专利名称：一种短芽孢杆菌及其在促进松树生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及ー种短芽孢杆菌及其在促进马尾松生长中的应用。
背景技术：
外生菌根真菌(Ectomycorrhizal Fungi, EMF)作为菌根真菌中的重要类群已被证实对植物有良好的促生抗病作用；同时外生菌根真菌作为微生物肥料的应用也不会引起环境污染，有良好的环境友好性。植物促生根圈细菌(Plant Growth PromotingRhizobacteria, PGPR)是根际微生态系统中对植物有良性作用的细菌类群，PGPR可以单独作用于植物并对植物表现出良好的促生和抗病作用。它与外生菌根真菌的相互作用具有重要的研究价值，近年来日益成为根圈微生物互作关系研究領域的热点，大量研究表明，EMF与PGPR协同作用对宿主植物的生长和营养吸收具有积极意义。因此，深入探究EMF与PGPR 的互作关系，将有助于更好地了解和利用根际有益微生物，对提高林木产量，维持农林生态系统的稳定都具有重要的意义。菌根辅助细菌(Mycorrhiza bacteria,MHB)是一类特殊的PGPR。MHB与EMF的作用关系十分密切，两者协同作用对植物的生长具有积极作用。研究表明，MHB有以下几种作用机理①MHB提高了根系对菌根侵染的感受性MHB改善了根际土壤的物理微环境，从而有利于植物的生长MHB起到根系与菌根真菌相互识别的媒介作用MHB能够促进真菌孢子的萌发MHB能够促进菌根真菌的生长； MHB通过与EMF协同作用，促进植物 对养分的吸收 ’⑦MHB依靠其定殖和竞争优势，改变土壤微生物环境，抑制土壤病原菌的生长，同时可以提高植物的系统抗病性。其中MHB对菌根真菌生长的促进被认为是最直接、最重要的作用。虽然国外已有大量关于EMF与MHB互作的研究报道，但国内关于其互作关系的研究还是鲜有报道。马尾松(Pinas massoniana)是我国南方主要的速生用材树种之一,是荒山造林的先鋒树种，也是我国农林生态系统的重要组成树种。其经济价值高，用途广，松木是エ农业生产上的重要用材。马尾松的生长对菌根真菌依赖性很强，是典型的外生菌根营养型树种，在贫瘠地种植马尾松，常由于土壤贫瘠而造成马尾松生长不良，所以利用菌根辅助细菌促进外生菌根真菌的生长，进而促进马尾松的生长显得至关重要。目前，有关马尾松菌根辅助细菌的筛选及应用研究还未见报道。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)。另一目的是提供上述短芽孢杆菌的用途。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种短芽抱杆菌，其分类命名为短芽抱杆菌MPtl7 Brevibacillus reuszeriMPtl7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2011433，保藏日期2011年12月I日。保藏单位的地址中国武汉武汉大学。上述的短芽孢杆菌在促进外生菌根真菌彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius,Pt2)生长中的应用。上述的短芽孢杆菌在促进外生菌根真菌红绒盖牛肝菌(Xerocamuschrysenteron, Xe)生长中的应用。上述的短芽孢杆菌与彩色豆马勃或红绒盖牛肝菌双接种在促进马尾松苗生长中的应用。短芽孢杆菌MPtl7，是从江苏省林科院30 40年生马尾松林中的外生菌根真菌彩色豆马勃子实体的菌根根际土壤中筛选获得的，能高效促进外生菌根真菌彩色豆马勃(Pt2)和红绒盖牛肝菌(Xe)的生长。MPtl7菌株主要生物学特征在KMB培养基平板上，菌落较小，顔色米黄色，圆形、边缘整齐；菌体短杆状，革兰氏染色阳性，有芽抱。MPt17菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No. I所示。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明,MPtl7菌株与Brevibacillus reuszi的相似度为99%。结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszi)。MPtl7菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂与彩色豆马勃或红绒盖牛肝菌双接种明显促进了马尾松苗的生长。有益效果本发明的短芽孢杆菌MPtl7具有的优势包括能够明显促进外生菌根真菌彩色豆马勃(Pt2)和红绒盖牛肝菌(Xe)的生长，并通过温室盆栽试验证实，MPtl7与彩色豆马勃或红绒盖牛肝菌双接种能明显促进马尾松苗的生长发育。因此，本发明的短芽孢杆菌MPtl7能为开发马尾松促生细菌肥料提供优良的菌株资源，并具有较好的应用开发前景。
图I是MPtl7菌株对外生菌根真菌彩色豆马勃(Pt2)菌丝生长影响的结果图；图中，左图为CK，右图为MPtl7 ；图2是MPtl7菌株胞外代谢产物对彩色豆马勃(Pt2)菌丝生长影响的结果图，图中，左图为CK，右图为MPtl7 ；图3是MPtl7菌株胞外代谢产物对彩色豆马勃(Pt2)菌丝生物量影响的结果图；图4是MPtl7菌株与彩色豆马勃(Pt2)双接种对马尾松苗生长影响的结果图；图5是MPtl7菌株对外生菌根真菌红绒盖牛肝菌(Xe)菌丝生长影响的结果图；图中，左图为CK，右图为MPtl7 ；图6是MPtl7菌株胞外代谢产物对红绒盖牛肝菌(Xe)菌丝生长影响的结果图；图中，左图为CK，右图为MPtl7 ；图7是MPtl7菌株胞外代谢产物对红绒盖牛肝菌(Xe)菌丝生物量影响的结果图；图8是MPtl7菌株与外生菌根真菌红绒盖牛肝菌(Xe)双接种对马尾松苗生长影响的结果图。
具体实施方式
、
下面结合具体实施例对本发明做进ー步的解释。在以下实施例中，KMB培养基的配方为蛋白胨20g，K2HPO4 I. 5g, MgSO4. 7H201.5g，甘油10g，琼脂20g，水1000mL，pH 7· O 7· 2。PDA培养基的配方为马铃薯200g，葡萄糖20g,琼脂20g,水IOOOmL,自然pH。Pt2来源为采自云南楚雄松阔混交林。Xe来源为购自东北林业大学。实施例I菌根辅助细菌MPtl7对外生菌根真菌彩色豆马勃(Pt2)的促生效应取保存的MPt17菌株，在KMB培养基中，28°C，活化2 3d后，用接种环取少量接种 于装有50mL KMB液体培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min震荡培养72h。将菌悬液倒入灭菌的离心管中，4°C,5000r/min离心5min,倒去上清液,再用生理盐水润洗菌体两次，最后根据离心管内菌体的数量适量加入生理盐水，混匀后即为菌体悬浊液(0D_ = I. 5 2)。采用干皿对抗(Dunstan et al，1998)法进行试验。将彩色豆马勃(Pt2)培养于PDA培养基，250C，培养7-12d，用直径为7mm的打孔器在培养皿边缘打孔，取厚度(约5mm)基本一致的菌块作为材料。将彩色豆马勃(Pt2)菌块倒置放入灭菌的空培养皿中，每皿接种三块，三角状放置，再用无菌移液器吸取25uL菌体悬浊液，滴加于各个真菌菌块上，每个细菌菌株设六个重复，以滴加生理盐水的作为对照，置于25°C培养箱中培养。每隔6d添加25uL的葡萄糖溶液，防止菌块干燥。待菌块生长10 12d后，观察各个菌块的菌丝生长情况。结果如表I和图I所示，可以看出，MPtl7菌株对外生菌根真菌彩色豆马勃(Pt2)菌丝的生长有很好的促进作用，与对照相比，菌丝长度增长率为48. 6%。表1MPU7对彩色豆马勃(Pt2)菌丝生长的影响
细菌菌株外生菌根真菌菌丝长度
平均值(cm)增长率(％)
MPtl 72.14 ± 0.09b48.6%
CK1.44 ± O. IOa—注P<0.05。实施例2菌根辅助细菌MPtl7胞外代谢产物对外生菌根真菌彩色豆马勃(Pt2)菌丝生长的影响将MPtl7活化后(方法同实施例I)，用接种环取少量接种与装有50mL KMB液体培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min震荡培养72h。将菌悬液倒入灭菌的离心管中，4°C,5000r/min离心5min，用无菌注射器吸取上清液，经细菌过滤器(滤膜孔径为O. 22um)过滤后得无菌滤液。将ImL无菌滤液与45°C，20mL PDA混合倒平板，以无菌水处理作为对照。将彩色豆马勃(Pt2)菌块接种于培养皿中央，每处理三个重复，置于25°C恒温培养。培养10 12d后观测其菌落半径。结果如表2和图2所示，可以看出，MPtl7胞外代谢产物对外生菌根真菌彩色豆马勃(Pt2)菌丝的生长有明显的促进作用，与对照相比，菌落直径增长率为129. 6%。表2MPtl7胞外代谢产物对彩色豆马勃(Pt2)菌丝生长的影响
权利要求
1.一种短芽孢杆菌，其分类命名为短芽孢杆菌(iireriAaciBiAs reuszeri)MPtl7,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2011433，保藏日期2011年12月I曰。
2.权利要求I所述的短芽孢杆菌在促进外生菌根真菌彩色豆马勃か《tinctorius, Pt2)生长中的应用。
3.权利要求I所述的短芽孢杆菌在促进外生菌根真菌红绒盖牛肝菌CferocaffiMchrysenteron, Xe)生长中的应用。
4.权利要求I所述的短芽孢杆菌与彩色豆马勃或红绒盖牛肝菌双接种在促进马尾松苗生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种短芽孢杆菌，其分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillusreuszeri)MPt17，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM2011433，保藏日期2011年12月1日。本发明的短芽孢杆菌MPt17具有的优势包括能够明显促进外生菌根真菌彩色豆马勃Pisolithustinctorius和红绒盖牛肝菌Xerocamuschrysenteron的生长，并通过温室盆栽试验证实，双接种菌根辅助细菌MPt17与彩色豆马勃或红绒盖牛肝菌能明显促进马尾松苗的生长发育。因此，本发明的短芽孢杆菌MPt17能为开发马尾松促生菌肥提供优良的菌株资源，具有较好的应用开发前景。
文档编号A01N63/02GK102732446SQ201210111439
公开日2012年10月17日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者叶建仁, 吴小芹, 李倩 申请人:南京林业大学