专利名称：一株多粘类芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株多粘类芽孢杆菌及其应用，特别涉及该株多粘类芽孢杆菌及其在抑制病原真菌、病原细菌和防治植物真菌病害中的应用。
背景技术：
多粘类芽抱杆菌(Paenibacilluspolymyxa(Prazmonski)Ash, Priest&Collins)是ー种产芽孢的革兰氏阳性细菌，为类芽孢杆菌属的模式种，1993年之前分类上归为芽孢杆菌属，拉丁名为Bacillus polymyxa(Prazmonski)Mac6。多粘类芽孢杆菌对植物具有非致病性，同时具有防病作用和促生作用，作为生防菌广泛应用在农业生产中。研究表明多粘类芽孢杆菌有从土壤向植物根部移动定殖的能力，并能产生肽类和蛋白质类，以及核 苷类、吡嗪类和酚类等多种抗菌物质，可防治多种植物病害。多粘类芽孢杆菌产生的肽类抗菌物质按作用效果不同可分为两类，一类是只对细菌(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)有抑制作用的抗菌物质，这类肽类抗生素包括多粘菌素、粘菌素、环杆菌素、多肽菌素、Paenibacillin、Gavaserin和Saltavidin。而另一类是对真菌和革兰氏阳性细菌均有活性的抗菌物质，包括乔利肽菌素、谷缬菌素、杀铼孢菌素等。多粘类芽孢杆菌产生的抗菌蛋白主要为水解酶类，这些蛋白类抗菌物质通常只能给出分子量及部分性质，分子量从IOKDa到37KDa不等,立体结构及氨基酸ー级结构还需进ー步研究。多粘类芽孢杆菌的核苷类抗菌活性物质主要为多氧霉素(Polyxin)此外，多粘类芽孢杆菌能通过固氮和溶磷作用为宿主植物提供养料，促进植株生长，提高植物的抗病原微生物效果。多粘类芽孢杆菌作用范围广，对植物病原细菌、病原真菌、根结线虫(Khan Z, Kim S G,Jeon YH, et al. , 2008, A plantgrowth promoting rhizoDacterium，PaembacilJ_us poiymyxa stramGBR-1, suppressesroot-knot nematode, Bioresource Technology, 99 (8) : 3016-3023)等多种有害生物均有抑制作用。其作用机理多祥，既可产生抗菌活性物质，又有可以菌体直接起作用，还能与植物互作而增强植物抗病性。综上所述，多粘类芽孢杆菌能分泌多种胞外抗菌物质，对多种植物病原物有抑制活性，是ー种很好的生防菌。
发明内容
本发明的ー个目的是提供一株新的多粘类芽孢杆菌，该菌株经过发酵后产生具有強烈抑菌作用的活性代谢产物，该菌株及其活性代谢产物可用于制备广谱性抑制病原真菌和病原细菌的生防制剂，用于防治植物真菌和细菌病害。本发明所提供的多粘类芽孢杆菌，是多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001，已于2011年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No. 5563。本发明的另ー个目的是提供一种生防制剂。该生防制剂的活性成分为所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563的代谢产物，或/和所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563。所述代谢产物可从除去多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001CGMCC No. 5563菌体的发酵滤液中获得。在本发明中，所述生防制剂具体为如下两种生防制剂I :菌体与代谢产物混合制剂，即所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的发酵液，或所述多粘类芽抱杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563的发酵液和草炭的混合物。生防制剂2 :代谢产物制剂，即所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的无菌发酵滤液。 在本发明的一个实施例中，所述生防制剂具体按照如下如下A)或B)的方法获得A)将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培养后取2 — 3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28°C，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，收集发酵液。收集发酵液后可根据需要将所述发酵液与草炭按照体积比I :1的比例混合，得到混合物。所述发酵液或所述混合物即为所述生防制剂I。B)将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培养后取2 — 3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28°C，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，室温离心，取上清并过滤灭菌，得到所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的无菌发酵滤液，即为所述生防制剂2。所述NB培养基的pH为7.0-7. 2，溶质为葡萄糖、蛋白胨和牛肉膏，溶剂为水；所述葡萄糖、所述蛋白胨和所述牛肉膏在所述NB培养基中的终浓度依次为0. 5g/100ml、0.5g/100ml、0. 3g/100ml。所述生防制剂为下述I) -4)中任一的生防制剂I)用于防治植物真菌病害的生防制剂；2)用于防治植物细菌病害的生防制剂；3)用于抑制病原真菌的生防制剂；4)用于抑制病原细菌的生防制剂。所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563在制备下述I) -4)中任一生防制剂中的应用也属于本发明的保护范围I)用于防治植物真菌病害的生防制剂；2)用于防治植物细菌病害的生防制剂；3)用于抑制病原真菌的生防制剂；4)用于抑制病原细菌的生防制剂。在上述生防制剂和生防制剂的应用中，所述病原真菌具体可为下述真菌中至少一种苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana f. sp piricela)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)(Rhizoctonia cerealis)、百合基腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lilii)和甘蓝枯奏病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinansノ ；
所述病原细菌具体可为下述细菌中至少ー种黄瓜角斑病菌(Pseudomonassyringae pv. Iachrymans)和根癌土壤杆菌(桃冠瘦病菌)(Agrobacterium tumefaciens)。在本发明的一个实施例中，所述植物真菌病害具体为枯萎病，更加具体的，所述枯萎病具体为由尖铼孢粘团专化型(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans),即上述甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)所引起的十字花科枯萎病。所述植物为甘蓝；所述甘蓝的具体品种为中甘21。所述多粘类芽抱杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563,或所述生防制剂在如下a)或b)中应用也属于本发明的保护范围a)促进植物生长；所述促进植物生长体现在促进根系扩展和/或提高植株鲜重和/或提高植株干重上；所述植物具体可为甘蓝，如中甘21。
b)制备微生物肥料。本发明的再ー个目的是提供ー种含有所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563，或所述生防制剂的微生物肥料。通常情况下，所述微生物肥料为含有所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 发酵液的肥料。所述生防制剂的制备方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polxmyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的代谢产物，或/ 和所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 作为活性成分，得到所述生防制剂。所述代谢产物可从除去多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001CGMCC No. 5563菌体的发酵滤液中获得。在本发明的一个实施例中，所述生防制剂具体按照如下如下A)或B)的方法获得A)将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培养后取2 — 3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28°C，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，收集发酵液。收集发酵液后可根据需要将所述发酵液与草炭按照体积比I :1的比例混合，得到混合物。所述发酵液或所述混合物即为所述生防制剂I。B)将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培养后取2 — 3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28°C，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，室温离心，取上清并过滤灭菌，得到所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的无菌发酵滤液，即为所述生防制剂2。所述NB培养基的pH为7.0-7. 2，溶质为葡萄糖、蛋白胨和牛肉膏，溶剂为水；所述葡萄糖、所述蛋白胨和所述牛肉膏在所述NB培养基中的终浓度依次为0. 5g/100ml、
0.5g/100ml、0. 3g/100ml。本发明所提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563具有如下优点I、本发明所提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563及其无菌发酵滤液具有明显的抗菌活性，抗菌谱广，对甘蓝枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. conglutinans)、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)(R. cerealis)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、苹果轮纹病菌(B. berengeriana f. sp piricola)、百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp. lilii)、棉花黄萎病菌(V. dahliae)、黄瓜角斑病菌(P. syringaepv. lachrymans)、根癌土壤杆菌(桃冠瘿病菌)(Agrobacterium tumefaciens)等病原菌和蜡状芽孢杆菌(B. cereus)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、大肠杆菌(E. coli)、等细菌均有強烈的抑制作用。2、在甘蓝枯萎病的温室和田间防治试验中，本发明所提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563发酵液的防治效果均优于阳性对照50%多菌灵500倍液,在温室盆栽防治试验中，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563发酵液对甘蓝枯萎病的平均预防和治疗效果分别可达91. 21%和67. 43%o在田间小区栽培防治试验中，多粘类芽孢杆菌(PaenibaciIIus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563发酵液及其生防制剂(草炭+发酵液)对甘蓝枯萎病的平均防治效果分别可达79. 93%和88.03%。另外，多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563的发酵液对甘蓝根系扩展和植株生长有促进作用。表现出良好的开发应用前景。3、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的无菌发酵滤液PH值范围耐受范围宽，在pH 1-14的条件下均能保持较高的抑菌活性，对紫外线的照射不敏感，并能经受90°C的高温,这些特点使得多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563发酵产物在田间应用中具有较强的环境适应能力，为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCCNo. 5563生防制剂的开发应用提供了很好的依据。保藏说明菌种名称多粘类芽孢杆菌拉丁名“Paenibacillus polymyxa)菌株编号JZB120001保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2011年12月9日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 556
图I 为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的菌体形态显微照片(1000X )。图2 为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的芽孢染色结果的显微照片(1000X )。图3 为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的16S rDNA扩增产物电泳检测結果。其中，泳道M为250bp DNA Ladder Marker ;泳道I和泳道2均为16S rDNA PCR产物。图4 为多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 基于16S rDNA序列的系统发育树。图5 为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563对不同真菌的抑菌活性检测结果。其中，a为甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans) ;b为禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)(Rhizoctonia cerealis) ;c为桃褐腐病菌(Monilinia fructicola) ;d 为苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengerianaf. sp piricola) ;e为百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp. lilii) ;f为棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)。图6 为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563无菌发酵滤液对不同细菌的抑菌活性检测結果。其中，a为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus) ;b 为枯草芽抱杆菌(B. subtilis) ;c 为大肠杆菌(Escberichia coli) ;(1为桃根癌炳菌(Agrobacterium tumefaciens) ;e 为黄瓜角斑炳菌(Pseudomonas syringaepv. lachrymans) o a_e中，位于平板左侧的A均为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563无菌发酵滤液处理组；位于平板右侧的B均为无菌水对照。图7 为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563无菌发酵滤液抗细菌活性稳定性检测的结果。其中，a为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563无菌发酵滤液经不同pH处理后的检测结果；数值
1、3、5、9、11、14分别表示六个不同的pH处理组。b为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563无菌发酵滤液经紫外线(254nm)光照处理不同时间后的检测结果；数值30、60、90、120、150分别表示五个不同时间的紫外线(254nm)光照处理组，单位为min。。为多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus poIymyxa)JZB 120001 CGMCC No. 5563无菌发酵滤液经不同温度处理后的检测结果；数值60、70、80、90、100分别表示五个不同的温度处理组，单位为。C。a_c中，A均为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCCNo. 5563无菌发酵滤液对照组；B均为50 u g/ml的硫酸链霉素(20 U I)阳性对照。图8 为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 发酵液对甘蓝苗植株的促生作用。其中，从左至右依次为促生空白对照、发酵液単独处理(促生作用组)、发酵液处理后接种枯萎病菌(预防作用组)、接种枯萎病菌后用发酵液处理(治疗作用组)、接种枯萎病菌后用多菌灵处理(药剂治疗对照组)、単独接种枯萎病菌(防治空白对照组)。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。供试菌腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)由沈阳农业大学提供(中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC10263)；甘蓝枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans):李明远，张涛涛，李兴红，等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定[J].植物保护，2003，29(3) :44-45.
禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)(Rhizoctonia cerealis):中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC37699 ；桃褐腐病菌(Monilinia Fructicola):陈笑瑜，师迎春，骆勇，国立耘.桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)对3种杀菌剂的敏感性[J].植物保护，2006，32(3) :25-28.苹果轮纹病菌(Botryosphaeriaberengeriana f. sp piricola):冷伟锋,李保华，国立耘，等.苹果轮纹病菌诱导产孢方法.植物病理学报，2009，39 (5) : 536-539.百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp. lilii):许志刚 拉汉ー汉拉植物病原生物名称.北京中国农业出版社，2007.棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae):中国农业微生物菌种保藏管理中心,菌株库藏号ACCC 30308 ； 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis):中国农业微生物菌种保藏管理中心,菌株库藏号 ACCC 10115 ；大肠杆菌(Escherichia coli):中国农业微生物菌种保藏管理中心,菌株库藏号ACCC 10080 ；根癌土壤杆菌(桃冠瘿病菌)(Agrobacterium tumefaciens):中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC 10055 ；；黄瓜角斑病菌(Pseudomonassyringae pv. lachrymans):许志刚 拉汉ー汉拉植物病原生物名称.北京中国农业出版社，2007.；以上各供试菌公众均可从北京市农林科学院植环所获得。NB培养基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,牛肉膏3. Og,蒸懼水定容1000ml,pH7. 0-7. 2，121°C 灭菌 20min。PDA培养基葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯200g，加水IOOOmL煮沸30min滤取汁液，加水补足 1000ml, pH6. 0-7. 0，121°C灭菌 20min。NA培养基葡萄糖5. 0g，蛋白胨5. 0g，牛肉膏3. Og,琼脂18g，水1000ml，pH7. 0-7. 2，121°C 灭菌 20min。甘蓝品种中甘21号中国农科院蔬菜花卉研究所，中甘21号甘蓝种子。实施例I、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001的分离与鉴定一、菌株JZB120001的分离筛选多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001,是从北京郊区种植蔬菜的耕作土壌中分离筛选获得。具体方法如下从北京郊区蔬菜田采集土壤样品，取10 g加入装有IOOml无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于26mm振幅摇床上100r/min振荡20min，取0. 5ml加入4. 5ml无菌水中制成土壤悬液，再依次稀释10_2，10_3，10_4倍，分别取各稀释土壤悬液0. Iml在NA培养基平板上均匀涂布，超净工作台内吹至略干；每浓度3个重复，置28°C恒温箱中培养5-10d，挑取细菌单菌落在NA平板上再次稀释划线获得纯培养。以甘蓝枯萎病菌等病原真菌和黄瓜角斑病菌等细菌为靶标菌，利用对峙培养法分别在PDA培养基和NA培养基平板上进行拮抗菌的初筛；对初筛获得的有拮抗活性的菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经0. 45 y m的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液；分别利用牛津杯法和凹玻片法进ー步测试无菌发酵滤液对病原菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用，利用温室盆栽接种试验测试发酵液对甘蓝枯萎病的温室防病效果，最終筛选出性状优良的生防菌株。将筛选所得的ー株菌编号为JZB120001。ニ、菌株 JZB120001 的鉴定从以下几个方面对步骤一中分离得到的菌株JZB120001进行分类鉴定I、形态学鉴定将上述步骤一分离得到的菌株JZB120001培养至对数生长期且菌落大小稳定吋，进行菌落形态描述，主要包括菌落的大小、顔色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。对于处于对数生长期的所述菌株JZB120001，经涂片后进行美蓝染色、芽孢染色和 革兰氏染色，光镜下观察菌体和芽孢形态及革兰氏染色特性。结果表明，上述步骤一分离得到的菌株JZB120001菌落在NA培养基平板上呈薄层、似变形虫的移动扩散状；在PDA培养基平板上为大型粘液状，乳白至浅黄色，表面光滑，中央常有小突起；菌体杆状，2-5X0. 6-0.8 iim (图1)，革兰氏染色阳性，芽孢膨大，呈椭圆形，位于菌体的末端或次末端(图2)。2、生理生化特征分析采用常规方法对菌株JZB120001进行生理生化特性分析，试验项目及其结果见表
Io表I拮抗菌株JZB120001的生理生化特性
试验项S结果试验项S結果
接触_+利用tt露醇产酸+
氧化酶—利用葡萄糖产气+
厌氧生长+利用柠懞酸盐—
VP试验+硝酸盐还原+
VP<pH6+50°C 生长_
VP>pH7—pH5.7 生[_<:+
甲基红试验+7%NaCl生长一
利用葡萄糖产酸+淀粉水解+
利用木糖产酸+明胶液化+
利用L-阿拉伯糖产酸 j+j 分解酪I !_ +3、16s rDNA序列同源性分析常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株JZB120001，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌 16s rDNA 通用引物，27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' , 1492r 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行 PCR 反应。反应程序为94°C预变性 5min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，30个循环；72°C延伸8min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带送北京三博远志测序。所得序列通过美国国家生物技术信息中心 NCBI 数据库(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)在线 Blast 比对，选择与其 16S rDNA 序列相似性高的模式菌株利用Mega5软件构建系统发育树。
菌株JZB120001的16S rDNA扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测获得了约1500bp的条带(图3)，测序结果表明其长度为1463bp，其序列详见序列表中序列I ;经在线Blast比对，与其序列相似性较高的前23个菌株中，除枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株RZ(EU220428. I)和 4 个 Paenibacillus sp.菌株(HQ317156. I、⑶328695. I、⑶979221. I和⑶328690. I)タト，包括前8个菌株在内的其余18个菌株均为多粘类芽孢杆菌；而枯草芽孢杆菌的模式菌株DSM IOt (NR_027552. I) 16S rRNA基因序列与菌株JZB120001的相似性却相距较远，应用两序列比对程序比对的结果仅为87%，由此推测枯草芽孢杆菌菌株RZ与菌株JZB120001的相似性尚不能代表枯草芽孢杆菌与菌株JZB120001的亲缘关系。选择Blast结果中与菌株JZB120001相似性在97%以上的6个种及枯草芽孢杆菌的模式菌株与菌株JZB120001 —起构建的基于16S rDNA序列的NJ系统发育树如图4。由图4可见，菌株JZB120001与多粘类芽孢杆菌的2个模式菌株IAM 134191和DSM 36T聚为同一分支，与其另ー模式菌株NRS-11051的距离也较近；而枯草芽孢杆菌的模式菌株DSM IOt与所有菌株 的遗传距离均最远，成为该发育树的外群。 鉴于上述形态、生理生化特征和16s rDNA序列同源性分析結果，将步骤一分离得到的菌株JZB120001鉴定为类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)类芽孢杆菌属(Paemibacillus)多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)。该菌株 JZB120001 已于2011年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，建议的分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),保藏编号为 CGMCC No. 5563。实施例2、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563及其代谢产物的抑菌活性检测一、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 发酵液及无菌发酵滤液的制备将多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 在 NA培养基斜面上活化培养后取2-3环接种到500ml三角瓶内的50ml NB培养基中。28°C，26mm振幅，170r/min振荡培养24h作为种子培养液；将其按2% (v/v)的接种量转接于500ml三角瓶内的50ml NB培养基中，28 °C，170r/min振荡培养48h，得多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 发酵液(原液)。所得发酵液6. 87X IO3g (8500r/min)室温离心15min，取上清用0. 45 y m微孔滤膜过滤灭菌，得到多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的无菌发酵滤液(除去菌体的代谢产物溶液)。ニ、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 抗真菌活性的測定供试的病原真菌为甘蓝枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans)、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)(Rhizoctonia cerealis)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、苹果祀纹ラ丙 M (Botryosphaeria berengeriana f. sp piricolaノ、百合务腐炳囷(Fusarium oxysporum f. sp. Iiliiノ、棉花黄_炳M (Verticillium dahliae)。采用平板对峙培养法先在PDA平板相对两侧接种拮抗菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563，28°C培养 2d后，在上述已接种好多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的 PDA 平板中央接种靶标病原真菌，28°C继续培养3d，观察并測量接种拮抗菌和病原真菌菌落之间的抑菌带宽度(杨慧勇，李飞凤，陆琼娴，等，2006.拮抗菌株AFR0406对小麦赤霉病菌和纹枯病菌的生物活性测定.江苏农业科学，6:142-144)。每个处理三次重复，实验结果以三次重复的平均值土标准差的形式表示。同时设置只接病原真菌而不接多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的对照。测定结果如表2和图5所示，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563在PDA平板上对所有供试的病原真菌都有抑制作用。其中对苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana f. sp piricola)的抑菌带宽度达 15. 6mm ;对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)和棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)的抑菌带宽度可达14. 5mm以上；对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)(Rhizoctonia cerealis)和百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp.lilii)的抑菌带宽度也达11. 5mm以上。表2 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的抗
权利要求
1.多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的藏编号为CGMCC No. 5563。
2.ー种生防制剂，它的活性成分为权利要求I所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563的代谢产物和/或权利要求I所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563。
3.根据权利要求2所述的生防制剂，其特征在于所述生防制剂为下述I)-4)中任一的生防制剂 1)用于防治植物真菌病害的生防制剂； 2)用于防治植物细菌病害的生防制剂； 3)用于抑制病原真菌的生防制剂； 4)用于抑制病原细菌的生防制剂。
4.权利要求I所述的多粘类芽抱杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563在制备下述I) _4)中任一生防制剂中的应用 1)用于防治植物真菌病害的生防制剂； 2)用于防治植物细菌病害的生防制剂； 3)用于抑制病原真菌的生防制剂； 4)用于抑制病原细菌的生防制剂。
5.根据权利要求3所述的生防制剂或权利要求4所述的应用，其特征在于所述病原真菌为下述中至少一种苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana f. sppiricola)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、百合基腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lilii)和甘蓝枯姜病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinansノ ； 所述病原细菌为下述中至少一种黄瓜角斑病菌(Pseudomonas Iachrymans)和桃冠瘿炳囷(Agrobacterium tumefaciens)； 所述植物真菌病害为枯萎病。
6.根据权利要求5所述的生防制剂或应用，其特征在于所述枯萎病为由甘蓝枯萎病|if I Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)所弓 I起的炳舍。
7.权利要求I所述的多粘类芽抱杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563，或权利要求2、3、5或6所述的生防制剂在如下a)或b)中应用 a)促进植物生长； b)制备微生物肥料。
8.含有权利要求I所述多粘类芽抱杆菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563，或权利要求2、3、5或6所述生防制剂的微生物肥料。
9.权利要求2、3、5或6所述生防制剂的制备方法，包括如下步骤将所述多粘类芽孢杆菌(Paenibaeillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的代谢产物，或/和所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 作为活性成分，得到所述生防制剂。
全文摘要
本发明公开了一株多粘类芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的多粘类芽孢杆菌是多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的藏编号为CGMCC No.5563。该菌株经过发酵后产生具有强烈抑菌作用的活性代谢产物，该菌株及其活性代谢产物可用于制备广谱性抑制病原真菌和病原细菌的生防制剂，用于防治植物真菌病害。
文档编号A01P1/00GK102851243SQ20121033025
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者刘伟成, 卢彩鸽, 刘霆, 董丹, 张涛涛, 吴慧玲, 刘德文, 张殿朋, 裘季燕, 赵爽 申请人:北京市农林科学院