专利名称：一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用。
背景技术：
粉蕉是香蕉的杂交栽培种，因其果型小、外型美、果皮金黄、皮薄肉白、口感嫩滑甜蜜、清香、营养丰富等特点，深受广大消费者喜爱。近十年来，粉蕉种植得到快速发展。目前，广西、广东和海南的粉蕉种植面积分别在5000、500和200公顷左右。由于枯萎病危害，粉蕉的规模化种植不仅受到严重制约，而且需要轮作。由古巴尖镰孢菌[Fusarium oxysporumf.sp.cubense (E.F.Simth) Snyder et Hansen]引起的香蕉枯萎病(也称巴拿马病)是一种毁灭性的土传真菌病害，自1910年巴拿马香蕉枯萎病大爆发至今，已给南美、非洲和亚洲的各主要香蕉种植国造成惨重损失。古巴尖镰孢菌有4个生理小种，其中，对香蕉危害性最大的是1号和4号小种，均危害粉蕉。国内外对香蕉枯萎病的防治技术作了大量研究，涉及化学防治、间作/轮作、抗病品种培育和生物防治等多个方面。由于香蕉枯萎病是土传维管束病害，病原菌从根、茎基部侵入后在维管束中侵染蔓延，所以化学防治技术几乎是无效的(NelB,ViljoenA, Steinberg C，et al.Evaluation of chem ical substances for themamagement and control ofFusarium wilt of banana[A].1n Claudine Picq, AnneVezina Eds20d Intern ationalsymposium on Fusarium wilt on banana Brazil[C].Salvador de Bahia, 2003.)。韭菜与巴西香蕉轮作可显著降低枯萎病发生率(黄永红，李春雨，左存武，等.韭菜对巴西香蕉枯萎病发生的抑制作用.中国生物防治学报，2011，27 (3):344-348).室内试验表明，韭菜叶片提取液对巴西香蕉和广粉1号粉蕉的枯萎病防控效果在75%左右(黄永红，李春雨，魏岳荣，等.韭菜对香蕉枯萎病菌的拮抗及其对盆栽香蕉枯萎病发生的抑制作用.浙江农业学报，2011，23 ￠):1162-1166)。香蕉抗枯萎病品种培育主要采用组培苗变异选择和毒素筛选两种方式。但是，选育出的抗性品种往往在产量和品质等方面都不理想(黄秉智，唐小浪，许林兵，等.香蕉抗枯萎病品种抗枯5号引种试验.中国果树，2009，6:17-19)。至今，香蕉抗枯萎病转基因育种尚未开始。因此，用绿色环保的生物防治方法来控制香蕉枯萎病越来越受到人们的重视(钟群有，郑卓辉，彭增明，等.香蕉枯萎病生物防治研究概述.广东农业科学，2007，7:64-65)。目前，国内外对香蕉枯萎病生物防治的研究刚刚起步，主要集中在对香蕉枯萎病4号小种拮抗菌的筛选、室内防治或短期田间试验方面。这些拮抗菌涉及木霉菌(ThandaveluR, Palaniswami A, Doraiswamy S，et al.The effect of Pseudomonasfluorescens andFusarium oxysporumf.sp.cubense oninduction of defenceenzymesandphenolics inbanana.Biol PI ant arum, 2003, 46 (1): 107-110)、青霉菌(王宇光,卢娟，孙建波，等.一株拮抗香蕉枯萎病的青霉菌的分离及鉴定.中国农学通报，2011，27 (04):178-182)、放线菌(茹祥，曾涛，莫坤联，等.海南吊罗山原始林区抗香蕉枯萎病土壤放线菌的分离及田间防治效果试验.中国农学通报，2012,28(13):97-102)、芽孢杆菌(付业勤，张科立，潘羡心，等.内生拮抗细菌BEB2的分子鉴定及其对香蕉枯萎病菌的抑制作用.热带作物学报，2009，30
(I):80-85)、链霉菌(林梅，张绍升.链霉菌F-1013虾壳粉发酵液对3种植物病原真菌的抑制作用.福建农林大学学报(自然科学版)，2010，39 (6):584-589)和假单孢杆菌(钟小燕，梁妙芬，甄锡壮，等.假单胞菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用.植物保护，2009，35 (I)86-89)。
发明内容
本发明的目的是提供一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用。本发明所提供的细菌具体为芽孢杆菌(Bacillus sp.)Bsp.6。该菌株已于2012年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.6459。本发明的另一个目的是提供一种菌剂。本发明所提供的菌剂的活性成分为所述芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCCN0.6459。具体的，所述菌剂为将所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC N0.6459接种到培养基中培养，得到菌体浓度为3X 104-4.5X 105cfu/mL的菌液；所述菌液的使用过程中，可根据实际需要进行稀释，调整使用浓度。在本发明的一个实施例中，所述菌剂具体为含有
3.8X 105cfu/mL 所述芽抱杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459 的菌液。所述培养基可由如下配比的原料制成:黄豆粉(黄豆籽粒粉末)、距离地面0.5-1.5米(如1.0米)的香蕉假茎、蔗糖和水的配比为5g:10g:20g:1L。进一步，所述培养基可由黄豆粉滤液、香蕉组织液、所述蔗糖和所述水按照IOOmL:IOOmL:20g:800mL 的配比混合而成，pH 为 7.0-7.2 (如 pH7.0)。所述黄豆粉滤液的制备方法具体可包括如下步骤:将所述黄豆粉与所述水按照Ig:30mL至Ig:400mL的比例混合，煮沸后过滤，获得所述黄豆粉滤液；所述煮沸的持续时间为 20-60min。在本发明的一个实施例中，所述黄豆粉与所述水的比例具体为Ig =IOOmL ;所述煮沸的持续时间具体为20min。所述香蕉组织液的制备方法具体可包括如下步骤:将所述香蕉假茎与所述水按照Ig =IOOmL至Ig:25mL的比例混合，煮沸后过滤，获得所述香蕉组织液；所述煮沸的持续时间为 20-40min。在本发明的一个实施例中，所述香蕉假茎与所述水的比例具体为Ig:50mL ;所述煮沸的持续时间具体为20min。在本发明的一个实施例中，所述培养基的制备方法具体包括如下步骤:A)所述黄豆粉滤液的制备:称所述黄豆粉5g，加入到500mL所述水(蒸馏水)中，煮沸20分钟后过滤，获得所述黄豆粉滤液(约IOOmL)；B)所述香蕉组织液的制备:取距离地面I米左右的所述香蕉假茎20g，加所述水IOOOmL,煮沸20分钟后过滤，获得滤液即为所述香蕉组织液(约200mL)。C)将IOOmL步骤A)获得的所述黄豆粉滤液、IOOmL步骤B)获得的所述香蕉组织液和20g蔗糖混合后，调整pH至7，加蒸馏水800mL，即获得所述培养基。
所述芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459，或所述的菌剂在下述a)或
b)中应用也属于本发明的保护范围:a)抑制枯萎病菌；b)防治植物枯萎病。在上述应用中，所述枯萎病菌具体可为古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense);所述枯萎病具体可为由古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense)所引起的枯萎病； 所述古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)具体可为古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I号小种和/或古巴尖键抱菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense)4号小种；所述植物可为香蕉,具体如粉蕉,更加具体如粉蕉品种广粉I号。本发明的又一个目的是提供一种利用所述菌剂防治香蕉枯萎病的方法。本发明所提供的利用所述菌剂防治香蕉枯萎病的方法具体可包括如下(I)和(2)的步骤:(I)在香蕉组培苗定植后抽出第I片新叶、第2-3片新叶、第4-5片新叶和第6_7片新叶这四个时期各施用I次所述菌剂；所述施用的浓度如下:四次所述施用的浓度均为所述菌剂浓度的1/5-1/10，如1/10 (即将所述菌剂进行10倍稀释)；所述施用的剂量如下:前三次所述施用的剂量为60_80g/株，如60g，第四次所述施用的剂量为100g-200g/株(如150g/株)；所述施用的方式如下:四次所述施用的方式均为根部灌施；(2)在香蕉苗定植大田后，待80%_90%所述香蕉苗抽出新叶后I周内，开始施用所述菌剂，直至80%-90%所述香蕉苗抽蕾后I周为止；所述施用的频率为如下(a)和(b):(a)自80%_90%所述香蕉苗抽出新叶时起，至所述香蕉苗定植大田满3个月时止，平均每月施用I次所述菌剂；(b)自所述香蕉苗定植大田第4个月时起，至80%_90%所述香蕉苗抽蕾后I周时止，平均每两个月施用I次所述菌剂；所述施用的浓度如下:所述(a)和(b)中的每次所述施用的浓度均为所述菌剂浓度的1/5-1/10，如1/10 (即将所述菌剂进行10倍稀释)；所述施用的剂量如下:所述(a)中的每次所述施用的剂量均为400g_600g/株(如500g/株)；所述(13)中的每次所述施用的剂量均为800g-1200g/株(如IOOOg/株)。所述施用的方式如下:所述(a)中的第一次所述施用的方式为根部灌施；所述(a)中的第二次及以后所述施用，和所述(b)中的每次施用的方式均为环状布施；所述环状布施为在所述香蕉中部叶片外缘垂 直对应的土壤部分施用所述菌剂。在上述方法中，步骤(I)中在香蕉组培苗定植后抽出第4-5片新叶时施用所述菌齐IJ(即第三次施用)前在距离胶杯外缘Icm处伤根I圈。在上述方法中，所述枯萎病可为由古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense)所引起的枯萎病；所述古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)具体可为古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I号小种和/或古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4号小种；所述香蕉具体可为粉蕉，更加具体的可为粉蕉品种广粉I号。在上述方法中，所述菌剂浓度的1/5-1/10为将所述菌剂原液进行5-10倍稀释。本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459能够同时抑制古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I号和4号小种。以所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC N0.6459为活性成分的菌剂能够防控粉蕉枯萎病，其大田防控效果达95%左右。本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459及其菌剂对于粉蕉枯萎病具有显著的防控效果，这将很大程度上促进香蕉种植业的快速发展。保藏说明菌种名称:芽孢杆菌
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拉丁名:(Bacillussp.)菌株编号:Bsp.6保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称:CGMCC地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期:2012年8月17日保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.6459
图1为菌株Bsp.6的对峙试验结果。其中，A为古巴尖镰孢菌(Fusantanoxysporumf.sp.cubense)l 号小种；B为菌株Bsp.6 与古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense)l 号小种的对峙；C 为古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)4号小种；D为菌株Bsp.6与古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I号小种的对峙。图2为芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459抑菌活性的检测结果。其中，1-6分别表示组1-组6。图3为芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459对香蕉枯萎病防治效果盆栽试验结果(植株存活率统计)。其中，1-6分别表示组1-组6。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。菌株:芽孢杆菌(Bacillus sp.) BEB2，即内生细菌BEB2或内生拮抗细菌BEB2:记载于“付业勤.香蕉内生细菌BEB2菌株对香蕉枯萎病的防治作用研究.海南大学硕士学位论文，2008” 一文，以及“付业勤，张科立，潘羡心等.内生拮抗细菌BEB2的分子鉴定及其对香蕉枯萎病的抑制作用.热带作物学报，2009年01期”一文中，公众可从中国热带农业科学院
海口实验站获得。古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I号小种和古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4号小种，即香蕉枯萎病菌I号和4号生理小种:记载在“曹永军，程萍，喻国辉等.香蕉枯萎病菌I号和4号生理小种在几种培养基上的生长特性.热带作物学报，2010年第08期” 一文中，公众可从中国热带农业科学院海口实验
站获得。培养基:NA培养基:牛肉 浸膏3g,酵母浸膏Ig,蛋白胨5g,葡萄糖IOg,琼脂15g,蒸懼水IOOOmL, pH7.0。PDA培养基:马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然(约6.0)。NB液体培养基:牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，pH7.2。菌株母液培养基:牛肉浸膏3g,香蕉组织液100-200mL,蛋白胨5g,蒸懼水定容至IOOOmL, pH7.0。扩大培养菌液培养基:黄豆粉2-10g，加200_400mL水，煮沸20_60分钟后过滤，取其滤液IOOmL,香蕉组织液100-200mL，蔗糖20g_40，pH值7，加蒸馏水至1000mL。其中，所述香蕉组织液的制备方法如下:取距离地面0.5-1.5米左右的香蕉假茎10-40g，加水IOOOmL,煮沸20-40分钟，过滤，保存滤液，即为香蕉组织液。实施例1、芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6的分离与鉴定一、芽抱杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6 的分离1、采用组织分离法，获取植物组织中的菌株从中国海南健康的大田粉蕉植株体上采集距地表10-15cm的根(直径0.2-0.5cm)l-2g，用自来水冲洗10-30min，再依次用体积百分比为70%的乙醇和质量百分比为3.25%的次氯酸钠消毒Imin和3min,然后用无菌水漂洗3次。将根置于研钵中,加无菌水充分研磨。静置15min后，吸上清液，进行ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—3梯度稀释。各取100 μ L稀释液，涂布于NA培养基平板，对照涂布100 μ L的第3次无菌水漂洗液。28°C培养3_5天后，挑取形态完整、差异明显的单菌落，在NA培养基平板上划线培养，获得不同类型菌株。2、抗性菌株分离( I)香蕉枯萎病病原菌划线培养取2个PDA培养基平板,分别划线接种古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense) I 号小种和古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4 号小种，28°C，培养3-5天。(2)不同类型菌株划线培养将步骤I得到的不同类型菌株分别划线接种于PDA培养基平板，28°C，培养1_2天。( 3)对崎头验检测抑囷效果从步骤(2)中培养分离得到的每个菌株的平板中挑取单菌落，分别划线接种在两个新的PDA培养基平板的一侧边缘，在相对应的另一侧放置边长3_含有病原菌菌丝的胶块(即两平板之一放置来自于步骤(I)中接种了古巴尖镰孢菌(Fusantanoxysporum f.sp.CUbenSe)l号小种培养后的PDA培养基胶块，两平板中的另一放置来自于步骤(I)中接种了古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)4号小种培养后的PDA培养基胶块)，盖上盖子，用保鲜膜封口，放入28°C条件下培养5至7天，得到对枯萎病菌-古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)l 号小种和古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)4号小种均有较强抑制作用的菌株,将其中一个菌株记作Bsp6。菌株Bsp6的对峙试验结果如图1所示。二、芽孢杆菌(Bacillus sp.) Bsp.6 的鉴定从以下几个方面鉴定步骤一分离得到的菌株Bsp.6:1、形态学鉴定对于处于对数生长期的菌株Bsp.6，经涂片染色后采用光学显微镜观察，其主要形态特征为:大小为(0.5 Ι.Ομπι) X (1.5 2.3μπι)，浅黄白色，不透明，湿润、菌体表面有褶皱，边缘不规则。2、生理生化特征分析采用常规生理生化鉴定方法对菌株Bsp.6进行鉴定，结果如表I。表1菌株Bsp.6的生理生化特征
权利要求
1.孢杆菌(Bacillussp.) Bsp.6,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.6459。
2.剂，它的活性成分为权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp.)Bsp.6CGMCCN0.6459。
3.据权利要求2所述的菌剂，其特征在于:所述菌剂为将所述芽孢杆菌(Bacillussp.) Bsp.6CGMCC N0.6459接种到培养基中培养，得到菌体浓度为3X 104-4.5X 105cfu/mL 的菌液； 所述培养基由如下原料制成:黄豆粉、距离地面0.5-1.5米的香蕉假茎、蔗糖和水的配比为 5g:10g:20g:1L。
4.据权利要求3所述的菌剂，其特征在于:所述培养基由黄豆粉滤液、香蕉组织液、所述蔗糖和所述水按照IOOmL:100mL:20g:800mL的配比混合，pH为7.(Γ7.2。
5.据权利要求4所述的菌剂，其特征在于:所述黄豆粉滤液的制备方法包括如下步骤:将所述黄豆粉与所述水按照Ig:30mL至Ig:400mL的比例混合而成，煮沸后过滤，获得所述黄豆粉滤液； 所述香蕉组织液的制备方法包括如下步骤:将所述香蕉假茎与所述水按照Ig =IOOmL至Ig:25mL的比例混合，煮沸后过滤，获得所述香蕉组织液。
6.利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp.)Bsp.6CGMCC N0.6459，或权利要求2-5中任一所述的菌剂在下述a)或b)中应用: a)抑制枯萎病菌； b)防治植物枯萎病。
7.据权利要求6所述应用，其特征在于:所述枯萎病菌为古巴尖镰孢菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense);所述枯萎病为由古巴尖键抱菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense)所引起的枯萎病；所述植物为香蕉。
8.用权利要求2-5中任一所述的菌剂防治香蕉枯萎病的方法，包括如下步骤: (1)在香蕉组培苗定植后抽出第I片新叶、第2-3片新叶、第4-5片新叶和第6-7片新叶这四个时期各施用I次所述菌剂； 所述施用的浓度如下:四次所述施用的浓度均为所述菌剂浓度的1/5-1/10 ； 所述施用的剂量如下:前三次所述施用的剂量为60-80g/株，第四次所述施用的剂量为 IOOg 200g/ 株； 所述施用的方式如下:四次所述施用的方式均为根部灌施； (2)在香蕉苗定植大田后，待80%-90%所述香蕉苗抽出新叶后I周内，开始施用所述菌齐U，直至80%-90%所述香蕉苗抽蕾后I周为止； 所述施用的频率为如下(a)和(b): Ca)自80%-90%所述香蕉苗抽出新叶时起，至所述香蕉苗定植大田3个月时止，平均每月施用I次所述菌剂； (b)自所述香蕉苗定植大田4个月时起，至80%-90%所述香蕉苗抽蕾后I周时止，平均每两个月施用I次所述菌剂； 所述施用的浓度如下 :所述(a)和(b)中的每次所述施用的浓度均为所述菌剂浓度的1/5-1/10 ；所述施用的剂量如下:所述(a)中的每次所述施用的剂量均为400g飞OOg/株；所述(b)中的每次所述施用的剂量均为IOOOg/株； 所述施用的方式如下:所述(a)中的第一次所述施用的方式为根部灌施；所述(a)中的第二次及以后所述施用，和所述(b)中的每次所述施用的方式均为环状布施；所述环状布施为在所述香蕉中部叶片外缘垂直对应的土壤部分施用所述菌剂。
9.据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述枯萎病为由古巴尖镰孢菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense)所引起的枯萎病；所述植物为香蕉。
10.据权利要求7所述 的应用，或权利要求9所述的方法，其特征在于:所述古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)为古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense) I 号小种和 / 或古巴尖键抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4 号小种。
全文摘要
本发明公开了一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用。本发明所提供的细菌具体为芽孢杆菌(Bacillus sp.)Bsp.6，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6459。实验证明，本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC No.6459能够同时抑制古巴尖镰孢菌(Fusantan oxysporumf．sp．cubense)1号和4号小种。以所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC No.6459为活性成分的菌剂能够防控粉蕉枯萎病，其大田防控效果达95%左右；本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC No.6459及其菌剂对于粉蕉枯萎病具有显著的防控效果，这将很大程度上促进香蕉种植业的快速发展。
文档编号A01P3/00GK103087956SQ20131002304
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者付业勤, 王必尊, 龙自梅, 金志强 申请人:海南业勤香蕉产业技术开发有限公司, 中国热带农业科学院海口实验站