专利名称：一种筛选耐旱性转基因玉米的方法
技术领域：
本发明属于作物遗传育种领域，具体地说，涉及一种筛选耐旱性转基因玉米的方法。
背景技术：
干旱一直是影响作物生产的主要灾害之一，每年不同程度发生的旱灾使我国经济特别是农业生产蒙受了巨大损失。统计表明，从1950年至今，全国平均每年受旱面积达2200万公顷，严重成灾900万公顷，因干旱直接减收粮食100亿公斤以上，约占各种自然灾害造成粮食损失的60%。玉米是我国的第二大粮食作物，种植面积约为2400万公顷，50%以上种植在西北、西南、华北、东北地区依靠自然降水、缺水的旱地上。这些地区年降水量在200 600mm不等，有些地方蒸发量大，水分流失快、且降水变率很大，玉米生长发育对水分的需要满足率较低，严重影响玉米生产，造成产量低、年际间不稳定。对玉米带地区气象资料和玉米产量的相关分析得出，干旱是导致我国玉米产量波动的主要原因，农业水资源短缺和土壤贫瘠已成为提高玉米生产力的主要限制因素。我国70%以上的玉米经常遭受干旱威胁，每年因此造成的产量损失在1500万吨以上。要从根本上解决这一问题，一方面要加强对有限水资源的合理开发利用，另一方面要从农作物种质改良入手，培育筛选具有耐旱丰产的农作物品种。由此可见，筛选创新耐旱的玉米种质和培育抗旱节水的玉米品种已成为保障我国粮食安全和解决“三农”问题的重大需求。
20世纪90年代以来，作物育种已进入生物技术与常规技术有机结合的第三次突破阶段。以分子标记、转基因技术为核心的现代分子育种技术大幅提升了育种的效率和准确性，常规育种需要7-8代才能选出的育种材料，现代技术能将其缩短到2-3代，育种周期缩短为原来的1/4-1/3，实现了快速、定向、高效培育系统改良的作物新品种。除了能显著提高育种效率外，转基因技术与常规技术结合，在提高农产品产量、突破资源约束、缓解生态恶化等方面也正在发挥重要作用。近10年来我国的玉米生产出现了单产增长变缓的情况，加上全球气候变化的影响，玉米育种进入了爬坡阶段。综合运用各种先进育种技术，进行产量、抗病虫、抗逆、养分高效利用等相关性状的协调改良，是未来玉米育种领域发展的主要方向，也是突破玉米育种技术瓶颈的重要选择。现代生物技术能够实现抗逆基因的定向定位转移，在常规技术短期内难以解决的性状协调改良等方面显示了巨大的优势，把转基因技术与常规育种技术结合起来，将有效引领玉米育种领域的科技进步。大量研究表明，玉米抗旱育种是提高品种的抗旱性、减少干旱带来的损失的有效途径。抗旱育种的基本前提是需要有过硬的抗旱种质资源。然而，玉米抗旱性的常规改良比较困难。因为即使在环境条件好的情况下，产量的遗传力也较低，水分供应的不确定性使得产量遗传力更低了 ；同时，很多研究已经证明抗旱性的遗传机制相当复杂，是由数量性状位点QTL控制的(Ribaut等，1996a)。现代分子生物学的发展，为玉米抗旱育种提供了新的方法和思路。分子标记辅助选择和转基因技术为解决玉米的抗旱性问题提供新的技术手段，而转基因技术和常规育种方法有机结合在一起，为玉米抗旱育种提供一种全新的技术方案。近年来，科学家们利用分子生物学手段，对玉米抗旱性进行了比较深入的遗传剖析(Tuberosa等，2002; Ribaut等，2004)，鉴定出了大量抗旱相关性状的数量性状位点(QTL)。同时，科学家应用功能基因组学技术和方法不仅在模式植物(拟南芥)中成功找到了大量与干旱胁迫下表达的基因(Seki等，2002)，而且在玉米中也鉴定出了不少与抗旱性相关的候选基因(Riccardi 等，1998; Zinselmeier 等，2002; Yu 和 Setter2003; Zheng 等，2004),现已通过遗传工程技术提取出了抗旱主效基因，通过转基因技术导入到玉米植株中，创制出了有重要育种应用价值的抗旱转基因玉米新材料并应用于转基因玉米抗旱育种中。对转基因玉米进行耐旱性鉴定，是评价和选育耐旱性转基因玉米新种质的关键步骤。目前，国内外对转基因玉米耐旱性筛选和鉴定方法的研究还少有报导，采用的具体方法主要有室内发芽鉴定法、盆栽鉴定法等，采用的指标也大多为生理指标，但干旱对玉米所造成的危害涉及玉米生长发育的各个阶段，最终都以产量下降为表现，鉴定方法中各种指标的优劣都应该以产量为基准。目前还没有较为理想的对于转基因玉米的耐旱性的鉴定方法及筛选方法，因此，亟需加强这方面的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选耐旱性转基因玉米的方法。为了实现本发明目的，本发明的一种筛选耐旱性转基因玉米的方法，包括以下步骤1)待测转基因玉米及受体种子播种；2)待测转基因玉米及受体植株定苗；3)待测转基因玉米及受体植株干旱胁迫与正 常水分处理；4)待测转基因玉米及受体形态指标检测；5)待测转基因玉米及受体产量指标检测；6)待测转基因玉米耐旱能力评价；7)选择具有耐旱性的转基因玉米。前述的方法，步骤I)中所述受体种子为非转基因受体对照种子。前述的方法，步骤I)中采用的播种条件为年自然降水少于150mm的地区陆地播种，或年自然降水大于150mm的地区旱棚内播种，每种材料种植一小区，每小区12m2，随机区组排列，三次重复，播种密度与大田相同，为每公顷60000-67500株。前述的方法，步骤3)中所述待测转基因玉米及受体植株干旱胁迫处理(旱地)，具体为播种前浇底墒水，使0-50cm 土层水分达到田间持水量的80%±5%，在拔节期浇水后停水，开花和吐丝后再在灌浆期浇两水。所述待测转基因玉米及受体植株正常水分处理(水地)，具体为分别在播种前、拔节期、开花期和灌浆期灌水，除开花期外灌水量与胁迫处理相同，在降水量较多的年份酌情适当减少灌溉次数和灌水量。前述的方法，步骤6)中对待测转基因玉米进行耐旱能力评价，通过公式(I)计算得出待测转基因玉米耐旱指数DI= (GYS.T/GYS.W) · (GYm.w/GYm.t) 公式(I)其中，GYs. τ :待测材料旱地籽粒产量；GYs.w :待测材料水地籽粒产量；GYm.w :所有材料水地平均籽粒产量；GYm. t :所有材料旱地平均籽粒产量；通过公式(II)计算得出待测转基因玉米耐旱性提高系数
DR=DI转基因材料/DI受体公式(II)其中，D1:待测转基因玉米材料耐旱指数；DI受体:转基因玉米受体耐旱指数；依据待测转基因玉米耐旱性提高系数进行分级，分级标准为DR ( 1，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高O级，耐旱性无提高；1. 01 < DR <1. 25，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高I级，耐旱性小幅提高；1. 26 < DR <1. 5，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高2级，耐旱性提高中等；1. 51 < DR <1. 75，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高3级，耐旱性明显提高；1. 76 < DR < 2，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高4级，耐旱性显著提高；DR > 2. 01，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高5级，耐旱性大巾畐提闻。本发明方法以待测转基因玉米及受体植株为对象，采用拔节后开花期分别自然干旱胁迫处理和正常水分灌溉一定时间后，检测与耐旱性显著相关的形态和产量指标，进行数据处理后，根据数值来评价转基因玉米耐旱能力，以达到建立一个客观准确的转基因玉米耐旱性评价方法的目的，并可进一步作为玉米耐旱性筛选和鉴定方法研究的参考。相对于现有技术，本发明至少具有下列优点及有益效果(一)适应范围广 本发明的一种筛选耐旱性转基因玉米的方法除适用于筛选具有耐旱性的转基因玉米外，也适用于筛选具有耐旱性的普通玉米种质。(二)评价标准数值化，更客观准确在筛选耐旱性转基因玉米的过程中，转基因玉米的耐旱性比受体玉米的耐旱性提高或是降低因不能量化无法进行准确评价。本发明利用转基因玉米及受体玉米开花期干旱胁迫后与抗旱性高度相关的形态和产量指标的变化，建立了转基因玉米耐旱性评价体系，能够更客观的反映转基因玉米比受体耐旱性提高的程度。(三)本发明方法易于掌握，重复性高本发明使用转基因玉米成株作为评价筛选对象，试验材料容易获得，一次可同时评价大量转基因植株，操作方法易于掌握，重复性高。
图1为本发明较佳实施例筛选耐旱性转基因玉米的工艺流程图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例筛选耐旱性转基因玉米的方法1.试验材料7份非转基因玉米受体常规自交系，54份转基因玉米材料。其中转L0S5基因的5个转基因系材料及I个受体，由中国农业大学提供；RABP9基因的8个转基因系材料及I个受体，由中国农业科学院生物技术研究所提供；转TsVPI基因的20个转基因系材料及2个受体、转betA基因的17个转基因系材料及2个受体，由山东大学提供；转CBL、PLD2基因的4个转基因系材料及I个受体，由中国农业科学院作物科学研究所提供(表I)。2.试验方法参阅图1，筛选具有耐旱性的转基因玉米的方法，具体如下2.1玉米种子选择精选需要鉴定的发育良好的转基因玉米种子和非转基因玉米受体对照种子，各供试种子要求饱满一致。2. 2转基因玉米及受体播种在年自然降水少于150mm的地区陆地播种或年自然降水大于150mm的地区旱棚内播种，每种材料种植一小区，每小区12m2，随机区组排列，三次重复，播种密度度每公顷60000-67500 株。2. 3转基因玉米及受体干旱胁迫处理和正常水分处理干旱胁迫处理(旱地)播种前烧底墒水，使0_50cm 土层水分达到田间持水量的80%±5%，在拔节期浇水后停水，开花和吐丝后再在灌浆期浇两水。正常水分处理( 水地)分别在播种前、拔节期、开花期和灌浆期灌水，除开花期外灌水量与胁迫处理相同，在降水量较多的年份酌情适当减少灌溉次数和灌水量。2. 4转基因玉米及受体指标检测处理时期测定所有供试材料开花至吐丝天数，收获时测定收获株数和收获穗数，收获后测定小区籽粒产量。2. 5转基因玉米耐旱能力评价计算转基因玉米及受体耐旱指数DI= (GYS.T/GYS.W) · (GYm.W/GYM.τ)式中，GYs.τ是待测材料旱地籽粒产量；GYS.W是待测材料水地籽粒产量；GYm.w是所有材料水地平均籽粒产量；gym.t是所有材料旱地平均籽粒产量；计算转基因玉米耐旱性提高系数DR=DI _h_/DI受体式中，DI 是待测转基因玉米材料耐旱指数；DIS#是转基因玉米受体耐旱指数；依据转基因玉米耐旱性提高系数进行分级，分级标准为DR< 1，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高O级，耐旱性无提高；1.01 <DR<1. 25，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高I级，耐旱性小幅提高；1. 26 < DR <1. 5，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高2级，耐旱性提高中等；1. 51 <DR<1. 75，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高3级，耐旱性明显提高；1. 76 < DR < 2，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高4级，耐旱性显著提高；DR> 2. 01，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高5级，耐旱性大幅提高。2. 6根据2. 5中所述的分级标准对供试的转基因玉米进行分级，根据需要选择耐旱性显著和大幅提高的转基因玉米。3.结果与分析从表I中可以看出，依据此分级标准，在54份供试转基因材料中，耐旱性比受体提闻O级的材料有2份,提闻I级的材料有9份,提闻2级的材料有16份,提闻3级的材料有4份，提闻4级的材料有2份,提闻5级的材料有21份。其中转基因玉米比受:体耐旱性提闻的材料52份，占所有供试材料的96%，耐旱性显著提高(4级以上)的材料有23份，占所有供试材料的43%。
依据表I分级结果，根据需要选择耐旱性显著提高和大幅提高的转基因玉米材料进行转育，用于培育抗旱转基因玉米新品种。表154份供试转基因玉米耐旱性鉴定评价结果及耐旱性提高分级结果
权利要求
1.一种筛选耐旱性转基因玉米的方法，其特征在于，包括以下步骤1)待测转基因玉米及受体种子播种；2)待测转基因玉米及受体植株定苗；3)待测转基因玉米及受体植株干旱胁迫与正常水分处理；4)待测转基因玉米及受体形态指标检测；5)待测转基因玉米及受体产量指标检测；6)待测转基因玉米耐旱能力评价；7)选择具有耐旱性的转基因玉米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述受体种子为非转基因受体对照种子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中采用的播种条件为年自然降水少于150mm的地区陆地播种，或年自然降水大于150mm的地区旱棚内播种，每种材料种植一小区,每小区12m2，随机区组排列，三次重复，播种密度每公顷60000-67500株。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述待测转基因玉米及受体植株干旱胁迫处理，具体为播种前浇底墒水，使0-50cm 土层水分达到田间持水量的80%± 5%，在拔节期浇水后停水，开花和吐丝后再在灌浆期浇两水； 所述待测转基因玉米及受体植株正常水分处理，具体为分别在播种前、拔节期、开花期和灌浆期灌水，除开花期外灌水量与胁迫处理相同，在降水量较多的年份酌情适当减少灌溉次数和灌水量。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中对待测转基因玉米进行耐旱能力评价，通过公式(I)计算得出待测转基因玉米耐旱指数DI= (GYS.T/GYS.W) · (GYm.w/GYm.t)公式(I) 其中， GYs.τ :待测材料经干旱胁迫处理后的籽粒产量； GYs. :待测材料经正常水分处理后的籽粒产量； GYm.w :所有材料经正常水分处理后的平均籽粒产量； GYm.τ :所有材料经干旱胁迫处理后的平均籽粒产量； 通过公式(II)计算得出待测转基因玉米耐旱性提高系数 DR=DI转基因材料/DI受体公式(II) 其中， D1:待测转基因玉米材料耐旱指数； DI受# :转基因玉米受体耐旱指数； 依据待测转基因玉米耐旱性提高系数进行分级，分级标准为DR< 1，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高O级，耐旱性无提高；1. 01 < DR <1. 25，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高I级，耐旱性小幅提高；1. 26 < DR <1. 5，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高2级，耐旱性提高中等；1. 51 < DR <1. 75，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高3级，耐旱性明显提高；1. 76 < DR < 2，则待测转基因玉米比受体玉米耐旱性提高4级，耐旱性显著提高；DR > 2. 01，则转基因玉米比受体玉米耐旱性提高5级，耐旱性大幅提闻。
全文摘要
本发明提供了一种筛选耐旱性转基因玉米的方法，包括以下步骤1)待测转基因玉米及受体种子播种；2)待测转基因玉米及受体植株定苗；3)待测转基因玉米及受体植株干旱胁迫与正常水分处理；4)待测转基因玉米及受体形态指标检测；5)待测转基因玉米及受体产量指标检测；6)待测转基因玉米耐旱能力评价；7)选择具有耐旱性的转基因玉米。本发明方法建立了一个适合转基因玉米成株期耐旱性评价的方法，该体系以转基因玉米成株及受体为检测对象，在转基因玉米及受体开花期干旱胁迫处理，通过对植株形态指标和产量指标的检测，达到建立一个客观准确的转基因玉米耐旱性评价方法的目的，从而为耐旱性转基因玉米的筛选提供可靠的依据。
文档编号A01H1/04GK103053411SQ201310036610
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者孙宝成, 刘成, 王天宇, 黎裕, 石云素, 宋燕春, 唐怀军, 张登峰 申请人:新疆农业科学院粮食作物研究所, 中国农业科学院作物科学研究所