专利名称：应用抗除草剂突变性状提高杂交油菜种植纯度的方法
技术领域：
本发明涉及应用抗除草剂突变性状提高杂交油菜种植纯度的方法，属于植物育种方法。具体涉及抗除草剂性状的转育、抗性恢复系筛选、抗性组合制种生产和杂交种种植纯度鉴定等方法。
背景技术：
利用杂种优势可大幅度提高油菜产量。油菜杂种优势利用成功与否取决于两个重要条件，一是要有合适的遗传交配系统，二是具备高效经济的杂种制种技术。目前我国杂交油菜生产上应用的遗传交配系统主要有两类，细胞质雄性不育系统和细胞核雄性不育系统。前者因不育细胞质对低温敏感，早期花朵会产生微量花粉，从而影响制种纯度，有些年 份会给油菜生产带来不利影响，造成严重后果。后者因不育系繁殖或制种过程中必须拔除可育株，增加了杂种生产的难度和成本，而且人工去除技术要求高，难免有遗漏。杂种纯度是制约杂交油菜增产潜力的重要因素，试验表明杂交种纯度每下降一个百分点，产量水平下降1%左右，提高杂交油菜的制种纯度，最大限度地发挥其产量水平，一直是油菜育种工作者努力的目标之一。应用形态标记性状区分真假杂种，通过苗床间苗、定苗和移栽时甄别可有效提高杂交油菜的种植纯度。如宁杂花叶是江苏省农业科学院经济作物研究所选育的我国第一个具有花叶标记性状的双低杂交油菜新组合，田间种植纯度试验表明，去除杂株后，花叶杂交油菜的田间种植纯度达到95. 54%。可见，利用标记性状是提高细胞质雄性不育“三系”杂种纯度的有效措施。抗除草剂基因的开发、应用成功，为克服细胞质雄性不育系统的缺点提供了崭新途经。如将EPSPS基因导入油菜细胞质雄性不育恢复系中，应用具有抗草甘膦除草剂性状的恢复系生产的杂交种，F1真杂种具有抗草甘膦特性，而胞质不育系的微量花粉自交株以及其它外来花粉污染株和各种机械混杂植株均不具有抗性，在油菜苗期喷施草甘膦可将各种类型的假杂种一次性全部杀死去除，为区分真假杂种提供了简便、高效的鉴别方法，可大大提高杂交油菜的制种效率和种植纯度。但我国转基因抗除草剂油菜尚未获准商业化种植，主要有以下两个原因首先，转基因作物进入商业化生产必须要通过严格的安全性评价，油菜为常异花授粉作物，花粉传播以风媒和虫媒为主，抗除草剂基因可能会通过花粉漂移将抗性基因转移到油菜可交配的近缘植物上并使其获得抗性，油菜是需要特别关注的作物之一。其次，到目前为止国内关于转基因抗除草剂油菜的研究材料基本都来自国外，抗性基因受国际知识产权保护，一旦商业化种植，要向专利拥有者交纳昂贵的专利费，这将大幅度提高油菜生产成本。2004年，我们在油菜和大豆多年轮作的试验田中发现了自然突变的抗咪唑啉酮类除草剂的油菜新种质M9，经多年试验鉴定，该突变体抗性性状稳定、抗性效应明显，抗咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸的浓度是咪唑乙烟酸有效杀草浓度的2倍以上，具有实用价值。遗传研究表明，该突变体的咪唑啉酮抗性为显性性状，由I对核基因控制，抗性基因在F2和BC1群体中遵循孟德尔遗传规律，应用杂交、回交等常规育种方法就可将抗性基因导入目标品种，为选育具有自主知识产权且不受转基因油菜环境释放条件限制的抗除草剂油菜新品种奠定了基础。本发明应用江苏省农业科学院经济作物研究所发现的抗咪唑啉酮类除草剂天然突变体材料M9，将抗性性状转育到细胞质雄性不育恢复系中，利用抗咪唑啉酮类除草剂恢复系选育的杂交种，为非转基因品种，不受环境释放限制，且具有自主知识产权，可直接应用于大面积生产。
发明内容
技术问题
本发明能够弥补已有专利或技术的不足，提供了一种提高细胞质雄性不育杂交种种植纯度的方法。 技术方案
一种应用抗除草剂突变性状提高杂交油菜种植纯度的方法，包括步骤
A、抗性性状转育以抗咪唑啉酮天然突变材料为父本，细胞质雄性不育恢复系为母本，配制杂交组合；对杂交F1代进行小孢子苗培养，获得DH群体；苗期喷施咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸，有效剂量为90ga. i. /hm2，筛选抗性植株，将抗咪唑啉酮性状转育到细胞质雄性不育恢复系中，获得转育的具有抗咪唑啉酮性状的后代株系；
B、抗性组合选配以细胞质雄性不育系为母本，对转育的具有抗咪唑啉酮性状的后代株系进行测交，选配恢复率达到100%且具有抗性性状的恢复系；高产组合配制生产杂交种，获得具有咪唑啉酮抗性的杂种F1 ；
C、提高种植纯度种植抗性杂种F1;对抗性杂交种F1苗期喷施有效剂量为90ga. i. /hm2的咪唑乙烟酸除草剂，将不具有抗性的不育系微量花粉自交株、外来花粉污染株及各种机械混杂植株等假杂种一次性杀死去除，达到提高种植纯度的目的。所述的方法在选育抗除草剂杂交油菜新组合方面的具体应用，其特征在于
1)以抗咪唑啉酮类除草剂天然突变体M9为父本，细胞质雄性不育双低恢复系N340为母本，配制杂交组合，当年秋播种植(N340XM9)组合，油菜苗期喷施咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸，有效剂量为90ga. i. /hm2,去除假杂种和田间自生苗，取抗性植株花蕾进行小孢子苗培养；小孢子培养于每日上午摘取刚开放朵花的花序置于4°C恒温冰箱24h，次日挑选长度为4. 5_左右的花蕾用70%酒精浸泡30s，I %升汞表面消毒lOmin，无菌水冲洗3次，每次冲洗2min。将消毒花蕾置于无菌玻璃管中，加B5提取液1ml，用玻璃棒沿管壁将花蕾捣碎挤出小孢子，经400目滤膜过滤，1000rpm/min离心5min，去除上清液后再加入B5提取液悬浮小孢子，复重I次，去除上清液，加入NLN-13 (13%蔗糖)培养液转入三角瓶中。32°C热激培养24h，25 °C黑暗静止培养，直至出现可见的小白点胚状体时，转至25 °C恒温摇床50r/min振荡培养，待胚状体长度达5mm时转到B5固体培养基上，25°C光照培养，每天光照时间16小时，直至成苗。当年秋季将单倍体小孢子苗用2%秋水仙碱溶液浸泡根部30min后栽入盆钵，活棵后长至5-6叶期移栽到大田，菜苗成活后用有效剂量为90ga. i./hm2的咪唑乙烟酸进行除草剂抗性筛选，获得抗除草剂的DH株系群体；
2)将具有除草剂抗性的DH株系与细胞质雄性不育系宁A7进行测交配组，当年秋播种植测交组合，选配恢复率达到100%且具有抗性性状的恢复系；
3)用上述抗性恢复系与不育系宁A7生产抗性杂交种F1；4) F1杂种苗期喷施一次90ga. i. /hm2的咪唑乙烟酸除草剂，提高杂种F1种植纯度。有益效果
本发明通过上述方法，可大大提高了细胞质雄性不育杂交种的种植纯度，同时可有效降低细胞质雄性不育三系杂交种生产对制种环境的要求。
A :应用杂交、回交、自交等常规育种手段可将M9抗性性状导入到细胞质雄性不育恢复系中，并通过苗期喷施咪唑啉酮类除草剂鉴定抗性性状，方法简便，效果明显，结果可
OB :利用导入抗性性状的恢复系与细胞质雄性不育系制种，可在不同生产环境的制种基地进行，只要对抗性杂交种苗期喷施咪唑啉酮类除草剂，就能大幅度提高细胞质雄性不育杂交种的种植纯度。C :咪唑啉酮类除草剂的使用浓度可用除草推荐浓度，虽然M9抗咪唑啉酮类除草剂的浓度是除草剂有效杀草浓度的2倍以上，但高剂量使用咪唑啉酮类除草剂会抑制油菜苗期生长，增加土壤除草剂残留，影响下茬作物生长。本发明只要对导入咪唑啉酮抗性性状的油菜杂交种在苗期一次性喷施咪唑啉酮类除草剂，就能将不育系的微量花粉自交株、外来花粉污染株和各种机械混杂植株等各类假杂种一次性杀死去除，保留具有抗咪唑啉酮性状的真杂种，这将大大提高了细胞质雄性不育杂交种的种植纯度，最大限度地发挥其杂交种的增产潜力，提高产量水平。同时油菜苗期喷施咪唑啉酮类除草剂可兼顾田间杂草防治，节省田管劳力，提高经济效益。
图为细胞质雄性不育抗除草剂杂交油菜选育方法及其应用示意图
具体实施例方式实施例抗咪唑啉酮类除草剂杂交油菜新组合的选育及在不同生产环境中配制的杂交种种植纯度鉴定。A :2007年春，以抗咪唑啉酮类除草剂天然突变体M9 (浦惠明，高建芹，龙卫华，胡茂龙，张洁夫，陈松，陈新军，陈锋，顾慧，傅三雄，戚存扣，油菜抗咪唑啉酮性状的遗传及其应用，中国油料作物学报，2011，33 (I) : 15-19)为父本，细胞质雄性不育双低恢复系N340 (浦惠明，高建芹，龙卫华，胡茂龙，张洁夫，陈松，陈新军，陈锋，顾慧，傅三雄，戚存扣，油菜抗咪唑啉酮性状的遗传及其应用，中国油料作物学报，2011,33(1) :15-19)为母本，配制抗性杂交组合。当年秋播种植(N340XM9)组合，油菜苗期喷施咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸，有效剂量为90ga. i./hm2，去除假杂种和田间自生苗。2008年春，选择生长势强、越冬期冻害轻、抽薹期春发性好的(N340XM9) F1植株从主花序和倒一、倒二花序上摘取部份花蕾进行小孢子苗培养。B ;小孢子培养于每日上午摘取刚开放朵花的花序置于4°C恒温冰箱24h，次日挑选长度为4. 5mm左右的花蕾用70%酒精浸泡30s，I %升汞表面消毒lOmin，无菌水冲洗3次，每次冲洗2min。将消毒花蕾置于无菌玻璃管中，加B5提取液lml，用玻璃棒沿管壁将花蕾捣碎挤出小孢子，经400目滤膜过滤，1000rpm/min离心5min，去除上清液后再加入B5提取液悬浮小孢子，复重I次，去除上清液，加入NLN-13(13%蔗糖)培养液转入三角瓶中。32°C热激培养24h，25°C黑暗静止培养，直至出现可见的小白点胚状体时，转至25°C恒温摇床50r/min振荡培养，待胚状体长度达5mm左右时转到B5固体培养基上，25°C光照培养，每天光照时间16小时，直至成苗。当年秋季将单倍体小孢子苗用2%秋水仙碱溶液浸泡根部30min后栽入盆钵，活棵后长至5-6叶期移栽到大田，获得DH株系群体。菜苗成活后用有效剂量为90ga. i. /hm2的咪唑乙烟酸进行除草剂抗性筛选。C :2009年春将具有除草剂抗性的DH株系与细胞质雄性不育系宁A7 (浦惠明，戚存扣，傅寿仲，张洁夫，伍始美，高建芹，陈新军，甘蓝型双低油菜细胞质雄性不育系宁A7的选育研究I. MICMS双低不育系宁A7的回交选育，江苏农业学报，2001，17(2) :69-72)进行测交配组，筛选DH恢复株系。当年秋播种植测交组合，通过恢复率、丰产性等性状筛选于2010年春获得恢复率高、丰产性好的抗咪唑啉酮类除草剂恢复系，定名为10M169。D :2010年秋用抗性恢复系10M169与不育系宁A7用3种方法生产抗性杂交种。(I)人工杂交制种。油菜花蕾期将不育系宁A7花蕾剥开，授予10M169花粉后，套袋隔离。(2)网 罩隔离制种。在网室间隔种植母本不育系宁A7和父本恢复系10M169，油菜开花前用60目尼龙网罩隔离。(3)天然授粉制种。将不育系宁A7种植于恢复系育种大田，四周种植父本10M169，油菜开花后任其天然传粉。2011年春获得用3种不同方法生产的(宁八7\1011169)F1杂交种。E :2011年秋播同时种植用3种不同制种方法获得的F1杂种，苗期喷施有效剂量为90ga. i. /hm2的咪唑乙烟酸除草剂，以不喷为对照，进行种植纯度的比较试验。2012年春油菜花期调查结果表明，人工剥蕾杂交制种，杂种F1纯度达到100%。网罩隔离制种由于母本开花早期有微量花粉，其自交株为不育株，严重影响制种纯度，本试验制种纯度为83. 51%。但在油菜苗期喷施除草剂后，可将大部份不具有抗性的微粉自交株杀死去除，使种植纯度提高到96. 92%，比不喷除草剂的种植纯度提高了 13. 41%。天然授粉制种除母本微粉自交不育株影响杂种纯度外，不育系周边环境中的其它油菜花粉也会影响杂种纯度，本试验制种纯度仅为79. 35%。但在油菜苗期喷施除草剂后，种植纯度提高到95. 76%，比不喷除草剂的种植纯度提高了 16. 41%(见附表)。实践证明，将抗咪唑啉酮类除草剂的抗性性状转育到细胞质雄性不育恢复系中，用抗性恢复系生产的杂交种只要在油菜苗期一次性喷施咪唑啉酮类除草剂，就可将胞质不育系的微量花粉自交不育株、外来花粉污染株和各种机械混杂株等不具有抗性的假杂种杀死去除,大大提高了抗性杂交油菜的种植纯度,最大限度地发挥其杂交种的增产潜力和产量水平。同时油菜苗期喷施咪唑啉酮类除草剂可兼顾田间杂草防治，节省田管劳力，提高种植油菜的综合经济效益，一举两得。
抗除草剂杂交油菜苗期喷施除草剂对种植纯度的影响
权利要求
1.一种应用抗除草剂突变性状提高杂交油菜种植纯度的方法，包括步骤 A、抗性性状转育以抗咪唑啉酮天然突变材料为父本，细胞质雄性不育恢复系为母本，配制杂交组合；对杂交F1代进行小孢子苗培养，获得DH群体；苗期喷施咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸，有效剂量为90ga. i. /hm2，筛选抗性植株，将抗咪唑啉酮性状转育到细胞质雄性不育恢复系中，获得转育的具有抗咪唑啉酮性状的后代株系； B、抗性组合选配以细胞质雄性不育系为母本，对转育的具有抗咪唑啉酮性状的后代株系进行测交，选配恢复率达到100%且具有抗性性状的恢复系；以细胞质雄性不育系为母本配制生产杂交种，获得具有咪唑啉酮抗性的杂种F1 ； C、提高种植纯度种植抗性杂种F1;对抗性杂交种F1苗期喷施有效剂量为90ga. i. /hm2的咪唑乙烟酸除草剂，将不具有抗性的不育系微量花粉自交株、外来花粉污染株及各种机械混杂植株等假杂种一次性杀死去除，达到提高种植纯度的目的。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于 1)以抗咪唑啉酮类除草剂天然突变体M9为父本，细胞质雄性不育双低恢复系N340为母本，配制杂交组合，当年秋播种植N340XM9组合，油菜苗期喷施咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸，有效剂量为90ga. i. /hm2,去除假杂种和田间自生苗，取抗性植株花蕾进行小孢子苗培养；小孢子培养于每日上午摘取刚开放朵花的花序置于4°C恒温冰箱24h，次日挑选长度为4. 5mm左右的花蕾用70%酒精浸泡30s，I %升汞表面消毒lOmin，无菌水冲洗3次，每次冲洗2min ； 将消毒花蕾置于无菌玻璃管中，加B5提取液Iml，用玻璃棒沿管壁将花蕾捣碎挤出小孢子，经400目滤膜过滤，1000rpm/min离心5min，去除上清液后再加入B5提取液悬浮小孢子，复重I次，去除上清液，加入NLN-13(13%蔗糖)培养液转入三角瓶中； ·32 0C热激培养24h，25 °C黑暗静止培养，直至出现可见的小白点胚状体时，转至25 °C恒温摇床50r/min振荡培养，待胚状体长度达5mm时转到B5固体培养基上，25°C光照培养，每天光照时间16小时，直至成苗； 当年秋季将单倍体小孢子苗用2%秋水仙碱溶液浸泡根部30min后栽入盆钵，活棵后长至5-6叶期移栽到大田，菜苗成活后用有效剂量为90ga. i. /hm2的咪唑乙烟酸进行除草剂抗性筛选，获得具有除草剂抗性的DH株系群体； 2)将具有除草剂抗性的DH株系与细胞质雄性不育系宁A7进行测交配组，当年秋播种植测交组合，选配恢复率达到100%且具有抗性性状的恢复系； 3)用上述抗性恢复系与不育系宁A7生产抗性杂交种F1； 4)F1杂种苗期喷施一次90ga. i. /hm2的咪唑乙烟酸除草剂，提高杂种F1种植纯度。
全文摘要
本发明提供了一种应用抗除草剂突变性状提高杂交油菜种植纯度的方法，属于植物育种方法。应用常规育种技术将抗咪唑啉酮类除草剂的抗性性状转育到细胞质雄性不育恢复系中，利用抗性恢复系选配杂交油菜新组合，新组合F1杂种种植时在苗期一次性喷施咪唑啉酮类除草剂，就可将不育系的微量花粉自交株、外来花粉污染株和各种机械混杂植株等不具有抗性的假杂种全部杀死去除，从而大幅度提高杂交油菜的种植纯度，最大限度地发挥杂交种的增产潜力和产量水平。
文档编号A01H1/06GK102948365SQ20121049756
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者浦惠明, 胡茂龙, 高建芹, 龙卫华, 张洁夫, 陈松, 陈锋, 付三雄, 戚存扣 申请人:江苏省农业科学院