专利名称：一种变形链球菌感染及致龋动物模型建立方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种变形链球菌感染及致龋动物模型建立方法。
背景技术：
龋病是人类最普遍的疾病之一，发病率高，WHO将其与癌症和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。世界卫生组织最新发布的《全球口腔健康报告》中，估计全球63亿人口有50亿人患过龋齿，在发达国家中60% 90%的学龄儿童和大部分成人患过龋齿，在我国成人发病率为50%，全世界6(Γ90%的学龄儿童和近100%的成年人有龋齿，它已然成为威胁人类口腔健康的全球性问题。自20世纪80年代以来，各国均投入大量资金研究龋病。龋病动物模型模拟人体致病环境，为研究龋病的致病机理、发病过程及防治提供了重要的药理研究依据。建立龋病动物模型，通过药理药效实验研究，很好地阐释防治龋齿药物的作用机理，为研究新的龋病防治方法提供保障。作为龋病研究的重要手段，龋病动物模型研究受到人们的广泛关注。近年来，国内外研究者对龋病动物模型展开了大量的实验，分别用恒河猴、豚鼠、兔、小型猪、仓鼠、大鼠等建立动物模型。啮齿动物(鼠和仓鼠类)及灵长类动物对龋病易感，猴类的生理结构特征与人类非常接近，作为实验动物最为理想，但由于数量少，价格贵，其广泛受到限制。鼠和仓鼠类啮齿动物体积小，便于大量地应用于实验、重复性好；同时，形成龋损速度相对较快，能近似模拟人类龋病，目前已广泛用于实验研究。变形链球菌(S.mutans)作为最主要的致龋菌广泛地应用在实验性动物龋病模型的建立上(樊明文主编，口腔医学新进展，湖北科技出版社，1993。Madison KM, et al.J Dent Res, 1991, 70:38)
动物模型除采用单一变形链球菌感染SD大鼠外，还有采用混合菌感染大鼠，如 Ooshima 等(Ooshima T, et al.Caries Res, 1991, 25:138.0oshima T, et al.CariesRes, 1992，26:124)将30天鼠龄的无菌SD大鼠利用外科手术方法摘除其颌下腺和舌下腺并结扎腮腺导管，手术后24 28天连续5天感染S.mutans MT8148、血链球菌ST3R和唾液链球菌HT3R。同时，饲以Keyes2000#致龋饮食，于84天鼠龄结束实验时，大鼠大部分磨牙均产生严重龋坏。无论单一菌还是混合菌感染动物，制作动物模型，细菌均可定植于牙齿，且导致明显的龋病。但这种方法需要做复杂的手术，而且摘除颌下腺和舌下腺并结扎腮腺导管对口腔生理改变很大，不适用于正常大鼠口腔环境的致龋研究及模拟人体的的致龋过程。虽然已有很多关于龋齿动物模型的报道，但是以往的动物模型依然存在很大的问题。首先，细菌感染定植不稳定，定植量也均一，随时间的延长，细菌容易自然清除，而且龋坏不明，显难以达到实验的要求。S.mutans在SD大鼠牙齿表面感染初期主要是依靠其自身的粘附能力定植，感染菌液在口腔和牙齿表面的停留时间与感染成功率成正比。卡波姆是1950年由美国Goodrich公司生产,在1957年就被英美等国家的药典收载，在我国2000年被药典收载至今。卡波姆中存在大量的可形成氢键的羧基，而氢键是粘附机制的组成部分，高度离子化可形成更好的粘附性。同时，其被中和使羧基离子化后，由于负电荷的相互排斥作用，使分子链弥散伸展，呈极大的膨胀状态，并具粘性。聚合物膨胀的越快，它与粘蛋白发生作用就越快，从而保证了强的粘性(翁升，生物黏附制剂的黏附机制及其新剂型的发展近况，海峡药学，2008，20 (7):31-33)。卡波姆目前主要用于眼用生物粘附剂、鼻内生物粘合剂、颊部生物粘合剂、阴道生物粘合剂、直肠内生物粘合剂和胃肠道生物粘合剂。姚悦等以卡波姆940为基质，研制了具有一定粘稠度和粘附性的草酸钾凝胶，可明显延长药物在口腔的滞留时间，疗效增强(姚悦，李煜，钟良军等，草酸钾凝胶的研制与治疗牙本质敏感症的临床观察，实用口腔医学杂志，2007，23 (4):593-595)。针对S.mutans感染初期的粘附定植的特点，本发明用增稠剂卡波姆940与
S.mutans混合，通过提高菌液粘稠度，增加菌液在口腔和牙齿表面的停留时间，从而增加
S.mutans的感染定植量。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种S.mutans感染及致龋动物模型建立方法，采用卡波姆940作为增稠剂，增加感染菌液粘稠度，提高感染效率，增强致龋效果。一种S.mutans感染及致龋动物模型的建立方法，包括如下步骤:(I)卡波姆940溶液配制用0.9%NaCl配制0.02% 1.0%卡波姆940溶液，调pH至7.0 ;(2)动物感染菌液制备取新鲜培养的 S.mutans,调整菌液浓度为2X 108CFU/mL 2X 10nCFU/mL，与步骤
(I)制备的卡波姆940溶液等体积混合用于感染；(3) S.mutans 感染 SD 大鼠SPF级6周龄SD大鼠，抗生素饮水喂饲3天后，取步骤(2)感染菌液滴于牙面及口腔；(4)形成模型喂饲致龋饲料70-90天后，形成致龋模型。所述致龋饲料的组成为:全麦粉6%，蔗糖56%，精炼奶粉28%，苜蓿叶粉3%，脱水全肝粉1%，酵母4%，盐2%，喂饲致龋饲料80天。所述调pH采用IM氢氧化钠溶液。所述卡波姆940溶液浓度为0.4%，菌液浓度为2 X 101(lCFU/mL。所述抗生素饮水中含有lg/L氯霉素、lg/L氨苄青霉素、lg/L羧苄青霉素。本领域技术人员根据本发明提供的S.mutans感染及致龋动物模型制作方法，能够制作S.mutans感染及致频动物模型,用于S.mutans感染和频病防治的研究。本发明通过变形链球菌与卡波姆940混合，口腔感染SD大鼠，感染条件易控，感染率高(大于90%)，感染稳定。用该方法感染SD大鼠并饲喂高糖饲料，可引起显著的龋坏。
图1为实验组SD大鼠牙齿照片图2为对照组SD大鼠牙齿照片图3为空白组SD大鼠牙齿照片
具体实施例方式实施例1、S.mutans感染及致龋动物模型建立(I)卡波姆溶液配制0.4%卡波姆940溶液:称取0.4g卡波姆940，加0.9%NaC190ml，IM氢氧化钠调pH至7.0,加0.9%NaCl定容至100ml,混勻，高温高压灭菌,冷却后备用。(2)动物感染菌液制备S.mutans培养:取S.mutans UA159 (购自美国标准菌种收藏所American TypeCulture Collection, Streptococcus mutans ATCC 700610 ), BHI 平板(Brain Heartinfusion, BDBacto , LOT:7128153)复苏，37°C微需氧(85%N2，8%C02，5%02)培养 48h。挑取单个菌落接种5ml BHI培养基，37°C微需氧250rpm振荡培养24h，1:100转种扩大培养6_7h。调节菌液浓度为2X 10lclCFU/mL。 动物感染菌液及对照菌液配制:取等体积0.4%卡波姆940溶液与S.mutans菌液混合，摇匀备用；取等体积0.9%NaCl与S.mutans菌液混合作为对照菌液；取等体积0.4%卡波姆940溶液与BHI培养基混合作为空白对照。(3) S.mutans 感染 SD 大鼠抗生素饮水配制(lg/L氯霉素、lg/L氨苄青霉素、lg/L羧苄青霉素):称取Ig的氯霉素,加入IOml无水乙醇溶解，逐滴加入900ml双蒸水中，边加边搅拌。分别称取氨苄青霉素和羧苄青霉素各Ig加入其中，混 匀，双蒸水定容至1L，超滤除菌作为大鼠饮水。动物分组:SPF级6周龄SD大鼠，90只，雌雄各半。分为实验组、对照组和空白组，每组各30只，雌雄各半。饲喂致龋饲料(全麦粉6%，蔗糖56%，精炼奶粉28%，苜蓿叶粉3%，脱水全肝粉1%，酵母4%，盐2%)。S.mutans感染大鼠:抗生素饮水3天后，更换正常饮水。大鼠麻醉后，实验组吸取上述感染菌液200 μ L滴于牙面及口腔，对照组滴200 μ L对照菌液，空白组滴200 μ L空白对照液。(4)感染鉴定于感染后80天取标本检测。SD大鼠麻醉后，用无菌棉签涂抹大鼠牙面，接种MSB平板，微需氧培养48tT72h，观察培养结果。平板上见蓝色、干燥、粗糙、突起菌落为S.mutans培养阳性。培养鉴定结果见表I。表I感染80天后S.mutans培养鉴定结果
mi阳性率(%)
实验组96J-
对照组36 7
空白组O结果表明:感染80天后，实验组S.mutans培养阳性率为96.7%，对照组为36.7%，空白组全为阴性。加卡波姆的感染组阳性率明显高于对照组，且S.mutans感染稳定，感染后80天培养检测S.mutans感染率仍>90%。
(5)龋齿评分细菌接种80天后，麻醉后颈椎脱白处死大鼠。剪取大鼠头颅置高压蒸气锅处理5分钟，去除软组织，分离上下颌骨，清洗后室温干燥。将干燥后的颌骨置于0.4% (W/V)紫脲酸铵溶液中染色24h，彻底清洗后60°C避光干燥。沿咬合面近远中向片切，体视显微镜下进行龋齿评分，每个样本重复3次，由同一实验者完成。按Keyes龋齿评分标准，将SD大鼠上下颌磨牙分为若干牙面单位。按照龋损程度可分为四级:釉质龋(enamel，E)指龋坏仅累及牙釉质；轻度牙本质龋(DS)指龋坏累及牙釉质及牙本质外层1/4以内；中度牙本质龋(DM)指龋坏累及牙釉质及牙本质外层1/4-3/4之间；重度牙本质龋(DX)指龋坏累及牙釉质及牙本质厚度3/4。为便于统计，将大鼠上下领磨牙各面分为若干牙面单位，根据每实验组每牙面龋损破坏范围统计为不同单位数，即为龋分值，将每只动物相同牙面的龋分值相加为此牙面的总龋分。结果表明:实验组多数可见重度牙本质龋(图1 )，对照组以中度牙本质龋为主(图2)，空白组偶见轻度牙本质龋和釉质龋(图3)。经统计学分析(t检验)，实验组与对照组及空白组比较，龋齿评分有显著差异(*:与对照组相比较，p〈0.01 ；#:与空白组相比较，p〈0.01)，(表2)。结果表明:实验组大鼠龋齿发生率及龋损程度显著高于对照组及空白组，该方法制作的变形链球菌感染动物模型可弓I起显表2SD大鼠经S.mutans感染80天后的龋分值(总龋分平均值土标准差)
权利要求
1.一种S.mutans感染及致龋动物模型的建立方法，包括如下步骤: (1)卡波姆940溶液配制 用0.9%NaCl配制0.02% 1.0%卡波姆940溶液，调pH至7.0 ; (2)动物感染菌液制备 取新鲜培养的S.mutans，调整菌液浓度为2 X 108CFU/mL^2 X 10nCFU/mL,与步骤(I)制备的卡波姆940溶液等体积混合用于感染； (3)S.mutans 感染 SD 大鼠 SPF级6周龄SD大鼠，抗生素饮水喂饲3天后，取步骤(2)感染菌液滴于牙面及口腔； (4)形成模型 喂饲致龋饲料70-90天后，形成致龋模型。
2.根据权利要求1所述的建立方法，所述致龋饲料的组成为:全麦粉6%，蔗糖56%，精炼奶粉28%，苜蓿叶粉3%，脱水全肝粉1%，酵母4%，盐2%，喂饲致龋饲料80天。
3.根据权利要求1所述的建立方法，所述感染菌液的组成为:所述卡波姆940溶液浓度为0.4%，菌液浓度为2X 10lclCFU/mL。
4.根据权利要求1所述的建立方法，所述感染方法为先用抗生素溶液清除大鼠口腔杂菌:所述抗生素饮水中含有lg/L氯霉素 、lg/L氨苄青霉素、lg/L羧苄青霉素，喂饲抗生素饮水3天。
全文摘要
本发明公开了一种变形链球菌感染及致龋动物模型建立方法，属于微生物学技术领域。通过变形链球菌口腔感染，80天后采标本，利用平板培养方法鉴定变形链球菌感染，染色观察龋坏并进行齿评分。本发明通过变形链球菌与卡波姆940混合，口腔感染SD大鼠，感染条件易控，感染率高(大于90%)，感染稳定。用该方法感染SD大鼠并饲喂高糖饲料，可引起显著的龋坏。
文档编号A01K67/027GK103099820SQ201210558790
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年11月21日
发明者刘开云, 邹全明, 郭刚, 张卫军, 孙红武, 付强, 付启欢, 程子洋, 樊绍文, 卢陆 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学