1.一种培育抗病转基因植物的方法，为将miCix)RNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得转基因植物；所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述诱导型启动子为如下I)或2): 1)由单顺式调控元件和CaMV35S启动子组成； 2)由双顺式调控元件和CaMV35S启动子组成； 所述microRNA393的核苷酸序列为序列表中的序列3 ； 所述单顺式调控元件的核苷酸序列为序列I的自5’末端第1-66位核苷酸； 所述双顺式调控元件的核苷酸序列为序列2的自5’末端第1-114位核苷酸； 所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列I的自5’末端第67-178位核苷酸或序列表中序列2自5’末端第115-226位核苷酸； 所述microRNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述micr0RNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子通过植物表达载体导入所述目的植物； 所述植物表达载体为如下a)或b): a)为将序列表中的序列I插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体； b)为将序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: 所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物是在引发所述病的病原菌诱导下产生的； 所述病具体为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病的病原菌具体为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)。
6.一种重组载体，为如下a)或b): a)为将序列表中的序列I插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体； b)为将序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体。
7.一种DNA分子A，为如下I)-4)中的任--种: 1)序列表的序列I自5’末端第1-66位核苷酸所不的DNA分子； 2)序列表的序列2自5’末端第1-114位核苷酸所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所述DNA序列杂交且具有同样功能的DNA分子； 4)与I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有同样功能的DNA分子。
8.一种DNA分子B，为如下I)-4)中的任--种: 1)序列表的序列I自5’末端第1-178位核苷酸所不的DNA分子； 2)序列表的序列2自5’末端第1-226位核苷酸所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； 4)与I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
9.权利要求7所述的DNA分子A或权利要求8所述的DNA分子B在启动目的基因在植物中表达的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于: 所述目的基因为microRNA393或⑶S ； 所述microRNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的 序列2自5’末端第227-364位核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子。本发明提供的方法，将microRNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得转基因植物；所述转基因植物的抗水稻白叶枯病高于所述目的植物；所述诱导型启动子为如下1)或2)1)由单顺式调控元件和CaMV35S启动子组成；2)由双顺式调控元件和CaMV35S启动子组成。本发明的实验证明，本发明提供的培育转基因植物的方法，为将含有诱导型启动子和microRNA393的重组载体转化水稻，得到的转基因水稻在病原侵染过程中才启动microRNA393基因表达。
文档编号A01H5/00GK103194484SQ20121000421
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者方荣祥, 贾燕涛, 陈晓英, 郭萍 申请人:中国科学院微生物研究所