专利名称：富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉胶囊、蛋白质水解液及药用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉胶囊、蛋白质水解液及药用。
背景技术：
作为传统中药的土鳖虫又名地鳖虫、土元、地乌龟、螗虫，为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体。其性寒，味苦，有小毒，归肝经，又破淤血，续筋骨之功效，主要用于筋骨折伤，淤血经闭，症瘕痞块。研究表明土鳖虫具有许多药理活性，如抗凝血、抗血栓作用，促纤溶作用，抗肝纤维化作用，抗肿瘤作用，红细胞免疫作用和保护血管内皮作用等。土鳖虫在医药、保健及健康食品等方面具有许多独特的功能，正越来越受到国内外专业人士和消费者的关注。土鳖虫含有氨基酸、蛋白质、生物碱、脂肪酸、酚类、糖类、留体及多种微量元素等。其中氨基酸为土鳖虫的主要成分，总量约占土鳖虫的40%，在17种游离及水解氨基酸中，有7种是人体必需氨基酸。有实验研究证明土鳖虫蛋白提取物对S180肉瘤荷瘤小鼠有显著的抑制作用，纯化得到的活性蛋白对鸡胚尿囊膜新生血管的生成有明显的抑制作用，且对鸡胚生长发育的影响较小，这说明土鳖虫蛋白提取物有良好的体内抑制肿瘤作用及血管生成抑制活性。通过噻唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测土鳖虫纤溶活性蛋白对2种肿瘤细胞(人食管癌细胞株Ecal09和人宫颈癌细胞株HeLa)的增殖抑制及周期的影响，结果发现土鳖虫纤溶活性蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制率与剂量和时间密切相关，随着土鳖虫纤溶活性蛋白浓度的增加，Gl期细胞数量明显减少，G2/M期的细胞数量有所增加，说明土鳖虫纤溶活性蛋白具有体外抑制肿瘤细胞的作用。为了进一步开发土鳖虫作为药物的应用，人们进行了长期的探索，提出了各种各样的方案。例如，中国专利文献公开了一种从中药土鳖虫中分离、提取抗肿瘤的有效部位脂肪酸的方法[申请号200510040664. I]，该方案采用将土鳖虫经有机溶剂提取得粗脂肪酸，再经柱层析法分离得有效部位脂肪酸，主要包括7-十八碳烯酸、十六烷酸、9-十六碳烯酸、十八酸。上述方案能够提取到土鳖虫中真正具有抗肿瘤作用和疗效的脂肪酸成分，并经实验证实单味中药土鳖虫有机溶剂提物具有广谱杀瘤作用，可用于治疗多种恶性肿瘤。解决了过去无法确定土鳖虫中哪一具体成分具有抗肿瘤功效以及无法提取有效部位的缺陷。 还有人发明了一种土鳖虫的仿生酶解产物及其用途[申请号200810118148.X]，其技术方案是采用仿生酶解的方法，取土鳖虫，加水匀浆后，在适当的条件下，先以胃蛋白酶保温酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保温酶解，所得的酶解物按不同的制剂要求制成制剂。该方案的产物在治疗心脑血管疾病及跌打损伤等方面具有良好效果。上述方案虽然在一定程度上改善了土鳖虫作为药物的应用，提升了土鳖虫的药用价值，但是所采用的土鳖虫均为人工普通养殖或野生土鳖虫，土鳖虫药材的营养价值、微量元素含量、有害重金属含量等方面存在着技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种易于实施，成本较低，能够获得高品质的富硒土鳖虫的饲养方法。本发明的另一目的是提供一种富硒土鳖虫冻干粉胶囊。本发明的还有一目的是提供一种富硒土鳖虫蛋白质水解液。本发明的再有一目的是提供一种富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的应用或者作为抗氧化药物的应用。为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案本富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法包括下述内容A、饲养场地建设建立多层饲养槽,每层间隔45cm-55cm,相邻的两饲养槽之间间隔80cm-120cm，在饲养槽内壁进行粉刷，并在饲养槽内壁上缘周边设置防止土鳖虫逃逸的阻挡体，在饲养槽底部铺设10cm-15cm饲养土 ；B、饲养土配制取土后用3mm-5_的筛子过筛，然后掺入草木灰混合均勻后形成饲养土，饲养土的湿度为含水量55% -65% ；C、饲料配制饲料包括下述重量份数的成分干的青饲料28-32wt%、豆饼 28-32wt %、富硒酵母O. 8-1. 2wt %、虾粉4_6wt %，麦麸32_36wt %，然后加入占上述所有成分总重量10-20%的水，并混合均匀；D、放养及放养密度以每一次蜕皮按龄计算，选用9-11龄的雌性土鳖虫在饲养场地进行养殖，放养密度为每平方米I. 5 2万只，每天傍晚5 6时或2 3天投喂上述饲料，每次饲料投放量为土鳖虫总重量的8-12% ；E、病虫害预防①在饲养前，将备好的饲养土先经阳光曝晒消毒；将曝晒消毒好的饲养土在未放入饲养槽之前，用消毒液匀喷洒饲养土，经I周后将饲养土放进饲养槽饲养土鳖虫；饲养期间每隔20 30天更换I次饲养土，长期保持饲养土清洁无霉败；②严格控制饲料不带螨类入池，饲料先用微火炒熟杀灭螨类；③注意饲养槽清洁卫生，及时除去坏死卵鞘和死虫，喂料不过量。在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，所述的富硒酵母为啤酒酵母；所述的阻挡体由玻璃制成；所述的饲料还包括磷酸氢钙、大麦、油下脚料、鱼粉、玉米、米糠和南瓜和青饲料中的任意一种或多种。这里的青饲料通常为蔬菜等绿叶植物。在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，本饲养方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一种或多种的组合①将饲养槽的剩余饲料连同饲养土表层刮出I. 5 3. Ocm, 清除初发生的螨类用炒熟的糠麸、豆粉诱饵在白天诱除螨类；傍晚取出诱饵灭杀处理； ③在螨类成灾时，彻底更换全部饲养土；先将土鳖虫从饲养土中筛出，移入装有干燥细沙容器中，让土鳖虫在沙中爬行至少半小时,摩擦掉寄生在土鳖虫体上的螨类，同时烧烤饲养槽，烧死饲养槽内残留螨后，再换入经检查无螨的饲养土饲养；④药剂喷治先将饲养槽土鳖虫从饲养土中筛出，取30%三氯杀螨砜用I : 400倍稀释液拌入饲养槽内饲养土，每立方米饲养土用药45-55g。在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，所述的消毒液由下述方式制得取生石灰 O. 5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70分钟，过滤后即得消毒液。
在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，本饲养方法养殖而成的土鳖虫经干燥成药材后包括下述成分粗蛋白含量65-68wt%、Se含量6-80. 5058 μ g/g'Zn含量320-360 μ g/g' 不饱和脂肪酸含量占总脂肪油的73-75wt%、油酸含量占总脂肪油的40-42wt%、亚油酸含量占总脂肪油的21-23wt%。上述富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊。本冻干粉胶囊通过下述方式制得本冻干粉胶囊通过下述方式制得取富硒土鳖虫药材，粉碎并过75-85目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，然后按冻干粉乳糖为75 85 25 15的比例混匀后，直接装胶囊，即得。上述富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫蛋白质水解液。本富硒土鳖虫蛋白质水解液通过下述方式制得①取净制的富硒土鳖虫碾碎，用石油醚在70°C脱脂4h，其中土鳖虫和石油醚的重量比为I : 3，得到经过预处理的土鳖虫备用；②称取经过预处理的土鳖虫，加入缓冲液，固液比为I : 7，pH为5，冷浸过夜，再加胰蛋白酶，且胰蛋白酶与土鳖虫比250U71，在60°C水浴中加热酶解一小时后，灭酶、抽滤、精密吸取滤液，将滤液置于容器中，即得富硒土鳖虫蛋白质水解液。富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的应用或者作为抗氧化药物的应用。与现有的技术相比，本富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉、蛋白质水解液及药用的优点在于易于实施，培养所得的土鳖虫富含人体所需的有益成分，特别是富含硒和锌，药用价值高，用于保护脏器少受自由基的伤害，可预防由衰老引起的多种慢性疾病等症；通过增强机体免疫力，提高抗肿瘤功效。
具体实施例方式一、本富硒土鳖虫饲养方法包括下述内容A、饲养场地建设建立多层饲养槽,每层间隔45cm-55cm,相邻的两饲养槽之间间隔80cm-120cm，在饲养槽内壁进行粉刷，并在饲养槽内壁上缘周边设置防止土鳖虫逃逸的阻挡体，在饲养槽底部铺设10cm-15cm饲养土 ；B、饲养土配制取土后用3mm-5_的筛子过筛，然后掺入草木灰混合均勻后形成饲养土，饲养土的湿度为含水量55% -65% ；C、饲料配制饲料包括下述重量份数的成分干的青饲料28-32wt%、豆饼 28-32wt %、富硒酵母O. 8-1. 2wt %、虾粉4_6wt %，麦麸32_36wt %，然后加入占上述所有成分总重量10-20%的水，并混合均匀；D、放养及放养密度以每一次蜕皮按龄计算，选用9-11龄的雌性土鳖虫在饲养场地进行养殖，放养密度为每平方米I. 5 2万只，每天傍晚5 6时或2 3天投喂上述饲料，每次饲料投放量为土鳖虫总重量的8-12% ；E、病虫害预防①在饲养前，将备好的饲养土先经阳光曝晒消毒；将曝晒消毒好的饲养土在未放入饲养槽之前，用消毒液匀喷洒饲养土，经I周后将饲养土放进饲养槽饲养土鳖虫；饲养期间每隔20 30天更换I次饲养土，长期保持饲养土清洁无霉败；
②严格控制饲料不带螨类入池，饲料先用微火炒熟杀灭螨类；③注意饲养槽清洁卫生，及时除去坏死卵鞘和死虫，喂料不过量。这里的富硒酵母为啤酒酵母；阻挡体由玻璃制成；饲料还包括磷酸氢钙、大麦、油下脚料、鱼粉、玉米、米糠和南瓜和青饲料中的任意一种或多种。本饲养方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一种或多种的组合① 将饲养槽的剩余饲料连同饲养土表层刮出I. 5 3. 0cm，清除初发生的螨类；②用炒熟的糠麸、豆粉诱饵在白天诱除螨类；傍晚取出诱饵灭杀处理在螨类成灾时，彻底更换全部饲养土；先将土鳖虫从饲养土中筛出，移入装有干燥细沙容器中，让土鳖虫在沙中爬行至少半小时,摩擦掉寄生在土鳖虫体上的螨类，同时烧烤饲养槽,烧死饲养槽内残留螨后,再换入经检查无螨的饲养土饲养；④药剂喷治先将饲养槽土鳖虫从饲养土中筛出，取30%三氯杀螨砜用I : 400倍稀释液拌入饲养槽内饲养土,每立方米饲养土用药45-55g。本实施例中的消毒液由下述方式制得取生石灰O. 5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70 分钟，过滤后既得消毒液。通过本饲养方法养殖而成的土鳖虫经干燥成药材后包括下述成分粗蛋白含量 65-68wt%、Se含量6-80. 5058 μ g/g'Zn含量320-360 μ g/g—1、不饱和脂肪酸含量占总脂肪油的73-75wt%、油酸含量占总脂肪油的40-42wt%、亚油酸含量占总脂肪油的21_23wt%。具体实施例如下直接取土，用4_的筛子过筛，掺上适当草木灰即可。土的干湿度都要求含水量在60%左右(“手捏成团，轻按即散”)。饲养土厚度10-15cm，每隔1-2周可用细筛将饲养土过筛一遍，去掉食物残渣消毒后即可再次使用。根据土鳖虫生长过程中能量消耗需求，确定基础饲料配方(每IOOg干饲料为单位)干的青饲料(蔬菜叶)30g、豆饼30g、富硒酵母lg、奸粉5g、麦麸34g。加水10-20ml,拌勻,用手抓成团,松手即散为适宜。 制成块状食料。每kg饲料含硒量20mg，碳氮比均衡在48 50 (产卵期提高到55)，以促进土鳖虫的生长发育。土鳖虫习性昼伏夜出。每天18 24时为活动、吃食高峰期。一次吃食后2 3天潜伏在土中不动，人工饲养需每天傍晚5 6时或2 3天投喂饲料。喂食方法分为三种①把饲料团成小团，分点喂食(适用于幼虫)。②把饲料撒在饲养土表面(适用于中虫)。③用15X 15cm的塑料薄膜做成食台，饲料放在食台上(适用于成虫)。根据实际需要，选择喂食方法。与普通饲养方法相比，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材的水分含量、总灰分、酸不溶性灰分、水浸出物含量没有很大差异，符合《中国药典》中土鳖虫质量检查项规定，但两者在粗蛋白含量有所差异。普通饲养方法获得的土鳖虫药材粗蛋白含量约为61. 69%，而本发明饲养方法获得的土鳖虫药材的粗蛋白含量为67. 19%，可见本发明饲养方法获得的土鳖虫药材营养价值略高于普通饲养方法获得的土鳖虫药材。元素的测定结果看，两者均含有丰富的微量元素且存在明显的差异。其中Fe、Zn、Mn、Cu、Mg为两者主要的微量元素。这些元素对人体有直接的影响作用，并参与许多新陈代谢的过程。此外，两者尚含有Pb、As、Hg 等重金属元素。参照药用植物及制剂外经贸绿色行业标准(WM/T2-2004)，有害重金属Pb、 As、Hg的含量符合标准。更为重要的是本发明饲养方法获得的土鳖虫药材中尚含有较高的Zn、Cu、Se等元素。Zn对生物体内的免疫功能起调节作用，并能通过酶系统发挥对机体代谢的调节和控制，硒具有延缓衰老、抑癌抗癌、抗辐射等作用。肿瘤病人血清铜/锌比值升高，血清铜、硒含量显著下降，肿瘤患者免疫功能下降与缺锌有关，补锌可调节肿瘤患者免疫功能，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材Zn、Se等微量元素含量明显升高，可能与其抑制肝癌、胃癌等癌细胞的功能有一定的相关性。经本发明人试验分析普通饲养土鳖虫药材饱和脂肪酸占25 %，不饱和脂肪酸占72. 11 %;本发明饲养方法获得的土鳖虫药材饱和脂肪酸占23. 37%，不饱和脂肪酸占74. 19%，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材不饱和脂肪酸的含量高于普通饲养土鳖虫药材。不饱和脂肪酸对人体有降血压、降血脂、抗血栓、抗动脉硬化、预防心血管病、增强记忆力、预防老年痴呆、防癌等多种功效。表1-1 :本实施例中普通饲养方法与本发明饲养方法获得的土鳖虫药材微量元素
测定结果
元素含量/pg.g-1 As Cd Cu Fe Hg Mn Mg Pb SeZn
普通饲养方法 1.54460.1805 34.804354.960.7322 54.774 1947.8 1.50450.7623205.20
本发明饲养方
0.50580.1618 37.507 449.62 0.5159 62.0472096.93.6106 7.1212 347.30
) _表1-2 :本发明饲养方法获得的土鳖虫药材脂肪酸含量
相对
编保留时间
化合物分子式含量
号/min/%I5.830豆蔻酸CH3(CH2)12COOH1.6726.890十六烷酸(棕榈酸)CH3(CH2)uCOOH21.7036.9439-十六碳烯酸(棕榈烯酸)C6H13CH=CH C7HmCOOH9.8647.8719-十八碳烯酸(油酸)C8H17CH=CH C7H ,I4cooh40.7857.9649,12-十八碳二烯酸(亚油酸)CsH1iCH=CHCH2CH=CH C7H mCOOH21.8668J039,12,15-十八碳三烯酸(亚麻酸)C2H5CH = CHCH2CH = C H CH2CH=CHC7H uCOOH1.69共鉴定出6种化合物，占总量的97. 56%，其中饱和脂肪酸占23. 37%，不饱和脂肪酸占 74. 19%。普通饲养方法获得的土鳖虫药材分离出的油酸含量为38. 84%，亚油酸含量为 22. 10%。本发明饲养方法获得的土鳖虫药材分离出的油酸的含量为40. 78%，亚油酸含量为21. 86%，油酸、亚油酸是人体的必需脂肪酸，是组织细胞的组成成分，它在体内参与磷脂的合成，并以磷脂的形式存在于线粒体和细胞膜中。必需脂肪酸还可以保护皮肤免受射线损伤，可降低血中胆固醇，防止动脉粥样硬化及减小血小板豁附性作用；缺乏必需脂肪酸会出现皮炎，抵抗力减弱，生长停滞。综合上述分析，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材的营养价值较高，相较于普通饲养方法获得的土鳖虫药材具有较大的开发利用潜力。
二、富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊。本冻干粉胶囊通过下述方式制得取富硒土鳖虫药材，粉碎并过75-85目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，然后按冻干粉乳糖为75 85 25 15 的比例混匀后，直接装胶囊，即得。更具体地说，将养成的土鳖虫用20目筛过滤，去除泥土和食物残渣，90-100°C沸水烫死后，迅速捞出，流冲洗3次以上，去除附着在虫体表面的沙土，浙干。挑选大小均一， 个体饱满，无病害的土鳖虫个体，置-10至-20°冰箱预冷冻12h以上。将冻干箱-40°预冷冻I至2h，再将样品置于冻干箱中冷冻2至4h，使水分充分冻结。冷阱温度达到_50°C左右，设定真空冷冻干燥机的各种参数，进行真空冷冻干燥。冷冻干燥分两个阶段，冻干开始时，隔板不加热，通过外界辐射为升华过程提供热量，冻干IOh左右；升华干燥阶段基本完结后，进入解析干燥阶段，启动加热程序，使隔板温度达到40°C，当物料中心温度接近加热温度时，结束冻干操作。将冻干药材置中药粉碎机粉碎，过80目筛，即得土鳖虫冻干粉。间歇低温灭菌是指将土鳖虫冻干粉置流通蒸汽灭菌器或灭菌蒸锅内，平铺厚度不超过1cm， 加热至70-80°C后维持60min，将其中的细菌繁殖体杀死，取出置恒温培养箱37°C培养24h， 让其中的芽胞发育成为繁殖体，再次同法灭菌，共加热灭菌3次。将灭菌后的冻干粉置恒温干燥箱中，平铺厚度不超过1cm，60-70°C干燥，至水分含量小于8%，分装。整个操作在无菌环境中完成。辅料的筛选辅料对制剂成型有着举足轻重的作用，它直接影响着制剂的质量优劣。恰当的辅料方可制出外观良好、质量稳定、释放性能好、患者容易接受的制剂。中药制剂常用的辅料有淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、羟丙甲纤维素(HPMC)、微晶纤维素(MC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，但山梨醇、PVP、HPMC等价格较贵，病人难以承受这种高消费的药品，所以拟选用淀粉、糊精、微晶纤维素和乳糖、蔗糖等作为辅料进行筛选，得最佳辅料种类及用量。经本发明人试验，淀粉、糊精对土鳖虫冻干粉的吸湿性无明显改善；而微晶纤维素虽然能明显改善其的吸湿性，但价格昂贵；蔗糖的吸湿速率和平衡吸湿率均较小，但却显著增加了平衡吸湿的时间，并且蔗糖长时间在空气中易出现变硬结块，导致药材的流动性减低，有效成分活性下降，甚至产生霉变现象；而乳糖能够显著减缓土鳖虫冻干粉的吸湿速率，减少平衡吸湿时间和平衡吸湿率，且吸湿后能够保持土鳖虫冻干粉的固体粉末状，休止角也较小，且吸湿性和流动性均明显优于其它辅料，可考虑作为土鳖虫冻干粉胶囊的单一辅料的最佳选择。添加乳糖辅料后土鳖虫冻干粉的吸湿性随着辅料所占比例的的增加而显著降低。 分别以吸湿加速度和平衡吸湿率为考察指标，吸湿拟合曲线的可靠性得到进一步验证。同时土鳖虫冻干粉中加入20%的乳糖辅料的吸湿率较低，且不同比例乳糖和土鳖虫冻干粉混合所制粉末的外观变化也不大，吸湿后仍能保持其粉末状，休止角小于40°，可以满足生产过程中流动性的需求。根据吸湿效果和生产成本综合考虑土鳖虫冻干粉中加入20%的乳糖辅料较为适宜。因此，取富硒土鳖虫药材，粉碎，过80目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，按冻干粉乳糖为80 20的比例加入乳糖，混匀后，直接装胶囊，即得。功能主治抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力。用于保护脏器少受自由基的伤害，可预防由衰老引起的多种慢性疾病等症；通过增强机体免疫力，提高抗肿瘤功效。用法用量口服，一次3粒，一日2次。土鳖虫冻干粉与乳糖(80 20)所制土鳖虫冻干粉胶囊，其粉末混合均匀、流动性佳、质量稳定，且其吸湿率远低于药典规定的9%的限度，因此根据吸湿效果和生产成本，考虑土鳖虫冻干粉中加入20%的乳糖辅料较为适宜。土鳖虫冻干粉胶囊的成型工艺取富硒土鳖虫药材，粉碎，过80目筛，冷冻干燥后，紫外灭菌，得土鳖虫冻干粉粉末，按冻干粉乳糖=80 20的比例加入乳糖，混匀后， 直接装胶囊，即得。经测定，土鳖虫冻干粉胶囊粉末的临界相对湿度约为67%，结果表明 土鳖虫冻干粉胶囊生产和贮存环境的相对湿度应控制在RH < 70%，药材不容易吸湿。富硒土鳖虫冻干粉胶囊急性毒性试验研究。急性毒性试验是测试新药对人体毒性强弱的一种重要手段，且可为长期毒性试验、生殖毒性试验和致突变试验等试验设计提供剂量选择依据和有关毒性信息，因此急性毒性试验对药物开发和应用是非常必要的。为了对富硒土鳖虫冻干粉胶囊的安全性作出评价，根据卫生部药政管理局《中药新药研究指南》，本研究对小鼠灌胃给予富硒土鳖虫冻干粉胶囊的急性毒性进行评价，以期为富硒土鳖虫冻干粉胶囊临床安全用药提供依据。现将研究结果报告如下。①实验动物昆明种小鼠，140只，雄雌各半，体重20±2g，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供，清洁级。动物合格证号SCXK (沪)2007-0005。 实验前适应环境饲养I晚上，自由摄食、饮水，室内温度18°C _28°C，相对湿度45% -60%。②实验药品与试剂富硒土鳖虫冻干粉胶囊(由浙江中医药大学制剂室提供，批号080701)，所用试剂均为分析纯。③实验方法a、半数致死量(LD50)的测定预试验取昆明种小鼠50只，体重20±2g，实验随机分为5组，分别为 8. OOOg · kg'6. OOOg · kg'4. 500g · kg'3. 375g · kg—1 和 2. 531g · kg—1 剂量组，各剂量组间间距为O. 75。小鼠按剂量分别一次性灌胃给予富硒土鳖虫冻干粉胶囊，给药前禁食不禁水12h。在给药后的24h内，根据《中药、天然药物毒性研究技术指导原则》的毒性反应指标多次观察小鼠的毒性反应和死亡情况，以后每天观察一次，连续观察7天，记录小鼠毒性反应及死亡数量，找出引起小鼠0%和100%死亡率剂量所在的范围。b、正式试验在预试验所获得的0%和100%的致死量范围内，确定组间的比值。 取昆明小鼠50只，体重20±2g，随机分为5组。各组小鼠按剂量分别一次性灌胃给药，给药前禁食不禁水12h。连续观察7天，记录动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。对濒死及死亡动物应及时进行尸体解剖，其他动物在观察期结束后进行尸体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查，根据检查结果初步判断可能的毒性靶器官。实验完毕后，清点各组死亡鼠数，算出死亡率，按改良寇氏法公式进行计算LD5tl = log-1 [Xm-i ( Σ P-0. 5)]Xffl :最大剂量组剂量的对数值i :相邻两组比值的对数(相邻两组对数剂量的差
值)
权利要求
1.一种富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法包括下述内容A、饲养场地建设建立多层饲养槽,每层间隔45cm-55cm,相邻的两饲养槽之间间隔 80cm-120cm，在饲养槽内壁进行粉刷，并在饲养槽内壁上缘周边设置防止土鳖虫逃逸的阻挡体，在饲养槽底部铺设10cm-15cm饲养土 ；B、饲养土配制取土后用的筛子过筛,然后掺入草木灰混合均勻后形成饲养土，饲养土的湿度为含水量55% -65% ；C、饲料配制饲料包括下述重量份数的成分干的青饲料28-32wt%、豆饼28-32wt%、 富硒酵母O. 8-1. 2wt %、虾粉4-6wt %，麦麸32-36wt %，然后加入占上述所有成分总重量 10-20%的水，并混合均匀；D、放养及放养密度以每一次蜕皮按龄计算，选用9-11龄的雌性土鳖虫在饲养场地进行养殖，放养密度为每平方米I. 5 2万只，每天傍晚5 6时或2 3天投喂上述饲料， 每次饲料投放量为土鳖虫总重量的8-12% ；E、病虫害预防①在饲养前，将备好的饲养土先经阳光曝晒消毒；将曝晒消毒好的饲养土在未放入饲养槽之前，用消毒液匀喷洒饲养土，经I周后将饲养土放进饲养槽饲养土鳖虫；饲养期间每隔20 30天更换I次饲养土，长期保持饲养土清洁无霉败；②严格控制饲料不带螨类入池，饲料先用微火炒熟杀灭螨类；③注意饲养槽清洁卫生，及时除去坏死卵鞘和死虫，喂料不过量。
2.根据权利要求I所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，所述的富硒酵母为啤酒酵母；所述的阻挡体由玻璃制成；所述的饲料还包括磷酸氢钙、大麦、油下脚料、鱼粉、玉米、米糠和南瓜和青饲料中的任意一种或多种。
3.根据权利要求I或2所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一种或多种的组合①将饲养槽的剩余饲料连同饲养土表层刮出I. 5 3. 0cm，清除初发生的螨类用炒熟的糠麸、豆粉诱饵在白天诱除螨类；傍晚取出诱饵灭杀处理在螨类成灾时，彻底更换全部饲养土 ；先将土鳖虫从饲养土中筛出，移入装有干燥细沙容器中，让土鳖虫在沙中爬行至少半小时，摩擦掉寄生在土鳖虫体上的螨类，同时烧烤饲养槽，烧死饲养槽内残留螨后，再换入经检查无螨的饲养土饲养;④药剂喷治先将饲养槽土鳖虫从饲养土中筛出，取30%三氯杀螨砜用I : 400倍稀释液拌入饲养槽内饲养土，每立方米饲养土用药45-55g。
4.根据权利要求I或2所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，所述的消毒液由下述方式制得取生石灰O. 5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70分钟，过滤后即得消毒液。
5.根据权利要求I或2所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法养殖而成的土鳖虫经干燥成药材后包括下述成分粗蛋白含量65-68wt%、Se含量6-80. 5058 μ g/ g' Zn含量320-360 μ g/V1、不饱和脂肪酸含量占总脂肪油的73-75wt%、油酸含量占总脂肪油的40-42wt%、亚油酸含量占总脂肪油的21-23wt%。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊。
7.根据权利要求6所述的富硒土鳖虫冻干粉胶囊，其特征在于，本冻干粉胶囊通过述方式制得取富硒土鳖虫药材，粉碎并过75-85目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，然后按冻干粉乳糖为75 85 25 15的比例混匀后，直接装胶囊，即得。
8.根据权利要求I 5中任意一项所述的富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫蛋白质水解液。
9.根据权利要求8所述的富硒土鳖虫蛋白质水解液，其特征在于，本富硒土鳖虫蛋白质水解液通过下述方式制得①取净制的富硒土鳖虫碾碎，用石油醚在70°C脱脂4h，其中土鳖虫和石油醚的重量比为I : 3，得到经过预处理的土鳖虫备用称取经过预处理的土鳖虫，加入缓冲液，固液比为I : 7，pH为5，冷浸过夜，再加胰蛋白酶，且胰蛋白酶与土鳖虫比250U μ—1，在60°C水浴中加热酶解一小时后，灭酶、抽滤、精密吸取滤液，将滤液置于容器中，即得富硒土鳖虫蛋白质水解液。
10.根据权利要求I 5中任意一项所述的富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的应用或者作为抗氧化药物的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉胶囊、蛋白质水解液及药用。它解决了技术药用效果不佳等技术问题。饲养方法包括下述内容A、饲养场地建设；B、饲养土配制；C、饲料配制；D、放养密度；E、病虫害预防。上述富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊、富硒土鳖虫蛋白质水解液。本富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉、蛋白质水解液及药用的优点在于易于实施，培养所得的土鳖虫富含人体所需的有益成分，特别是富含硒和锌，药用价值高。
文档编号A01K67/02GK102578030SQ201210020780
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者严云良, 余陈欢, 吴巧凤, 宋宵宏, 楼小红 申请人:浙江中医药大学