专利名称：一种可有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法
技术领域：
本发明涉及一种荞麦愈伤组织的增殖培养方法，特别是涉及一种有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法。
背景技术：
养麦(Fagopyrumesculentum)是寥科(Polygonaceae)养麦属(FagopyrumMill.)的双子叶作物，是一种重要的药食同源作物。荞麦中芦丁含量较高，芦丁作为黄酮的主要成分，不仅可以作为抗氧化剂和功能性食品的原料，而且具有降低毛细血管脆性，改善微循环的作用，在临床上主要用于糖尿病、高血压等的辅助治疗。目前国内提取芦丁的原料主要为槐花；但由于槐花产量少，资源稀少，不能充分满足市场需求。因此通过组织培养生产芦丁含量高的荞麦愈伤组织是获得芦丁的有效途径。
目前我国的金红、郝建平、侯建华、刘拥海和王爱国等人分别采用荞麦植物的不同部位器官均成功地诱导出了愈伤组织；并且于寒松等人还对荞麦植物器官中总黄酮含量最高的叶柄以及由叶柄诱导形成的愈伤组织中的总黄酮含量进行了检测，结果发现荞麦植物叶柄中的总黄酮含量为18. 97mg/g，而荞麦叶柄诱导产生的愈伤组织中的总黄酮含量为58. 80mg/g ;可见由叶柄经诱导培养产生的愈伤组织中总黄酮含量增加了 2. I倍。由于荞麦愈伤组织中含有大量的黄酮类化合物，在愈伤组织培养过程中极易产生氧化；因而在荞麦愈伤组织增殖培养过程中，常出现培养材料的严重褐变，从而使得荞麦愈伤组织在大量增殖过程中由于产生严重褐变而造成培养材料的死亡。目前还未见有关解决方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法，为达到上述目的，本发明采用的解决方案包括如下步骤(I)荞麦愈伤组织的获得选取春季播种、生长健康的荞麦的叶柄，将其消毒后切成I 2cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA O. I 2. Omg/L+2，4-D I 6mg/L+IAA O lmg/L中，在20 27°C、每天光照8 16小时、光照强度为1500 2500 Ix的条件下进行培养，培养基的PH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L ；(2)愈伤组织的预培养选取无褐变的荞麦愈伤组织，放入培养箱中在温度6 12°C、无光照的条件下预培养7 14天，所述预培养是在原培养基中进行培养，不需转接；(3)愈伤组织的增殖培养将预培养后的愈伤组织切割后，迅速把切口端插入增殖培养基中，先在温度4 8 °C、无光照的条件下培养3 5天，再在22 28°C、每天光照6
12h、光照强度为1200 2000 Ix的条件下进行快速增殖培养，所述增殖培养基采用改良的MS为基本培养基，并添加6-BA O. 5 2. Omg/L、IAA O. 5 4mg/L、柠檬酸6. O 12 mg/L和L-半胱氨酸50 150mg/L,培养基的pH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L。
上述步骤(I)中所述消毒是指用浓度为O. 1%的升汞消毒2 6分钟，再用无菌水清洗3 4次。上述步骤(2)中所述无褐变荞麦愈伤组织是诱导培养18-30天的无褐变愈伤组织。上述步骤(3)中所采用的改良MS基本培养基为1/2MS培养基。本发明通过在愈伤组织增殖培养前对其进行预培养、以及在增殖培养基中加入柠檬酸和L-半胱氨酸，有效降低了荞麦愈伤组织在增殖培养中的褐变率，提高了愈伤组织的增殖倍数，实现了利用生物工程技术大规模生 产黄酮类物质含量高的荞麦愈伤组织。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例I(I)荞麦愈伤组织的获得选取春季播种、生长健康的荞麦叶柄，先用浓度为O. 1%的升汞消毒4分钟，再用无菌水清洗3次，然后切成I. 5cm的长度，接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA O. 5mg/L+2,4-D 4mg/L+IAA O. lmg/L 中，在 25°C、每天光照 10 小时、光照强度为2000 Ix的条件下进行培养，培养基的pH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L ；(2)愈伤组织的预培养选取诱导培养20天、无褐变和生长速度快的荞麦愈伤组织，放入培养箱中在温度8°C、无光照的条件下预培养10天；(3)愈伤组织的增殖培养将预培养后的愈伤组织沿横向切割(以减少愈伤组织的伤口面积)，然后迅速把切口端插入增殖培养基1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 2 mg/L +柠檬酸10 mg/L+ L-半胱氨酸100 mg/L中，先在温度6°C、无光照的条件下培养4天,再在24°C、每天光照8 h、光照强度为15001x的条件下进行快速增殖培养，培养基的pH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L，培养30天后愈伤组织增殖了 2. 15倍，褐变率仅为21. 5%。实施例2(I)荞麦愈伤组织的获得选取春季播种、生长健康的荞麦叶柄，先用浓度为O. 1%的升汞消毒5分钟，再用无菌水清洗4次，然后切成I. 5cm的长度，接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA I. 5mg/L+2,4-D 2mg/L+IAA O. 5mg/L 中，在 25°C、每天光照 14 小时、光照强度为2000 Ix的条件下进行培养，培养基的pH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L ；(2)愈伤组织的预培养选取诱导培养25天、无褐变和生长速度快的荞麦愈伤组织，放入培养箱中在温度12°C、无光照的条件下预培养8天；(3)愈伤组织的增殖培养将预培养后的愈伤组织切割后，迅速把切口端插入增殖培养基 1/2 MS+6-BA I. 5 mg/L+IAA I mg/L + 梓檬酸 7 mg/L+ L-半胱氨酸 140 mg/L 中，先在温度8°C、无光照的条件下培养3天，再在22°C、每天光照10 h、光照强度为15001x的条件下进行快速增殖培养，培养基的PH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L,培养30天后愈伤组织增殖了 I. 75倍，褐变率为35. 5%。实施例3(I)荞麦愈伤组织的获得选取春季播种、生长健康的荞麦叶柄，先用浓度为O. 1%的升汞消毒4分钟，再用无菌水清洗4次，然后切成2cm的长度，接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA I. Omg/L+2,4-D 5mg/L中，在25°C、每天光照12小时、光照强度为2000 Ix的条件下进行培养，培养基的PH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L ；(2)愈伤组织的预培养选取诱导培养20天、无褐变的荞麦愈伤组织，放入培养箱中在温度6°C、无光照的条件下预培养12天；(3)愈伤组织的增殖培养将预培养后的愈伤组织切割后，迅速把切口端插入增殖培养基 1/2 MS+6-BA O. 6mg/L+IAA 3mg/L + 梓檬酸 12 mg/L+ L-半胱氨酸 60 mg/L 中，先在温度6°C、无光照的条件下培养5天，再在27°C、每天光照7 h、光照强度为1800 Ix的条件下进行快速增殖培养，培养基的pH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L，培养30天后愈伤组织增殖了 I. 6倍，褐变率为45. 2%。比较实施例I将实施例I步骤(I)中的荞麦叶柄改为秋季播种的荞麦的叶柄，其它步骤同实施例1，经30天增殖培养后，愈伤组织增殖了 O. 79倍，褐变率为87. 5%。说明荞麦叶柄选择很 重要。比较实施例2将实施例I步骤(3)中的增殖培养基中的基本培养基由1/2 MS改为MS，其它步骤同实施例I ;培养30天后愈伤组织增殖了 I. 25倍，褐变率为43. 8%。说明基本培养基采用1/2 MS，其效果明显优于MS。比较实施例3将实施例I中的步骤(2)取消，其它步骤同实施例1，培养30天后愈伤组织增殖了
I.45倍，褐变率为83. 6%，说明愈伤组织的预培养对抑制褐变产生有明显效果。
权利要求
1.一种可有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法，其特征在于包括如下步骤 (1)荞麦愈伤组织的获得选取春季播种、生长健康的荞麦的叶柄，将其消毒后切成I 2cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA O. I 2. 0mg/L+2，4_D I 6mg/L+IAA O lmg/L中，在20 27°C、每天光照8 16小时、光照强度为1500 2500 Ix的条件下进行培养，培养基的PH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L ； (2)愈伤组织的预培养选取无褐变的荞麦愈伤组织，放入培养箱中在温度6 12°C、无光照的条件下预培养7 14天； (3)愈伤组织的增殖培养将预培养后的愈伤组织切割后，迅速把切口端插入增殖培养基中，先在温度4 8°C、无光照的条件下培养3 5天，再在22 28°C、每天光照6 12h、光照强度为1200 2000 Ix的条件下进行快速增殖培养，所述增殖培养基采用改良的MS为基本培养基,并添加6-BA O. 5 2. Omg/L、IAA O. 5 4mg/L、梓樣酸6. O 12 mg/L和L-半胱氨酸50 150mg/L,培养基的pH值为6. O、蔗糖30g/L、琼脂6. 8 g/L。
2.根据权利要求I所述的一种可有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法，其特征在于步骤(I)中所述消毒是指用浓度为O. 1%的升汞消毒2 6分钟，再用无菌水清洗3 4次。
3.根据权利要求I所述的一种可有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法，其特征在于步骤(2)中所述无褐变荞麦愈伤组织是诱导培养18-30天的无褐变愈伤组织。
4.根据权利要求I所述的一种可有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法，其特征在于步骤(3)中所采用的改良MS基本培养基为1/2MS培养基。
全文摘要
本发明公开了一种可有效抑制褐变产生的荞麦愈伤组织的增殖培养方法，该方法通过在荞麦愈伤组织增殖培养前对其进行预培养、以及在增殖培养基中加入柠檬酸和L-半胱氨酸，有效抑制了荞麦愈伤组织在增殖培养中的褐变率，提高了愈伤组织的增殖倍数，为大量、快速生产黄酮类物质(芦丁)提供了一种新途径。
文档编号A01H4/00GK102823490SQ20121027715
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者王跃华, 赵钢, 孙雁霞, 宋超, 陈丽, 段有丽, 邬晓勇, 邹亮, 彭镰心 申请人:成都大学