专利名称：早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及ー种植物组织培养及快速繁殖的方法，属于植物组培エ厂化快速育苗的方法技术领域。
背景技术：
早开堇菜(V iola prionantha Bunge)为堇菜科堇菜属多年生草本植物。其返青早，生长迅速，覆盖地面能力強，花期集中，一年内春秋两季均可开花，抑制杂草能力较强，作为早春野生开花地被植物，有较好的观赏效果及园林应用价值。
同时早开堇菜具有较高的药用价值，民间广泛用于痈疽疮毒、毒蛇咬伤等，它具有较强的抗菌、消炎、清热解毒作用。早开堇菜主要靠种子繁殖和根状茎繁殖，但是两种繁殖方式的繁殖率都比较低，不能满足作为地被植物用量大的需求。种子在萌发过程中对温度十分敏感，最适发芽温度为25°C，在高温下(>30°C )种子变褐色并霉烂，在低温下(<20°C )萌发及生长缓慢或停止生长，这都限制了早开堇菜的大量繁殖。早开堇菜作为野生地被植物，尚未得到开发，药源以采挖野生资源为主，资源渐少，目前早开堇菜的组织培养尚未见报道，单纯的靠野生资源并不能满足需要。因此进行早开堇菜组织快繁体系研究具有很好的发展前景，不但能够及时保护发展这一野生资源，实现可持续利用；而且还能通过组织培养的快速繁殖满足城市园林绿化对地被植物需求量大的要求。早开堇菜作为早春地被植物被广泛应用于我国城市园林绿化之中，将进ー步丰富我国的地被植物景观。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法。本发明的技术方案如下早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，其关键方法參数如下1.1早开堇菜外植体最佳灭菌方式1.1.1子叶节最佳的消毒方式是75%こ醇消毒30s，0. 1%升汞消毒时间在4min。1.1. 2叶片和叶柄最佳的消毒方式是75%こ醇消毒30s、0. 1%升汞消毒8min。1.2初代培养1.2.1在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的最适培养基为MS+ 6-BA 3. Omg じ1+ NAA 0. 2 mg じ1 ;叶柄诱导不定芽的最适培养基为MS + 6-BA3. 5mg じ1 + NAA 0. 2 mg じ1，叶片不适合作为直接诱导不定芽的外植体。1. 2. 2三种外植体均能诱导产生愈伤组织，子叶节诱导产生愈伤组织的时间最短，其次为叶柄，叶片最晚。1.2.3子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂组合为MS +6-BA1. 5 mg じ1 + 2，4_D1. 5 mg じ1 ；1.3继代培养1. 3.1丛生芽和不定芽增殖的最佳培养基为MS + 6-BA 3. 5 mg じ1 + NAA 0. 2mg L o1. 3. 2三种外植体愈伤组织继代增殖培养的最优组合是MS + 6-BA1. 5 mg じ1+ 2，4-D 0. 75 mg じ1 + NAA1. 0 mg じ1，1. 3. 3早开堇菜愈伤组织分化的最佳培养基为MS + 6-BA 3. 0 mg じ1 + NM 0. 3mg じ1 ；1. 4生根培养 将在不添加任何激素的MS培养基中培养15天后的试管苗进行生根培养，最适合早开堇菜幼苗生根的培养基为1/2MS + 6-BA1. 0 mg じ1。1. 5炼苗与移栽炼苗基质以珍珠岩河沙腐殖质以1: 2: 2的比例效果最好，植株成活率达100%，且植物的长势良好。通过本发明培育出来的早开堇菜繁殖系数大、适合大規模生产，能够解决该物种资源匮乏的问题，实现可持续利用；此外早开堇菜快速繁殖，短期内获得大量规格一致的苗木，能够满足园林绿化对其需求量大的要求，这对园林、医药都有重大意义。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。1. 2.1 培养基(I)培养基的配置培养基配方基本培养基(MS)添加不同种类和浓度的生长素和细胞分裂素。蔗糖浓度为25g/L，琼脂为6g/L，pH值用lmol/L的HCl或者lmol/L的NaOH调至6. 0-6. 2，使用前在121°C高压灭菌20min。(2)培养条件培养温度为(25 士 I) °C，光照强度为20-30 umol/m2 s,丛生芽诱导、增殖和愈伤组织分化培养采用每日光培养16h和暗培养8h的光周期。愈伤组织诱导、増殖采用每日黑暗培养24小时，培养7天后转入上述每日光培养12h和暗培养12h的光周期。1. 2. 2主要试剂(I)主要试剂及药品植物生长调节剂6_BA、2，4_D、NAA, IBA均购自上海生エ生物工程技术服务有限公司；基本培养基配方中所有试剂、蔗糖、琼脂粉、维生素以及消毒试剂等均为国产分析纯。1. 2. 3仪器设备(I)高压灭菌锅主要用于植物组织培养操作中的培养基及其它多种需要无菌用品的灭菌。高压灭菌锅有多种类型，通常使用的多为手提式高压灭菌锅和大型高压灭菌锅。高压灭菌时，要求的最低压カ为1.06kg/cm2，温度为121°C，灭菌时间为不少于15min,并需要根据培养基容量的増大相应地增加灭菌时间，但最高不超过30min。本发明所用的灭菌锅为 TOMY Autoclave SS-325。
(2)超净工作台超净工作台又称浄化工作台，主要用十培养材料的接种等无菌操作过程。由于它具有机动的滤菌装置，可以在工作人员与操作对象之间形成风幕，使工作台面处于基本无菌的状态。在使用超净工作台前应先用70%的酒精棉将台面及周围擦净，再用紫外灯照射30min左右对台面进行灭菌，同时启动风机把贮存于机体内的含菌空气排出。经常使用的超净工作台每隔半年左右要把滤料清洗一次，否则会因滤料附着太多的灰尘而影响正常的工作。滤料清洗后，超净工作台必须启动ー个小时后才能进行正常的无菌操作。由于从超净工作台中吹出的空气也不是绝对无菌的，因此操作时要借助于酒精灯进行无菌操作，否则难以达到完全无菌的效果。本发明所用的超净工作台型号为苏州安泰空气技术有限公司生产SW-CJ-ZFD。(3)智能人工气候箱具有光照、加湿功能的高精度冷热恒温设备。主要用于植物材料的恒温培养、光照培养以及用于愈伤组织分化和植株再生过程的培养。气候箱的温度变化范围为5-50°C (无光照)、10°C -50°C (有光照)，组织培养时的使用温度常为20-30°C。气候箱内通常有四层活动的金属网格，每层网格都可以放满培养瓶，但上下层培养物之间必须保留一定的空隙，以保证箱内空气的流动和温度的恒定。本研究所用的是宁波江南仪器厂制造的RXZ型智能人工气候箱。除了上述仪器设备以外，还用到电子天平、电炉、冰箱、容量瓶、烧杯、玻璃棒、移液管、洗耳球、量筒、酒精灯、试管、组培瓶、解剖刀、镊子、封ロ膜等。1.2.4初代培养(I)外植体的预处理和灭菌a.子叶节处理方式采收的早开堇菜新鲜种子，挑选颜色较深、子粒饱满者摆放于培养皿中，并置于25°C恒温箱中进行催芽。待胚根长出Icm左右，子叶恰好脱离种皮，此时发芽得到的幼苗，先用流水冲洗3h,然后在1. Og/1的多菌灵溶液中浸泡20分钟。冲洗干净之后的幼苗置于超净工作台上放入75%的こ醇中消毒(15s、30s、45s)后，用无菌水冲洗2次，再放入0. 1% 的升萊中消毒(4min、6min、8mim),无菌水冲洗5次，以尽可能冲洗干净残留在外植体上的消毒液，毎次2min以上，过程中不断摇晃。用无菌纱布吸干幼苗表面的水分，再用解剖刀切取整个子叶节，下胚轴留约0. 3cm,接种于基本培养基(MS)中。表1-1子叶节消毒处理结果
权利要求
1.一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于 (O早开堇菜外植体最佳灭菌方式 (1. O子叶节的消毒方式是75%乙醇消毒30s，O. 1%升汞消毒时间在4min ； (1. 2)叶片和叶柄的消毒方式是75%乙醇消毒30s、0. 1%升汞消毒Smin ； (2)初代培养 (2.1)在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的培养基为MS + 6-BA·3. Omg · L 1 + NAA O. 2 mg · L 1 ;叶柄诱导不定芽的培养基为MS + 6-BA 3. 5mg · L 1 + NAA·O. 2 mg · L 1 ; (2. 2)子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的植物生长调节剂组合为MS + 6-BA 1.5mg · L-1 + 2, 4-D1. 5 mg · L-1 ； (3)继代培养 (3.1)丛生芽和不定芽增殖的培养基为MS + 6-BA 3. 5 mg · Γ1 + NAA O. 2 mg · Γ1 ； (3. 2)三种外植体愈伤组织继代增殖培养的组合是MS + 6-ΒΑ 1.5 mg · Γ1 + 2，4_DO. 75 mg · L-1 + NAA1. O mg · L-1 ； (3. 3)早开堇菜愈伤组织分化的培养基为MS + 6-BA 3. O mg -Γ1 + NAA O. 3 mg -Γ1 ； (4)生根培养 将在不添加任何激素的MS培养基中培养15天后的试管苗进行生根培养，早开堇菜幼苗生根的培养基为1/2MS + 6-BA1. O mg · L-1 ； (5)炼苗与移栽 炼苗基质以珍珠岩河沙腐殖质以1:2:2的比例效果最好，植株成活率达100%，且植物的长势良好。
全文摘要
本发明公开了一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，(1) 早开堇菜外植体最佳灭菌方式；(2)初代培养；(3)继代培养；(4)生根培养；(5)炼苗与移栽。通过本发明培育出来的早开堇菜繁殖系数大、适合大规模生产，能够解决该物种资源匮乏的问题，实现可持续利用；此外早开堇菜快速繁殖，短期内获得大量规格一致的苗木，能够满足园林绿化对其需求量大的要求，这对园林、医药都有重大意义。
文档编号A01H4/00GK103004611SQ20131002074
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者张帆, 万雪琴, 刘敏, 钟宇, 刘光立, 张双, 罗兵, 黄金亮, 吴富雨 申请人:四川农业大学