专利名称：昆虫UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA的应用。
背景技术：
害虫严重危害我国农业生产，我国长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂，导致一系列问题:农药残留导致环境污染严重；昆虫出现抗药性，防治成本提高；有毒农药危害人类身体健康等。现在也有将生物杀虫剂应用于害虫防治，但杀虫时间较长，效果缓慢。随着社会的发展，迫切需要新型的害虫防治方法。RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类的疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2008年，Price和Gatehouse总结了众多实验结果后，提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势:1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2)抗虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。
发明内容
本发明的目的提供一种昆虫UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA在致死飞蝗中的应用。本发明提供的一 种UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，其核苷酸序列是SEQID N0:1。该序列是通过对飞蝗转录组数据库的搜索，得到I条飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因基因片段，通过序列比对后，进一步测序验证后获得。该序列长2223bp，其中可读框1455bp，编码484个氨基酸。本发明提供的一种昆虫UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO:2，是根据SEQ ID NO:1设计上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ IDNO:4，通过PCR扩增获得SEQ ID NO:2，其含有T7启动子。进一步利用PCR产物纯化试剂盒及dsRNA合成试剂盒合成dsRNA。SEQ ID NO:2合成的dsRNA的在致死飞蝗中的应用:注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明:SEQ ID NO:2合成的dsRNA可以特异性地沉默飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因(LmUAP)的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡。
图1:2龄飞蝗注射SEQ ID NO:2合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO:2合成的dsRNA。图2:5龄飞蝗注射SEQ ID NO:2合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO:2合成的dsRNA。图3:5龄飞蝗注射SEQ ID NO:2合成的dsRNA后UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因(LmUAP)的不同时间点mRNA表达，β-actin做为内参基因。12，24h为注射dsRNA后的小时数。
具体实施例方式实施例1:飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA的获得1、飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的获得I)飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因在飞蝗转录组数据库的搜索基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得I条飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因2)飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因引物的设计基于已获得LmUAP的碱基序列,采用primer premier5.0软件设计引物。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。3)飞蝗总RNA获得选取大小一致雌雄各半飞蝗5龄若虫，四头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒。`4)第一链cDNA的合成参照M-MLV反转录酶TaKaRa试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。5)飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的获得根据天根MasterMix说明书进行PCR,进一步克隆获得飞幢UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因cDNA序列。6)飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因碱基序列的分析利用Expasy网站中相关在线软件和GENED0C、基因探索者等软件分析所得序列，之后在NCBI网站中使用BLAST功能进行序列同源性比对。经序列验证后，获得的飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因(LmUAP)序列全长2223bp，开放阅读框1452bp。2、飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段及其dsRNA合成I)飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段的获得基于本研究所得到飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的序列SEQIDN0:1，采用primer premier5.0软件设计dsRNA引物，引物序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。选取大小一致雌雄各半东亚飞蝗5龄若虫，四头一组，冻存于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒。M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物进行PCR扩增，获得UDPN-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段。2)飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段dsRNA的合成用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)试剂盒对该基因片段进行纯化，试剂盒纯化后按照T7RiboMAX Express RNAi System (Promega)试剂盒说明书合成dsRNA。dsRNA浓度米用酶标仪SpectraMaxl90测定,并浓缩至终浓度为1.5 μ g/ μ L。实施例2:飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段dsRNA致死2龄飞蝗1、飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段dsRNA注射选取2龄第三天大小均一、健康状况一致的若虫用于注射上述合成的dsRNA。25 μ I规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，顺着血液流动的方向，侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，要避开气门。注射dsRNA的量为3 μ g，并设置dsGFP(3 μ g)的对照组，每组15头虫子，3个生物学重复，共计45头。注射完毕后，将虫子用IL的烧杯至于人工气候箱中进行饲养(光照:黑暗时间=14h:1Oh，温度30 ± 2 °C，湿度60 % )，给以新鲜小麦幼苗和适当的光照，喷水保持湿度。2、注入dsRNA后2龄飞蝗表型的观察2龄若虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组3天后开始蜕皮并全部成功蜕至三龄，平均蜕皮时间为15-20分钟，蜕至三龄后虫体形态活力正常。注射dsLmUAP的处理组若虫共45头，均不能完成蜕皮，最终死亡，表型如图1所示:头胸部旧表皮均能够开裂但新旧表皮无法分离，最终导致死亡。实施例3:飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段dsRNA致死5龄飞蝗1、飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段dsRNA注射选取5龄第三天大小均一、健康状况一致的若虫用于注射上述合成的dsRNA。25 μ I规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，顺着血液流动的方向，侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，要避开气门。注射dsRNA的量为10 μ g，并设置dsGFP(IOyg)的对照组，每组15头虫子，3个生物学重复，共计45头。注射完毕后，将虫子用IL的烧杯至于人工气候箱中 进行饲养(光照:黑暗时间=14h:10h，温度30±2°C，湿度60%)，给以新鲜小麦幼苗和适当的光照，喷水保持湿度。2、注入dsRNA后5龄飞蝗表型的观察5龄若虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组3天后开始蜕皮并全部成功蜕至成虫，平均蜕皮时间为15-20分钟，蜕至成虫后虫体形态活力正常。注射dsLmUAP的处理组若虫共45头，均不能完成蜕皮，最终死亡，表型如图2所示:头胸部旧表皮均能够开裂但新旧表皮无法分离，最终导致死亡。3、飞蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默检测对于5龄飞蝗若虫dsRNA注射后不同时间点的沉默效率检测，选择注射后12h和24h的整虫虫体作为RNA提取对象，每组各个时间点设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成第一链cDNA，用RT-PCR检测目的基因(LmUAP)和管家基因(β -actin)的表达量(图3)。
SEQUENCE LISTING
<110>山西大学
<120>昆虫UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA的应用
<130〉2010
<160〉4
<170〉Patentln version 3.5
<210> I<211> 1452<212> DNA
<213> Locusta migratoria<400> I
atgctggaca tcggcaaatg caagcaagaa ctaacgaaat atgggcagca gcatttgttg60
cggttttggg atgagctgtc agaagaggag agagcagaat tattgctgga tttacaagaa120
gtcaacgtgg cagaagttac ttcatatttc agaagagctg tagagtccct cactgaagatISO
caagcaaaac tggatgatcg tatgaagcct attccagcag aattttatgg tggtgtcatc240
agatcagaag cagaagatct aagattttat gaagaagaag gtttgaggca gatttctgcaUU
ggcaaagtgg gtgtgctgct tctagccggt ggtcagggca cgagactcgg agtatcgtat350
cccaaaggta tgtatgatgt tggcctacct tctcataagt ctctgtatca ggttcaggca420
gagagaattc tgagactgca ggagcttgct tgtgaacgaa.caggagttta.caatcatata 480
acgtggtata ttatgaccag tgaagcaact atgtgcccca ctcaggaata ttttgcaaac540
cacaactatt ttggtcttaa aaaagaaaat attgttatgt ttgaacaagg gttgcttcca600
权利要求
1.一种昆虫m)P-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID N0:1。
2.一种昆虫Μ)Ρ-Ν-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段，其核苷酸序列是SEQ IDNO:2。
3.按权利要求2所述的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段的获得，是根据SEQ ID NO:1设计上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得，所述上游引物的核苷酸序列是SEQ ID NO:3，下游引物的核苷酸序列是SEQ ID NO:4。
4.按权利要求2所述的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因片段合成的dsRNA。
5.按权利要求4所述的dsRN A在致死飞蝗中的应用。
全文摘要
本发明提供一种昆虫UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因(UAP)及其dsRNA的应用，它可沉默特定的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因使昆虫死亡。对飞蝗的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO1的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因；然后选择序列为SEQ ID NO2的该基因片段，用于双链RNA(dsRNA)的合成。该基因dsRNA注入昆虫的体腔后，昆虫的生长过程中表现为发育迟缓，蜕皮时无法顺利蜕出，最终导致死亡。本发明为基于RNA干扰的飞蝗防治提供新的靶标。
文档编号A01P7/04GK103088040SQ20131002338
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者郭亚平, 李峰, 刘晓健, 张建珍, 马恩波 申请人:山西大学