专利名称：药用猴头菌菌丝体液体深层发酵培养方法
技术领域：
本发明涉及微生物培育技术领域，尤其是药用猴头菌菌丝体的培养方法。
背景技术：
猴头菌，是因为其子实体形状酷似小猴子的头而得名，是一种兼有食用和药用价值的名贵食用菌，性平、味甘，能利五脏、助消化，滋补、抗癌，治疗神经衰弱，用于治疗消化不良、胃溃疡、食道癌、胃癌、十二指肠癌、喷门癌等消化系统的疾病与肿瘤。目前猴头菌已成功应用于现有产品中，如市售的猴头健胃灵胶囊，其中猴头菌是该产品的主要成份。
目前猴头菌的生产途径主要有三种1、人工栽培，优点是简单易行，成本低；缺点是栽培周期长，约3个月；2、固体发酵，用固体培养基培养猴头菌菌丝体，以获得次生代谢产物，其优点是培养基简单且来源广泛，价格便宜；发酵过程一般不需要严格的无菌操作；培养过程供氧和温度可采用直接空气强制通风来控制；发酵残渣的处理简单，直接作为饲料或肥料；缺点是培养基水分活度低，培养基不均匀且不易搅拌，菌体的生长、对营养物质的吸收和代谢产物的分泌都不均匀，使得发酵参数的监测和控制困难，因此连续操作和自动化很困难；微生物呼吸和代谢所产生的热量的温度控制非常困难；采用固态培养大多基于经验数据和操作经验，易污染杂菌；3、液体深层发酵，以获得最佳操作条件在较短时间内生产大量的菌丝体和代谢产物，优点是可以进行工业化连续生产，培养原料来源广泛，通过控制发酵装置达到最佳培养条件，以获取周期短效率高；缺点是周期还是较长，且菌丝体的生产量低，难以形成大规模应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出一种药用猴头菌菌丝体液体深层发酵培养方法，该方法能生产出质量更好的药用猴头菌菌丝体，方法更为完善。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案一种药用猴头菌菌丝体的培养方法，包括以下步骤下述物质的百分数均为重量百分数，(I).菌种的优化筛选及子实体分离采选中条山原始森林中的野生猴头菇中生长强壮、发育良好、没有病虫害、种子没散落的子实体；在接种室100级以上超净工作台内，将猴头菇子实体浸入75%的酒精中消毒I 2分钟，取出后用蒸馏水冲洗干净，再用消毒纱布擦干，将子实体放在培养皿上，用钟形罩或类似用具覆盖，室温保持在20°C，使子实体缓慢生长，过2 3天后，种子即散出来，落入培养皿中，然后用镊子蘸取落下的种子，用划线法接种于试管的斜面上培养，在22 25°C下培养4 5天种子即会萌发，待菌丝基本长满斜面时，选择色白、基内菌丝发达粗壮，菌束明显的即优良菌种，置入摇床瓶接种备用；培养皿中培养基组成如下麦芽糖I ~ 3%
蛋白胨1~3%
琼脂2 ~ 3. 5%
硫酸庆大霉素I ~ 3%
碳酸转I ~ 3%
黄豆粉2 ~ 5%
玉米棒I ~ 3%
木屑I ~ 3%
甘草药渣5~10%
延胡索药渣5~10%
棉籽壳2 ~ 5%加入余量的水，pH值6 7. 5，118 121°C灭菌25 30分钟；(2).菌种的培养2. I配制培养基
玉米粉5-10%
黄豆粉3 ~ 5%
葡萄糖O. 5 - 1%
硫酸镁O. 01 ~ O. 05%
磷酸ニ氢钾O. 01 ~ O. 05%
蛋白胨O. 5~1%
麦芽糖I ~ 3%
硫酸庆大霉素I ~ 3%加入余量的水，pH为6 7. 5，118 121°C灭菌28 32分钟；2. 2接种前，接种ロ应先用常规方法消毒，即用75%酒精浸泡过的脱脂棉球擦试，后开启臭氧发生器，使其出风ロ始终对着接种ロ，在接种ロ周围形成ー个局部无菌区，然后用消过毒的无毒橡胶管套于接种管口上，将经过孢子分离的摇床瓶菌种接入罐内，接种量为9% 11%，全部过程均在无菌条件下进行，接种后开搅拌机，搅拌速度100转/分，恒温25°C，培养3 4天；镜检菌丝呈树枝状，无杂菌，外观有白球状；(3).液体深层培养
3. I种子罐培养培养基为如下组成
土豆浸取液10-15%
红糖3 ~ 5%
玉米浆I ~ 3%
豆浆I ~ 3%
硫酸镁0.05~1%
嶙酸二氢钾O. 05 ~ 1%
硫酸庆大霉素I ~ 3%
碳酸钓I ~ 3%加入余量的水，118 121°C灭菌28 32分钟；将步骤(2)培养好的菌种接种至种子罐，25 27°C，培养3 4天，至结果为①·镜检菌丝呈树枝状，无杂菌；②.外观液体中有较多白球状粒；3. 2 二级罐培养培养基为如下组成
麸皮5~10%
谷糠I ~ 3%
玉米面I ~ 3% 甘草药渣1~3%
延胡索药渣 1~3%
玉米棒I ~ 3%
稀軒壳I ~ 3%
木屑2~5%加入余量的水，118 121°C灭菌28 32分钟，将步骤3. 2培养好的菌种接种至二级罐，25 27°C，培养2 3天；3. 3三级罐培养培养基为如下组成麸皮 10-20%
谷糠 5-10%
玉米面 2 ~ 5%
黄豆粉 2 ~ 5%
甘草药渣2~5%
棉籽壳 I ~ 5% 加入余量的水，118 121°C灭菌28 32分钟，将步骤3. 3培养好的菌种接种至三级罐，25 27°C培养3 4天，至培养液呈棕色，充满菌丝，pH值4. 5左右，残糖O. 2%左右，即得到猴头菌丝体。优选的，三级罐得到的猴头菌丝体，用8 10米的喷雾干燥塔，118 121°C喷雾干燥，得猴头菌粉。与现有技术相比，本发明选用由中条山原始森林中的野生猴头菇经多年优化改良而培养成的特殊药用白猴菌种，采用液体深层发酵培养方法。本发明采用全封闭液体深层发酵技术培养猴头菌丝，与传统人工固体培养法相比，不但实现了猴头菌丝的生产由手工培养向标准化、工业化生产的突破，而且生产周期由传统培养方法的52天缩短为14天，节能降耗30%，生产成本降低70%。以此方法生产的猴头菌除含多糖多肽外，尚还含有五种异“ β -D-葡聚糖”，同葡萄糖、甘露醇和半乳糖等多种糖类结合，免疫活性高，有一定的抗癌作用，含有维生素Α、维生素Ε、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C等七种维生素，含有纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、愈创木酚酶和多酚氧化酶等活性纤维素酶，并含有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸等18种氨基酸及人体必需的微量元素等，其中药用价值较大的胱氨酸、组氨酸、精氨酸含量较多，氨基酸鉴别6 7个点、蛋白含量16. 65%，分别是其它猴头菌的3倍和I. 8倍。通过红外光谱检测还证实，除含有羟基氨化合物外，还含有一种一般猴头中没有的特殊抗癌有机酸。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。实施例I一种药用猴头菌菌丝体液体深层发酵培养方法，包括以下步骤下述物质的百分数均为重量百分数，(I).菌种的优化筛选及子实体分离采选中条山原始森林中的野生猴头菇中生长强壮、发育良好、没有病虫害、种子没散落的子实体；在接种室100级以上超净工作台内，将猴头菇子实体浸入75%的酒精中消毒2分钟，取出后用蒸馏水冲洗干净，再用消毒纱布擦干，将子实体放在培养皿上，用钟形罩或类似用具覆盖，室温保持在20°C，使子实体缓慢生长，过2天后，种子即散出来，落入培养皿中，然后用镊子蘸取落下的种子，用划线法接种于试管的斜面上培养，在25°C下培养4天种子即会萌发，待菌丝基本长满斜面时，选择色白、基内菌丝发达粗壮，菌束明显的即优良菌种，置入摇床瓶接种备用；培养皿中培养基组成如下
麦芽糖1%
蛋白胨1%
琼脂2%
硫酸庆大霉素1%
碳酸钙1%
黄豆粉2%
玉米棒1%
木屑1%
甘草药渣5%
棉籽壳2%加入余量的水，pH自然，121°C灭菌30分钟；(2).菌种的培养2. I配制培养基
玉米粉(60目)5%
黄豆粉(60目)3%
葡萄糖0.5%
硫酸镁O. 01%
磷酸ニ氢钾O. 01%
蛋白胨O. 5%
麦芽糖1%
硫酸庆大霉素1%加入余量的水，pH自然，121°C灭菌30分钟；
2. 2接种前，接种ロ应先用常规方法消毒，即用75%酒精浸泡过的脱脂棉球擦试，后开启臭氧发生器，使其出风ロ始终对着接种ロ，在接种ロ周围形成ー个局部无菌区，然后用消过毒的无毒橡胶管套于接种管口上，将经过孢子分离的摇床瓶菌种接入罐内，接种量为10%，全部过程均在无菌条件下进行，接种后开搅拌机，搅拌速度100转/分，恒温25°C，培养4天；镜检菌丝呈树枝状，无杂菌，外观有白球状；(3).液体深层培养3. I种子罐培养培养基为如下组成
土豆浸取液 10%
红糖 3%
玉米浆 1%
豆浆 1%
硫酸镁 0.05%
璘酸ニ氢钾 O. 05%
疏酸庆大霉素 1%
碳酸Φ51%加入余量的水，121°C灭菌30分钟；将步骤(2)培养好的菌种接种至种子罐，26°C培养3天，至结果为①.镜检菌丝呈树枝状，无杂菌；②.外观液体中有较多白球状粒；3. 2 ニ级罐培养培养基为如下组成
麸皮 5% (60目)
谷糠 1% (60目)
玉米面 1% (60目)
甘草药渣 1%
延胡索药渣1%
玉米棒 1%
棉籽壳 1%
木屑Th
加入余量的水，121 °C灭菌30分钟，将步骤3. 2培养好的菌种接种至二级罐，27°C，
培养2天；3. 3三级罐培养培养基为如下组成
麸皮 10% (60目)
谷糠 5% (60目)
玉米面 η 黄豆粉 Th 甘草药渣2%
棉籽壳 2%加入余量的水，121°C灭菌30分钟，将步骤3. 3培养好的菌种接种至三级罐，25°C培养4天，至培养液呈棕色，充满菌丝，pH值4. 5左右，残糖O. 2%左右，即得到猴头菌丝体。三级罐得到的猴头菌丝体，用10米的喷雾干燥塔，120°C喷雾干燥，得猴头菌粉。实施例2一种药用猴头菌菌丝体液体深层发酵培养方法，包括以下步骤下述物质的百分数均为重量百分数，(I).菌种的优化筛选及子实体分离采选中条山原始森林中的野生猴头菇中生长强壮、发育良好、没有病虫害、种子没散落的子实体；在接种室100级以上超净工作台内，将猴头菇子实体浸入75%的酒精中消毒I分钟，取出后用蒸馏水冲洗干净，再用消毒纱布擦干，将子实体放在培养皿上，用钟形罩或类似用具覆盖，室温保持在20°C，使子实体缓慢生长，过3天后，种子即散出来，落入培养皿中，然后用镊子蘸取落下的种子，用划线法接种于试管的斜面上培养，在22°C下培养5天种子即会萌发，待菌丝基本长满斜面时，选择色白、基内菌丝发达粗壮，菌束明显的即优良菌种，置入摇床瓶接种备用；培养皿中培养基组成如下麦芽糖1%
蛋白胨3%
琼脂2%
硫酸庆大霉素3%
碳酸钙1%
黄豆粉5%
玉米棒1%
木屑3%
甘草药渣5%
延胡索药渣10%
棉籽壳2%加入余量的水，pH值7. 5，118°C灭菌30分钟；(2).菌种的培养2. I配制培养基
玉米粉5%
黄豆粉5%
葡萄糖0.5%
硫酸镁O. 05%
磷酸ニ氢钾O. 01%
蛋白胨1%
麦芽糖1%
硫酸庆大霉素3%加入余量的水，pH为6，121°C灭菌28分钟；2. 2接种前，接种ロ应先用常规方法消毒，即用75%酒精浸泡过的脱脂棉球擦试，
后开启臭氧发生器，使其出风ロ始终对着接种ロ，在接种ロ周围形成ー个局部无菌区，然后
用消过毒的无毒橡胶管套于接种管口上，将经过孢子分离的摇床瓶菌种接入罐内，接种量
为11 %，全部过程均在无菌条件下进行，接种后开搅拌机，搅拌速度100转/分，恒温25°C，
培养3天；镜检菌丝呈树枝状，无杂菌，外观有白球状；(3).液体深层培养
3. I种子罐培养培养基为如下组成
土豆浸取液10%
红糖5%
玉米浆1%
豆浆3%
硫酸镁0.05% 嶙酸二氢钾1%
硫酸庆大霉素1%
碳酸钙3%加入余量的水，118°C灭菌32分钟；将步骤(2)培养好的菌种接种至种子罐，27°C，培养3天，至结果为①.镜检菌丝呈树枝状，无杂菌；②.外观液体中有较多白球状粒；3. 2 二级罐培养培养基为如下组成
麸皮10%
谷糠1%
玉米面3%
甘草药渣1%
延胡索药渣 3%
玉米棒1%
棉籽壳3%
木屑2%加入余量的水，121°C灭菌28分钟，将步骤3. 2培养好的菌种接种至二级罐，25°C，
培养3天；3. 3三级罐培养培养基为如下组成麸皮 10%
谷糠 10%
玉米面 2%
黄豆粉 5%
甘草药渣2%
棉籽壳 5%加入余量的水，118°C灭菌32分钟，将步骤3. 3培养好的菌种接种至三级罐，26°C 培养3天，至培养液呈棕色，充满菌丝，pH值4. 5左右，残糖O. 2%左右，即得到猴头菌丝体。实施例3ー种药用猴头菌菌丝体液体深层发酵培养方法，包括以下步骤下述物质的百分数均为重量百分数，(I).菌种的优化筛选及子实体分离采选中条山原始森林中的野生猴头菇中生长强壮、发育良好、没有病虫害、种子没散落的子实体；在接种室100级以上超净工作台内，将猴头菇子实体浸入75%的酒精中消毒2分钟，取出后用蒸馏水冲洗干净，再用消毒纱布擦干，将子实体放在培养皿上，用钟形罩或类似用具覆盖，室温保持在20°C，使子实体缓慢生长，过2天后，种子即散出来，落入培养皿中，然后用镊子蘸取落下的种子，用划线法接种于试管的斜面上培养，在25°C下培养4天种子即会萌发，待菌丝基本长满斜面时，选择色白、基内菌丝发达粗壮，菌束明显的即优良菌种，置入摇床瓶接种备用；培养皿中培养基组成如下麦芽糖3%
蛋白胨1%
琼脂3.5%
硫酸庆大霉素1%
碳酸钙3%
黄豆粉2%
玉米棒3%
木屑1%
甘草药渣10%
延胡索药渣5%
棉籽壳5%加入余量的水，pH值6，121°C灭菌25分钟；(2).菌种的培养2. I配制培养基
玉米粉10%
黄豆粉3%
葡萄糖1%
硫酸镁O. 01%
磷酸二氢钾O. 05%
蛋白胨0.5%
麦芽糖3%
硫酸庆大霉素1%加入余量的水，pH为7.5，121°C灭菌28分钟；2. 2接种前，接种口应先用常规方法消毒，即用75%酒精浸泡过的脱脂棉球擦试，
后开启臭氧发生器，使其出风口始终对着接种口，在接种口周围形成一个局部无菌区，然后
用消过毒的无毒橡胶管套于接种管口上，将经过孢子分离的摇床瓶菌种接入罐内，接种量
为9%，全部过程均在无菌条件下进行，接种后开搅拌机，搅拌速度100转/分，恒温25°C， 培养4天；镜检菌丝呈树枝状，无杂菌，外观有白球状；(3).液体深层培养
3.1种子罐培养培养基为如下组成
土豆浸取液 15%
红糖 3%
玉米浆 3%
豆浆 1%
硫酸镁 1%
磷酸ニ氢钾 O. 05%
硫酸庆大霉素 3%
碳睃钓1%加入余量的水，121°C灭菌28分钟；将步骤(2)培养好的菌种接种至种子罐，25°C，培养4天，至结果为①.镜检菌丝呈树枝状，无杂菌；②.外观液体中有较多白球状粒；3. 2 ニ级罐培养培养基为如下组成
麸皮5%
谷糠3%
玉米面1%
甘草药渣3%
延胡索药渣 1%
玉米棒3%
棉籽壳1%
木屑5%加入余量的水，118°C灭菌32分，将步骤3. 2培养好的菌种接种至ニ级罐，27°C，培养2天；3. 3三级罐培养培养基为如下组成麸皮 20%
谷糠 5%
玉米面 5%
黄豆粉 2%
甘草药渣5%
棉籽壳 2%加入余量的水，121°C灭菌28分钟，将步骤3. 3培养好的菌种接种至三级罐，25°C 培养4天，至培养液呈棕色，充满菌丝，pH值4. 5左右，残糖O. 2%左右，即得到猴头菌丝体。上述实施例2和实施例3所制得的猴头菌丝体，同样可采用如实施例I所述的干燥方式得到猴头菌粉。检测上述实施例I至实施例3得到的猴头菌丝体，结果与一般食用猴头菌相比，除含多糖多肽外，尚还含有五种异“ β -D-葡聚糖”，同葡萄糖、甘露醇和半乳糖等多种糖类结合，免疫活性高，有一定的抗癌作用，含有维生素Α、维生素Ε、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C等七种维生素，含有纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、愈创木酚酶和多酚氧化酶等活性纤维素酶，并含有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸等18种氨基酸及人体必需的微量元素等，其中药用价值较大的胱氨酸、组氨酸、精氨酸含量较多，氨基酸鉴别6 7个点、蛋白含量16. 65%，分别是其它猴头菌的3倍和I. 8倍。通过红外光谱检测还证实，除含有羟基氨化合物外，还含有一种一般猴头中没有的特殊抗癌有机酸。同时上述各实施例的生产周期为14±2天，远比传统培养方法的52天的周期短，节能降耗30%，生产成本降低70%。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种药用猴头菌菌丝体液体深层发酵培养方法，包括以下步骤下述物质的百分数均为重量百分数， (1).菌种的优化筛选及子实体分离 采选中条山原始森林中的野生猴头菇中生长强壮、发育良好、没有病虫害、种子没散落的子实体； 在接种室100级以上超净工作台内，将猴头菇子实体浸入75%的酒精中消毒I 2分钟，取出后用蒸馏水冲洗干净，再用消毒纱布擦干，将子实体放在培养皿上，用钟形罩或类似用具覆盖，室温保持在20°C，使子实体缓慢生长，过2 3天后，种子即散出来，落入培养皿中，然后用镊子蘸取落下的种子，用划线法接种于试管的斜面上培养，在22 25°C下培养4 5天种子即会萌发，待菌丝基本长满斜面时，选择色白、基内菌丝发达粗壮，菌束明显的即优良菌种，置入摇床瓶接种备用； 培养皿中培养基组成如下
2.如权利要求1所述培养方法，其特征在于三级罐得到的猴头菌丝体，用8 10米的喷雾干燥塔，118 121°C喷雾干燥，得猴头菌粉。
全文摘要
本发明公开了一种药用猴头菌菌丝体液体深层发酵培养方法，得到的猴头菌丝体，结果与一般食用猴头菌相比，除含多糖多肽外，尚含五种抗癌物质、七种维生素、三种活性纤维素酶、18种氨基酸及人体必需的微量元素等，其中药用价值较大的胱氨酸、组氨酸、精氨酸含量较多，氨基酸鉴别6～7个点、蛋白含量16.65％，分别是其它猴头菌的3倍和1.8倍。红外光谱还证实，除含有羟基氨化合物外，还含有一种一般猴头中没有的特殊抗癌有机酸。与传统人工固体培养法相比，不但实现了猴头菌丝的生产由手工培养向标准化、工业化生产的突破，而且生产周期由传统培养方法的52天缩短为14天，节能降耗30％，生产成本降低70％。
文档编号C05G3/00GK102835251SQ20121033284
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者史长山, 姜存敏, 潘志明, 王俊俊 申请人:史长山