专利名称：一种以山葵根为外植体的山葵愈伤组织培养方法
技术领域：
本发明涉及一种山葵植物的组织培养方法，特别是涉及一种以山葵根为外植体的山葵愈伤组织培养方法。
背景技术：
山葵(WasabijaponicaMatsum)又名山箭菜、山菜,为十字花科山箭菜属多年生半阴生草本植物。山葵植物中含有一种芥子苷类的物质，在植物体被磨碎时，该物质在芥子苷酶的作用下水解形成异硫氰酸酯类化合物，其中尤以丙烯基异硫氰酸酯含量最高，约占89% 94% ;另外，山葵植物还含有大量的氨基酸和各种人体需要的微量元素。由于山葵含有丰富 的异硫氰酸酯类化合物和大量的人体需要的氨基酸和微量元素，因此山葵不仅具有强烈的辛辣味和特殊的香辛味，而且还具有免疫调节、抗菌、抗癌、抗氧化、抗血小板聚集等多种作用，是国际上公认的极为稀缺及珍贵的药食同源植物，被称为“绿色黄金”。随着世界各地山葵消费市场的不断扩大，山葵产品供不应求，市场需求量越来越大。但由于山葵植物的生长发育对环境要求极为苛刻，仅适于在海拔高度为1000-2000米的高山地区种植，生育温度超过30°C易发生软腐病，但低于_3°C时又易受冻害；另外，山葵生长还要求有一些如山杨等适宜的伴生植物存在，并且一株山葵植物经过18个月的栽种收获的根茎一般不到200g。因此，靠自然生长的山葵产量较低，有必要通过组织培养的方式快速生产山葵植物，以满足市场的需求。目前已有人对山葵植物的组织培养进行了研究，如王安虎的论文《山葵叶片愈伤组织诱导试验》、张建佳的论文《山葵愈伤组织培养及其风味物质的研究》和王健美的论文《山葵离体培养研究》等，但目前在山葵愈伤组织诱导培养中所采用的外植体主要是山葵植物的叶、叶柄和芽，还未见以山葵根为外植体的愈伤组织诱导培养的报道。根据胡尚勤等人在《山葵中异硫氰酸酯的提取及其对流感病毒的作用》和王健美等人在《山葵组织培养及愈伤组织成分分析》的研究结果可知山葵植物的地下器官根和根茎中异硫氰酸酯的含量明显高于地上部分的叶、叶柄和芽，因此以山葵根根为外植体进行愈伤组织诱导，可获得有效成分含量高的山葵培养物。
发明内容
本发明的目的在于一种以山葵根为外植体的山葵愈伤组织培养方法，该方法可成功诱导出有效成分含量高的愈伤组织，并能实现愈伤组织大规模的增殖生长。为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成(I)外植体的处理取从山葵植株剪下的山葵根，用流水冲洗干净后，放于滤纸上吸干表面水分，然后将其放在超净工作台上用浓度为O. 19Γ0. 15%的升汞消毒5lmin，再用无菌水冲洗2飞次后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织的诱导培养将已消毒的山葵根切为l-2cm的长度，然后接入愈伤组织培养基 MS+6-BA0. 5 4. Omg · L 1+2, 4-D1. O 6. Omg · L ^IAAO. 5 3. Omg · L 1 中进行诱导培养，培养条件为温度10 28°C，每天光照4 10小时，光照强度为600 12001x ；(3)愈伤组织的增殖培养将步骤(2)制得的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基 l/2MS+6-BA(Tl. Omg · 1^+2，4-D I. 0 4· Omg · Ι^+ΚΤΟ. 5 I. Omg · Γ1+ 硫代硫酸钠
O.5^4. Og · Γ1中进行增殖培养，培养条件为温度10 28°C，每天光照6 12小时、光照强度为800 15001x ；上述所有培养基的pH值为5. 6 6. 5、蔗糖15 30g .L-1、琼脂5. O 6. Og .L-1。上述步骤(3)中所述愈伤组织为颜色为黄绿色的愈伤组织。本发明以山葵植物根为外植体培养出的愈伤组织有效成分含量高，采用有效成分含量高的山葵培养物制得的下游产品其功效性更强，口感也更好。
本发明方法具有生长周期短，繁殖率高等优点，并能有效摆脱灾害性气候对山葵植物生长的不利影响，使山葵植物可进行周年培养生产，从而能有效解决山葵植物资源短缺问题，满足市场对山葵产品的需求。
具体实施例方式实施例I(I)外植体的处理取无染菌、生长健康的山葵植株，剪下其根，将山葵根用流水冲洗干净后，放于滤纸上吸干表面水分，然后将其放在超净工作台上用浓度为O. 1%的升汞消毒7min,再用无菌水冲洗5次后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织的诱导培养将已消毒的山葵根切为I. 5cm的长度，然后以平放方式(不插入培养基、平放在培养基表面)接入愈伤组织培养基MS+6-BA1. Omg -L^+2, 4-D4. Omg ·Γ1+ΙΑΑ2. Omg -Γ1中进行诱导培养，培养条件为温度18°C，每天光照8小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，培养30天后统计其愈伤组织诱导率为92% ;观察到愈伤组织最先产生于根两端的切口处，先是产生黄绿色的愈伤组织，随着培养时间的增长，还可产生黄白色的愈伤组织；(3)愈伤组织的增殖培养选取步骤(2)制得的颜色为黄绿色的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基 1/2MS+6-BA0. 5mg · L_1+2, 4-D3. Omg · Γ'+ΚΤΟ. 5mg · Γ1+ 硫代硫酸钠
2.Og-Γ1中进行增殖培养，培养条件为温度18°C，每天光照10小时、光照强度为12001x，培养30天后统计愈伤组织可增殖2. 34倍；上述所有培养基的pH值为6. O、蔗糖25g · L'琼脂5. 5g · L'实施例2(I)外植体的处理取无染菌、生长健康的山葵植株，剪下其根，将山葵根用流水冲洗干净后，放于滤纸上吸干表面水分，然后将其放在超净工作台上用浓度为0. 1%的升汞消毒8min,再用无菌水冲洗5次后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织的诱导培养将已消毒的山葵根切为2cm的长度，然后以插入方式接入愈伤组织培养基MS+6-BA3. Omg · L_1+2, 4-D2. Omg · Γ'+ΙΑΑΙ. Omg · Γ1中进行诱导培养，培养条件为温度25°C，每天光照6小时，光照强度为15001x，培养30天后统计其愈伤组织诱导率为87%，观察到愈伤组织主要产生于根切口处的游离端；(3)愈伤组织的增殖培养选取步骤(2)制得的颜色为黄绿色的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基 1/2MS+6-BA1. Omg · L^+2, 4-D I. 5mg · Γ'+ΚΤΟ. 5mg · L—1+ 硫代硫酸钠3.Sg-T1中进行增殖培养，培养条件为温度25°C，每天光照10小时、光照强度为12001x，培养30天后统计愈伤组织可增殖2. 15倍；上述所有培养基的pH值为6. O、蔗糖25g · L_\琼脂5. 5g · L'实施例3(I)外植体的处理取无染菌、生长健康的山葵植株，剪下其根，将山葵根用流水冲洗干净后，放于滤纸上吸干表面水分，然后将其放在超净工作台上用浓度为O. 15%的升汞消毒5min，再用无菌水冲洗4次后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；(2)愈伤组织的诱导培养将已消毒的山葵根切为I. 5cm的长度，然后以平放方式接入愈伤组织培养基MS+6-BA1. 5mg · L_1+2, 4-D5. Omg · L_1+IAA2. 5mg · Γ1中进行诱导培养，培养条件为 温度20°C，每天光照10小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，培养30天后统计其愈伤组织诱导率为90% ；
(3)愈伤组织的增殖培养将步骤(2)制得的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基1/2MS+2, 4-D3. Omg · Γ'+ΚΤΟ. 8mg · Γ1+硫代硫酸钠2. 5g · Γ1中进行增殖培养，培养条件为温度20°C，每天光照10小时、光照强度为12001x，培养30天后统计愈伤组织可增殖
I.96 倍；上述所有培养基的pH值为6. 5、蔗糖25g · L—1、琼脂5. 5g · L—1。比较实施例将实施例I步骤(3)中的愈伤组织增殖培养基中的硫代硫酸钠去掉，改为1/2MS+6-BAO. 5mg ·Ι^+2，4-D3. Omg Γ'+ΚΤΟ. 5mg .171,其它步骤同实施例1，在培养30天后愈伤组织增殖I. 74倍，并且增殖的愈伤组织出现了较严重的褐变，由此说明适当浓度的硫代硫酸钠可有效提高其愈伤组织的增殖倍数，并能有效抑制山葵愈伤组织产生褐变。
权利要求
1.一种以山葵根为外植体的山葵愈伤组织培养方法，其特征在于包括如下步骤 (1)外植体的处理取从山葵植株剪下的山葵根，用流水冲洗干净后，放于滤纸上吸干表面水分，然后将其放在超净工作台上用浓度为O. I 9Γ0. 15%的升汞消毒5 8 min，再用无菌水冲洗2飞次后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分； (2)愈伤组织的诱导培养将已消毒的山葵根切为l-2cm的长度，然后接入愈伤组织培养基 MS+6-BA0. 5 4. O mg · L l+2, 4-D I. O 6· O mg · L :+IAA 0. 5 3. O mg · L 1 中进行诱导培养，培养条件为温度10 28°C，每天光照4 10小时，光照强度为600 1200Ix ； (3)愈伤组织的增殖培养将步骤(2)制得的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基1/2MS+6-BA (Tl. O mg · L-1 +2，4-D I. 0 4· O mg · L_1+KT 0. 5 I. 0 mg · L-1+ 硫代硫酸钠0.5^4. 0 g-Γ1中进行增殖培养，培养条件为温度10 28°C，每天光照6 12小时、光照强度为800 1500 Ix ； 上述所有培养基的PH值为5. 6 6. 5、蔗糖15 30 g · L—1、琼脂5. O 6. O g · L—1。
2.根据权利要求I所述的一种以山葵根为外植体的山葵愈伤组织培养方法,其特征在于步骤(3)中所述愈伤组织为颜色为黄绿色的愈伤组织。
全文摘要
本发明公开了一种以山葵根为外植体的山葵愈伤组织培养方法，该方法通过将山葵根作为外植体接入愈伤组织培养基中进行培养，成功诱导出了有效成分含量高的山葵愈伤组织，从而可有效解决山葵植物资源短缺问题，满足市场对山葵产品的需求，也使所制得的山葵下游产品其功效性更强，口感更好。
文档编号A01H4/00GK102823491SQ201210277158
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者王跃华, 任三军, 赵钢, 孙雁霞, 刘洪明, 李亚梅, 李琴, 冯玉艺, 任强 申请人:成都大学