专利名称：一种抗香蕉枯萎病发酵液及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及ー种抗香蕉枯萎病发酵液及其制备方法和应用。
背景技术：
香蕉枯萎病是由尖胞铼刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporium f. sp.cubense, F0C)病原真菌引起的毁灭性土传病害，自1874年首次在澳大利亚发现以来，曾于1896年在巴拿马造成大面积危害，之后逐渐传至世界各地，是至今无法解决的世界科技难题。目前，在我国广东、海南、广西、云南和福建 等香蕉主产区，香蕉枯萎病是由FOC的4号生理小种引起的，发病蕉园发病率一般在30-50%，重病区可达90%以上，导致香蕉减产、甚至绝收，是香蕉生产上的ー个主要限制因子。迄今对该香蕉枯萎病尚无理想的抗病品种和化学药剂，因此，结合栽培措施，施用对该病具有拮抗效果的微生物发酵液，从而抑制土壌香蕉枯萎病数量，改变土壌的微生物生态结构，促进香蕉生长，提高香蕉广谱抗病性，成为ー种理想的生物防治措施。目前，关于单ー菌株在植物生物防治上的应用报道很多，而含有多种香蕉枯萎病拮抗菌的复合发酵液及发酵エ艺鲜有报道。单ー菌株在室内及盆栽时效果较好，但在大田应用中往往效果不显著。人们普遍的研究方法是先获得拮抗菌株然后再对拮抗菌株进行固态或者液态发酵，这种单ー的菌株发酵，受到有益微生物数量少，繁殖系数低，发酵条件复杂等因素的制约，最终导致其在大田应用的效果不显著。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种抗香蕉枯萎病发酵液，该发酵液中含大量拮抗微生物，对香蕉枯萎病具有显著的控制作用，并且该发酵液的培养基质来源方便，成本低廉。本发明的第二个目的在于提供上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法，该制备方法エ艺简单。本发明的最后ー个目的在于提供上述抗香蕉枯萎病发酵液在制备具有抗香蕉枯萎病作用的药物中的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种抗香蕉枯萎病发酵液，含以下重量份的培养基质饼肥、红糖和水，其中饼肥和红糖的总重量与水的总重量比为1:4，培养基质的(/^比为15 25 :1。本发明所述饼肥优选为豆柏、花生饼和菜籽饼中的ー种或几种。本发明的第二个发明目的是通过如下技术方案来实现的上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法，含以下步骤(I)将红糖溶于水中得红糖水，将饼肥置于可透气性包装体内并将置于可透气性包装体内的饼肥置于红糖水中或直接将饼肥溶于红糖水中，调节PH值为6 8，置于阴凉通风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；(2)将含饼肥的红糖水溶液在25 30°C条件下发酵7 15天，每天早晚各搅拌含饼肥的红糖水溶液5 10分钟，直至完成发酵过程，得红褐色溶液，过滤即得含多种微生物的抗香蕉枯萎病发酵液。在上述步骤中本发明步骤(I)中所述饼肥优选为豆柏、花生饼和菜籽饼中的ー种或几种。本发明步骤(I)中所述的可透气性包装体为纱布袋或编织袋。根据需要使用的发酵液的用量来确定是直接 将饼肥溶于红糖水中还是先将饼肥置于可透气性包装体中，再将可透气性包装体置于红糖水中，如发酵液用量较少时，可以直接将饼肥溶于红糖水中，若用于大面积蕉园吋，则先将饼肥置于可透气性包装体中，再将包装体置于红糖水中。本发明中的营养基质通过发酵，获得含大量拮抗微生物的发酵液，这种发酵方法得到微生物的原理主要为有机质与红糖发酵过程本身产生，经常规分离筛选鉴定发现，其产生的微生物均为植株促生微生物或拮抗微生物(尖孢铼刀菌)，主要种类有苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及施氏假单孢菌属、耐寒短杆菌属等，易于繁殖定植，克服了单ー菌株发酵有益微生物数量少，繁殖系数低，发酵条件复杂等因素制约的缺陷。本发明抗香蕉枯萎病发酵液的使用方法可以參考如下将发酵液以每株香蕉l(Tl5ml，稀释5(T100倍液对香蕉进行喷施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，在发酵完成后，过滤后的滤渣还可以使用，包装体内剰余的发酵过的饼肥中含有丰富的有机质，也可以再次使用，具体使用过程參考如下将过滤后的滤渣以及袋中剩余的有机质按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根围，可以为植株提供有机质营养，促进植株生长，增强植株抗性。本发明的最后ー个目的是通过如下技术方案来实现的上述抗香蕉枯萎病发酵液在制备具有抗香蕉枯萎病的药物中的应用。本发明具有如下优点(I)本发明抗香蕉枯萎病发酵液采用的营养基质原料来源方便，价格低廉；(2)本发明制备获得的抗香蕉枯萎病发酵液可随喷灌或滴灌设施施入，省时、省ェ；(3)本发明制备获得的抗香蕉枯萎病发酵液浓度适中，是复合20余株香蕉枯萎病拮抗菌发酵液，实施例9中的实验结果表明，在已经严重发病(当季发病率30%以上)的地块，香蕉枯萎病发病率可控制在10%以下，如果连年施用，可以起到改良土壌，控制香蕉枯萎病的发生的作用；(4)本发明以发酵液发酵后的抑菌活性高低为标准，综合降低成本、节约能源、简化工艺、提高效率等因素，筛选出优化的基质红糖中C/N、发酵条件和发酵方法；(5)本发明中的抗香蕉枯萎病发酵液中含丰富有机质和氨基酸，能够促进香蕉生长，健壮植株，结合所含拮抗微生物的多种生防作用，从而达到防治香蕉枯萎病的效果；(6)本发明中的抗香蕉枯萎病发酵液还可以起到改良土壌、改善土壤理化性质、增强土壤肥力的作用，特别是多年连续施用效果更佳。
图I是实施例I中制备获得的发酵液中分离到的多株拮抗菌；图2是实施例8中的盆栽防控效果；图3是实施例9中的大田试验效果图，其中左侧为对照处理，右侧为发酵液处理。具体实施实例实施例I 本实施例提供的抗香蕉枯萎病发酵液，根据豆柏本身的C/N比以及红糖的含碳量，豆柏的含氮量，调节培养基质的C/N为15:1，饼肥和红糖的总重量与水的重量比为I :4，计算后得出豆柏105g，红糖145g，水1000mL。上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法如下(I)将红糖溶于IOOOmL水中，将豆柏溶于红糖水中，调节红糖水的pH值为7. 0，置于阴凉通风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；(2)将含饼肥的红糖水溶液每天早晩各搅拌5 10分钟，其余时间调节温度许为29±1°C密封发酵15天，过滤得红褐色溶液剂为发酵完成的发酵液。发酵液中微生物的分离与计数采用平板稀释涂布法，采用平板稀释涂布法，稀释度(KT1 1(T3)，采用PDA培养基对真菌的进行分离；LB培养基对细菌的进行分离；高氏一号培养基对放线菌的进行分离，分离前加入质量百分含量为3%重铬酸钾抑制细菌、真菌的生长。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液100 y L，滴加于培养基平板上，用L型玻棒涂布均匀，稍晾干，倒置培养皿，于25 28°C温箱中培养3天，根据平板上长出的菌落的顔色、形态、大小等，将不同的真菌、细菌和放线菌的单菌落挑出到培养基(真菌为PDA培养基，细菌为LB培养基、放线菌为高氏一号培养基)上纯化培养，采用平板对峙培养法初筛拮抗菌株，初筛共获得23株，(见图I)采用稀释涂布法检测计数发酵液中活菌数为4. 88X 108CFU/mL菌液。本实施例发酵方法得到微生物的原理主要为有机质与红糖发酵过程本身产生，微生物来源简单，经分离筛选鉴定实验，其产生的微生物均为植株促生微生物或拮抗微生物(尖孢铼刀菌)主要种类有苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及施氏假单孢菌属、耐寒短杆菌属等，易于繁殖定植，克服了单ー菌株发酵有益微生物数量少，繁殖系数低，发酵条件复杂等因素制约的缺陷。可以将抗香蕉枯萎病发酵液以姆株香蕉10 15mL,稀释50 100倍液对香蕉进行喷施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，将过滤后的滤渣以及袋中剰余的有机质按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根围，可以为植株提供有机质营养，促进植株生长，增强植株抗性。实施例2本实施例提供的抗香蕉枯萎病发酵液，根据花生饼本身的C/N比，以及红糖的含碳量，花生饼的含氮量，调节培养基质的C/N为20:1，并使饼肥与红糖的总重量与水的重量比为I :4，计算后得出花生饼88g，红糖162g，水IOOOmL0上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法如下(I)将红糖溶于IOOOmL水中，将花生饼装入纱布袋后，将装有花生饼的纱布袋溶于红糖水中或者直接将饼肥溶于红糖水中(视发酵的总液量多少而定，一般发酵溶液较少时可以直接将饼肥溶于红糖，若用于大面积蕉园的发酵液可以采用前ー种方法)，调节红糖水的PH值为7. O，置于阴凉透风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；(2)将含饼肥的红糖水溶液每天早晩各搅拌5 10分钟，其余在常温条件下(28 30°C)密封发酵15天，过滤得红褐色溶液剂为发酵完成的发酵液。发酵液中微生物的分离与计数方法同实施例I，采用稀释涂布法检测计数发现，发酵液中菌量为4. 61 X 107CFU/mL以上。 可以将抗香蕉枯萎病发酵液以姆株香蕉10 15mL,稀释50 100倍液对香蕉进行喷施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，将过滤后的滤渣以及袋中剰余的有机质按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根围，可以为植株提供有机质营养，促进植株生长，增强植株抗性。实施例3本实施例提供的抗香蕉枯萎病发酵液，根据菜籽饼本身的C/N比，以及红糖的含碳量，菜籽饼的含氮量，采用常规方法调节培养基质的C/N为25:1，并使饼肥与红糖的总重量与水的重量比为I :4，计算得出菜籽饼95g，红糖155g，水1000mL。上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法如下(I)将红糖溶于IOOOmL水中，将菜籽饼溶于红糖水中，调节红糖水的pH值为6. 0，置于阴凉透风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；(2)将含饼肥的红糖水溶液每天早晩各搅拌5 10分钟，其余时间常温条件下(28 30°C)密封发酵15天，过滤得红褐色溶液剂为发酵完成的发酵液。发酵液中微生物的分离与计数方法同实施例I，采用稀释涂布法检测计数发现，发酵液中菌量为I. 28X 108CFU/mL。可以将抗香蕉枯萎病发酵液以姆株香蕉10 15mL,稀释50 100倍液对香蕉进行喷施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，将过滤后的滤渣以及袋中剰余的有机质按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根围，可以为植株提供有机质营养，促进植株生长，增强植株抗性。实施例4本实施例提供的抗香蕉枯萎病发酵液，根据菜籽饼的C/N，以及红糖的含碳量，菜籽饼的含氮量，采用常规方法调节培养基质的C/N为22:1，并使饼肥与红糖的总重量与水的重量比为I :4，计算后得出，菜籽饼108g，红糖142g，水1000mL。上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法如下(I)将红糖溶于IOOOmL水中，将菜籽饼装入纱布袋后，将装有菜籽饼的纱布袋溶于红糖水中，或者直接将饼肥溶于红糖水中(视发酵的总液量多少而定，一般发酵溶液较少时可以直接将饼肥溶于红糖，若用于大面积蕉园的发酵液可以采用前ー种方法)调节红糖水的PH值为7，置于阴凉透风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；(2)将含饼肥的红糖水溶液每天早晩各搅拌5 10分钟，其余时间在常温下(28 30°C)密封发酵15天，过滤得红褐色溶液剂为发酵完成的发酵液。发酵液中微生物的分离与计数方法同实施例I，采用稀释涂布法检测计数发现，发酵液中菌量为3. 53X 107CFU/mL以上。
可以将抗香蕉枯萎病发酵液以姆株香蕉10 15mL,稀释50 100倍液对香蕉进行喷施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，将过滤后的滤渣以及袋中剰余的有机质按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根围，可以为植株提供有机质营养，促进植株生长，增强植株抗性。实施例5本实施例提供的抗香蕉枯萎病发酵液，根据花生饼的C/N,以及红糖的含碳量，花生饼的含氮量，采用常规方法调节培养基质的C/N为22:1，并使饼肥与红糖的总重量与水的重量比为I :4，计算后得出花生饼79g，红糖171 g，水IOOOmL0上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法如下(I)将红糖溶于IOOOml水中，将花生饼装入纱布袋后，将装有花生饼的纱布袋溶于红糖水中，调节红糖水的PH值为7. 0，置于阴凉透风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；(2)将含饼肥的红糖水溶液每天早晩各搅拌5-10分钟，其余时间在常温下(28 30°C)密封发酵15天，过滤得红褐色溶液剂为发酵完成的发酵液。发酵液中微生物的分离与计数方法同实施例I，采用稀释涂布法检测计数发现，发酵液中菌量为3. 66X 107CFU/mL以上。可以将抗香蕉枯萎病发酵液以姆株香蕉10 15mL,稀释50 100倍液对香蕉进行喷施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，将过滤后的滤渣以及袋中剰余的有机质按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根围，可以为植株提供有机质营养，促进植株生长，增强植株抗性。实施例6本实施例提供的抗香蕉枯萎病发酵液，根据豆柏的C/N，以及红糖的含碳量，花生饼的含氮量，采用常规方法调节培养基质的C/N为22:1，并使饼肥与红糖的总重量与水的重量比为1/4，计算后得出豆柏70kg，红糖180kg，水1000L。发酵使用大型发酵罐，将按比例配制好的含饼肥的红糖水溶液置于发酵罐中，调节pH为7.0，调节温度为28°C，搅拌速度为180rpm，通气量彡50 %，发酵7天，即得抗香蕉枯萎病发酵液。上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法以及抗香蕉枯萎病发酵液的使用方法參考实施例I。实施例7发酵液CN比配方的筛选本实例以花生饼为发酵有机质原料，根据花生饼的C/N，以及红糖的含碳量，花生饼的含氮量，采用常规方法调节培养基质的C/N分别为10、15、20、25、30，并使饼肥与红糖的总重量与水的重量比为I :4，按照实例I飞的发酵方法，分别得到了 5种不同CN比的发酵液，采用平板稀释涂布法检测含菌量。将上述5种不同的发酵液进行盆栽防效试验，试验地点中国热带农业科学院热带生物技术研究所温室大棚。试验品种巴西焦，购自中国热带农业科学院种苗组培中心，苗闻20cm左右，生长健壮、五叶一心,无病虫害。
病原菌尖孢铼刀菌古巴专化型4号生理小种Fusarium oxysopoyum f. sp.cubence race 4 (F0C4)，由华南农业大学资源环境学院植物病理系姜子德教授提供。将F0C4接种在PDA培养基上，25°C下恒温培养10d，把孢子洗入无菌水中配成浓度为5 X IO6个/mL孢子悬浮液，供接种用。供试土壤砖红壤，采自海ロ市龙华区。发酵液上述五种不同的发酵液。试验处理处理ー C/N为10:1的发酵液+病原菌处理；处理ニ C/N为15:1的发酵液+病原菌处理；处理三C/N为20:1的发酵液+病原菌处理；处理四C/N为25:1的发酵液+病原菌处理；处理五C/N为30:1的发酵液+病原菌处理；对照为只接种病原菌的处理，每个处理20株蕉苗。试验方法选取大小长势一致的香蕉幼苗，移栽至高10cm、直径12cm的塑料盆中。移栽5天后，按不同处理施入发酵液(稀释50倍)，每盆lOOmL，CK施入等量清水，每隔7天再重复施入发酵液，共施3次。第3次施入发酵液后7天，以伤根接种法接入F0C4。试验期间，各处理盆栽管理措施均一致。病原菌接种后每隔5 d观察蕉苗发病情况，待対照的发病率达到50%以上时调查各处理的病情指数，并计算相对防效。试验结果如表I所示，C/N为15、20、25三个处理的发酵液处理其对枯萎病的相对防效均在42%以上，且含菌量的数量级为107，而C/N为10，30时其相对防效分别为21. 04%，16. 90%，且含菌量的数量级在105。由此得出，发酵液配方中C/N应控制在15 25之间。表I不同发酵液处理对香蕉苗期枯萎病的防治效果与发酵液的含菌量
权利要求
1.一种抗香蕉枯萎病发酵液，其特征是含以下培养基质饼肥、红糖和水，其中饼肥和红糖的总重量与水的总重量比为1:4，培养基质的C/N比为15 25 :1。
2.根据权利要求I所述的抗香蕉枯萎病的发酵液，其特征是所述饼肥为豆柏、花生饼和菜籽饼中的一种或几种。
3.权利要求I或2所述的抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法，其特征是含以下步骤 (1)将红糖溶于水中得红糖水，将饼肥置于可透气性包装体内并将置于可透气性包装体内的饼肥置于红糖水中或直接将饼肥溶于红糖水中，调节PH值为6 8，置于阴凉通风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液； (2)将含饼肥的红糖水溶液在25 30°C条件下发酵7 15天，并不时搅拌保持通气至完成发酵过程，得红褐色溶液，过滤即得含多种微生物的抗香蕉枯萎病发酵液。
4.根据权利要求3所述的抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法，其特征是步骤(I)中所述饼肥为豆柏、花生饼和菜籽饼中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法，其特征是步骤(I)中所述的可透气性包装体为纱布袋或编织袋。
6.权利要求I或2所述的抗香蕉枯萎病发酵液在制备具有抗香蕉枯萎病的药物中的应用。
全文摘要
本发明一种抗香蕉枯萎病发酵液，含以下培养基质饼肥、红糖和水，其中饼肥和红糖的总重量与水的总重量比为1:4，培养基质的C/N比为15~251。该发酵液中含大量拮抗微生物，对香蕉枯萎病具有显著的控制作用，并且该发酵液的培养基质来源方便，成本低廉。还公开了上述抗香蕉枯萎病发酵液的制备方法，该制备方法工艺简单。同时公开了上述抗香蕉枯萎病发酵液在制备具有抗香蕉枯萎病的药物中的应用。
文档编号A01P3/00GK102763685SQ20121024829
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者井涛, 周登博, 张锡炎, 段雅婕, 甘东泉, 赵炎坤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所